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摘要 [目的]筛选出具有防除枇杷INA细菌的拮抗菌。[方法]从枇杷根际土壤中分离冰核细菌拮抗菌，对其进行抑菌圈、杀菌能力、破坏冰核活性蛋白能力测定。[结果]从不同海拔地区的根际土壤中共分离得到128个菌株，其中有拮抗效果的有55株，平皿拮抗效果强的有15株，再经拮抗系数比较得到9株强拮抗菌菌株，最后筛选出1株杀菌率达98%、破坏冰核蛋白能力达100%的拮抗菌BL36。[结论]BL36既有杀菌效果又有破坏冰核蛋白能力，是具有较好利用前景的防除诱发枇杷霜冻害冰核细菌、减轻枇杷霜冻害的生物防治材料。
关键词 枇杷；拮抗菌；冰核细菌；抑菌圈法；杀菌能力；破坏冰核蛋白能力
中图分类号 S432.4+2 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）20-168-03
Abstract [Objective] The aim was to screen out antagonistic bacteria to control ice nucleation active bacteria （INA） which induced loquat frost. [Method] INA antagonistic bacteria was screened out from rhizosphere soil of loquat， and then inhibition zone， inhibition ability and the damage of ice nucleation active protein were determined. [Result] Results showed that 128 strains were isolated from the rhizosphere soil at different altitudes， among 55 strains had antagonistic effect， 15 strains had strong antagonistic effect. Then through the comparison of antagonistic coefficient， 9 strains with strong antagonistic bacteria were acquired. One strain of antagonistic bacterium named BL36 was screened out finally； its bactericidal rate reached 98%， and the damage of ice nucleation active protein reached 100%. [Conclusion] BL36 had both bactericidal effect and damage of ice nucleation active protein， and was a biological control of materials which could control INA and reduce loquat frost， so it had a good utilization prospect.
Key words Loquat； Antagonistic bacteria； INA； Inhibition zone method； Bactericidal effect； Damage of ice nucleation active protein
枇杷是原产我国的一种兼具营养和保健功效的水果。枇杷秋花冬果，在福建省闽中地区其幼果期适逢一年中最冷的月份，一场霜冻害能在短短的几个小时内造成大面积减产甚至绝收[1-4]。长期以来，人们一直认为霜冻仅是低温对植物胁迫作用所造成的危害，王慧等指出冰核细菌（简称INA细菌）是诱发枇杷幼果冻害的主要因素[5]。冰核细菌能够破坏水的过冷却状态，在-3.0～-1.0 ℃诱发植物细胞间水结冰而发生霜冻[6-12]。国内外学者已开始从自然界植物体上的多种微生物中筛选对INA细菌有拮抗作用、营养竞争能力强、抑杀或寄生性强的微生物菌株，对其进行了人工生产繁殖，再噴洒在植物体上，以期控制或杀灭INA 细菌，达到防御霜冻的目的[13-16]。Lindow 从玉米上分离到一种M232A 拮抗菌，处理霜冻指数比对照降低了30.8，处理株高为1.5 m的田间玉米，当发生气温为-2.5～-1.5 ℃的霜冻时，处理霜冻指数为0.8，而对照霜冻指数高达2.1，防效十分显著[17]。目前关于分离拮抗菌防除冰核细菌减轻霜冻害的研究已有较多报道，但在枇杷上尚属空白。鉴于此，笔者从枇杷根际土壤中分离冰核细菌拮抗菌，采用抑菌圈测定、杀菌能力测定、破坏冰核活性蛋白能力测定等方法筛选具有防除枇杷INA细菌的拮抗菌，旨在为降低由冰核细菌诱发的枇杷霜冻害提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌种。INA细菌L4菌株分离自福建省莆田市钟山镇霜冻害发生区的田间枇杷花瓣上，经检测具有冰核活性菌株。
1.1.2 培养基。KB培养基配方见文献[2]；PSA培养基配方见文献[18]。
1.2 方法
1.2.1 拮抗菌分离。
1.2.1.1 取样。选择高海拔地区莆田仙游县（660 m）、福州晋安区（550、400 m），中海拔地区莆田荔城区（250 m）、莆田城厢区（350 m），低海拔地区莆田涵江区（50、100 m）、福州鼓楼区（10 m）、浙江德清县（100 m）霜冻害发生频繁的枇杷产区，在枇杷不同部位及根围土壤中取样。
1.2.1.2 样品处理。取1.0 g根围土或1.0 g新鲜叶片或叶芽磨碎加入9.0 ml无菌水于三角瓶中，振荡10 min，稀释至梯度浓度为1×10-5、1×10-6、1×10-7 g/ml，分别取0.1 ml各浓度稀释液均匀涂抹于PSA培养基上，在22 ℃下培养36 h，挑选所有不同特征菌落，点接于混有INA细菌L4的KB平板上。测定抑菌圈半径，3次重复。 1.2.2 抑菌圈测定。
取0.2 ml 3.0×108cfu/ml INA细菌L4菌液放入培养皿内，对孙福在等的抑菌圈法进行改进[19]，测量抑菌圈、菌落、抑菌带半径，观察透明度等，重复3次。
1.2.3 杀灭INA细菌能力测定。
复筛的9个菌株分别在PSA斜面培养基上28 ℃培养36 h，INAL4细菌在KB斜面培养基上22 ℃培养36 h，备用。将培养好的拮抗菌和INA细菌配成浓度均为3.0×108cfu/ml的菌液，各取5.0 ml菌液配制成混合液。将混合液放入4 ℃冰箱中[5]，5 h后各取1.0 ml混合液按照1∶1×105、1∶1×106、1∶1×107的比例稀释，各取0.2 ml稀释液于KB培养基上培养，并设INA细菌原液为对照，重复3皿，在22 ℃下培养3 d，观察记录冰核细菌的菌落数量。处理完毕后，立即放入4 ℃冰箱中24 h，再测定冰核细菌的菌落数量。
1.2.4 破坏冰核蛋白能力测定。
采用Lindow等改进的小液滴冻结法测定冰核活性[8]。配制混合液方法同“1.2.3”。用微量加样器吸取0.2 ml细菌悬浮液，滴加到-5.0 ℃的测试表面上，每滴0.1 ml，每种菌液滴10滴，重复2次。以无菌水和INA细菌L4 3.0×108 cfu/ml作对照。用低温恒温槽测定冻滴数。在2 min内记下冻滴数，换算成冻滴率和破坏率。探针验证小液滴是否冻结以第1次结果为准。
冻滴率=冻结个数/试验总个数×100%
破坏率=不冻结个数/试验总个数×100%
2 结果与分析
2.1 分离到的菌株对INA细菌的抑菌能力测定
从9个不同地区和海拔的枇杷根际土样、枇杷不同部位上分离纯化128个菌株。发现55个菌株对INA有抑菌效果。对INA细菌有抑菌效果的55个菌株中，抑菌圈半徑大于10 cm的有15株，占11.7%；抑菌圈半径大于5 cm且小于10 cm的有22株，占17.2%；抑菌圈半径大于0且小于5 cm的有18株，占14.0%。没有拮抗作用的菌株有73株，占57.0%。拮抗菌株获得率为43.0%。具拮抗能力的55个菌株中，强菌株占27.3%，中强菌株占40.0%，弱菌株占32.7%。根据拮抗菌抑菌圈半径大、增殖速度快、抑菌带清晰程度等特点要求，最终确定了9个菌株作为复筛试验对象，分别为BL36、BL27、BL33、BL30、BL43、BL28、BL31、BL35和BL38。
2.2 拮抗菌对INA细菌抑菌作用比较
INA细菌与抑菌带接触的菌落边缘厚，而对照INA细菌生长正常，菌落铺展整个平板，说明这些拮抗菌产生的拮抗物质对INA菌落的扩展均具有较强的抑制作用。由表2可知，BL36拮抗系数达1.28，抑菌圈半径为27.2 mm，抑菌带宽度为6.0 mm，表现都是最佳，抑菌效果好于其他8个拮抗菌，达到极显著水平。BL43、BL35等6个拮抗菌的拮抗系数没有差异，但抑菌圈半径、抑菌圈宽度、拮抗菌半径之间差异大，无法直接进行利用。
2.3 不同拮抗菌对枇杷INA细菌的杀菌作用
9个拮抗菌与枇杷INA细菌L4按照1∶1的比例混合后，在4 ℃冰箱中处理5 h后，BL33对INA细菌的杀菌率达到98.5%，BL36的杀菌率达到98.0%，杀菌效果较好。处理24 h后，BL33、BL36的杀菌率达100%；拮抗菌BL36、BL33的杀菌效果好于其他7个拮抗菌，差异达到极显著水平。由表2和表3综合分析得出：第一，INA拮抗菌对INA细菌的杀菌作用与产生的抑菌圈大小无关。如菌株BL27等，抑菌圈较大但对INA细菌的杀菌作用与其他的拮抗菌比较却相对较弱。第二，BL38、BL28等4个拮抗菌的杀菌效果随着时间的延长，杀菌率反而下降，该4个菌株的杀菌有效期短。其三，除了BL33、BL36的杀菌率达100%外，其他7个拮抗菌杀菌都不彻底，不能直接应用。综上所述，拮抗菌BL36、BL33是杀灭冰核活性细菌良好的生物防治菌株。
2.4 不同拮抗菌破坏枇杷INA细菌冰核活性结果
对放置5和24 h的混合液于-5 ℃下测定冻滴率。由表4可知，处理5 h后，9个拮抗菌菌株与INA细菌的混合液都有不同程度的冻结现象，其中，BL36的冻滴率为20%，破坏率为80%，效果最佳；BL33、BL38 等4个菌株的冻滴率为40%，破坏率为60%；拮抗菌的破坏率达50%以上。24 h后，BL36、BL33的冻滴率均为10%，破坏率为90%；BL36、BL33等3个拮抗菌对冰核蛋白的破坏率随着时间的延长而提高。BL31、BL35破坏冰核蛋白能力均随着时间的延长而有所下降。综上所述，BL36在5和24 h的破坏能力都是最好的。
3 结论与讨论
针对诱发枇杷霜冻害的冰核细菌，从枇杷根际土壤分离到55个拮抗菌，说明自然界普遍存在着INA细菌拮抗菌。根据增殖速度快、抑菌带宽且清晰程度高的拮抗菌株筛选要求，选出BL36、BL33、BL27等9个强拮抗菌菌株。对INA细菌杀菌能力测定发现处理5和24 h后，BL36的杀菌能力较好且稳定；用VaLi法测定破坏冰核蛋白能力发现BL36在5和24 h破坏冰核活性能力都是最好， BL33次之。拮抗菌BL36在争夺生存空间和营养、杀灭冰核活性细菌、降低冰核蛋白数量3个方面综合效果最佳。
拮抗菌对INA细菌主要通过争夺生存空间和营养来抑制冰核细菌的数量，相应降低冰蛋白的数量来达到抑菌防御霜冻的目的，由于生防菌增殖和扩展要有一个过程，因此在实际生产中，应与药剂复配使用，才能更好地防除冰核细菌，减轻枇杷霜冻害。
参考文献
[1] 翁志辉.浅析福建省枇杷幼果的冻害情况及预防与补救措施[J].福建农业科技，2005（1）：16-18. [2] 孙福在，韦建福.我国冰核活性细菌的优势种类调查与研究[J].生态学报， 1996，16（6）： 618-623.
[3] 孙福在，何礼远.冰核细菌与植物霜冻研究概况[J].植物保护，1989，15（4）：41-43.
[4] LINDOW S E，HIRANO S S，BARCHET W R，et al.Relationship between ice nucl eation frequen cy of bacteria and frost injury[J]. Plant Physiolo，1982，70：1090-1093.
[5] 王慧，彭建平，方树民，等.枇杷幼果中定殖的冰核细菌与冻害关系[J].植物保护，2008，34（2）：43-46.
[6] 朱红，孙福在，何礼远.诱发农作物霜冻害的冰核细菌冰核活性研究[C]//首届全国中青所植物学术讨论会优秀论文集.北京：中国科学技术出版社，1991：191-197.
[7] MAKI LR ，GALYON E L，CHANG CHIEN M.Ice nucleation induced by pseudomonas syringae[J].Appl Microbiol，1974，28（3）：456-460.
[8] LINDOW S E，AMY D C，UPPER C D.Erwinia herbicola：A bacterial ice nucleus active in increasing frost injury to corn[J].Phytopathology，1978，68：523-527.
[9] BURKE M J，LINDOW S E.Surface properties and size for the ice nucleation site in ice nucleation active bacteria：Theoretical considerations[J].Cryobiology，1990，27：80-84.
[10] BIGG E K.The supercooling of water[J].Proc Soc，1953，66：686-694.
[11] 高橋幸吉.冰核活性细菌の研究现状と实用化[J].冷冻（日），1987，62：883-890.
[12] 孙福在，朱红，何礼远.影响冰核菌成冰核活性的因素研究[J].中国农业科学，1991，24（3）：57-64.
[13] 孙福在，朱红，何礼远.药剂防治玉米霜冻的初步研究[J].黑龙江农业科学，1991（3）： 24-29.
[14] 刘耕春，王万立，郝永娟，等.冰核细菌防治技术初步研究[J].天津轻工业学院学报，2000（12）：47-51.
[15] 岳思君，王文举.冰核细菌研究进展及其在防霜技术中的应用[J].农业科学研究， 2005，26（2）：66-70.
[16] 孙福在，赵廷昌.几种生防菌防治植物细菌性病害和霜冻的效果测定[J].中国微生态学杂志，1998，10（S1）：17-21.
[17] LINDOW S E.Erwinia herbicola：A bacteria ice nucleus active in increasing frost injury to corn[J]. Phytopathology，1978，68：523-527.
[18] 方中达.植病研究方法[M].3版.北京：中国农业出版社，2007：46.
[19] 孙福在，赵廷昌，牟丰盛，等.生防菌和药剂除冰核细菌防御玉米霜冻研究[J].自然灾害学报，2003，12（4）：115-119.
关键词 枇杷；拮抗菌；冰核细菌；抑菌圈法；杀菌能力；破坏冰核蛋白能力
中图分类号 S432.4+2 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）20-168-03
Abstract [Objective] The aim was to screen out antagonistic bacteria to control ice nucleation active bacteria （INA） which induced loquat frost. [Method] INA antagonistic bacteria was screened out from rhizosphere soil of loquat， and then inhibition zone， inhibition ability and the damage of ice nucleation active protein were determined. [Result] Results showed that 128 strains were isolated from the rhizosphere soil at different altitudes， among 55 strains had antagonistic effect， 15 strains had strong antagonistic effect. Then through the comparison of antagonistic coefficient， 9 strains with strong antagonistic bacteria were acquired. One strain of antagonistic bacterium named BL36 was screened out finally； its bactericidal rate reached 98%， and the damage of ice nucleation active protein reached 100%. [Conclusion] BL36 had both bactericidal effect and damage of ice nucleation active protein， and was a biological control of materials which could control INA and reduce loquat frost， so it had a good utilization prospect.
Key words Loquat； Antagonistic bacteria； INA； Inhibition zone method； Bactericidal effect； Damage of ice nucleation active protein
枇杷是原产我国的一种兼具营养和保健功效的水果。枇杷秋花冬果，在福建省闽中地区其幼果期适逢一年中最冷的月份，一场霜冻害能在短短的几个小时内造成大面积减产甚至绝收[1-4]。长期以来，人们一直认为霜冻仅是低温对植物胁迫作用所造成的危害，王慧等指出冰核细菌（简称INA细菌）是诱发枇杷幼果冻害的主要因素[5]。冰核细菌能够破坏水的过冷却状态，在-3.0～-1.0 ℃诱发植物细胞间水结冰而发生霜冻[6-12]。国内外学者已开始从自然界植物体上的多种微生物中筛选对INA细菌有拮抗作用、营养竞争能力强、抑杀或寄生性强的微生物菌株，对其进行了人工生产繁殖，再噴洒在植物体上，以期控制或杀灭INA 细菌，达到防御霜冻的目的[13-16]。Lindow 从玉米上分离到一种M232A 拮抗菌，处理霜冻指数比对照降低了30.8，处理株高为1.5 m的田间玉米，当发生气温为-2.5～-1.5 ℃的霜冻时，处理霜冻指数为0.8，而对照霜冻指数高达2.1，防效十分显著[17]。目前关于分离拮抗菌防除冰核细菌减轻霜冻害的研究已有较多报道，但在枇杷上尚属空白。鉴于此，笔者从枇杷根际土壤中分离冰核细菌拮抗菌，采用抑菌圈测定、杀菌能力测定、破坏冰核活性蛋白能力测定等方法筛选具有防除枇杷INA细菌的拮抗菌，旨在为降低由冰核细菌诱发的枇杷霜冻害提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌种。INA细菌L4菌株分离自福建省莆田市钟山镇霜冻害发生区的田间枇杷花瓣上，经检测具有冰核活性菌株。
1.1.2 培养基。KB培养基配方见文献[2]；PSA培养基配方见文献[18]。
1.2 方法
1.2.1 拮抗菌分离。
1.2.1.1 取样。选择高海拔地区莆田仙游县（660 m）、福州晋安区（550、400 m），中海拔地区莆田荔城区（250 m）、莆田城厢区（350 m），低海拔地区莆田涵江区（50、100 m）、福州鼓楼区（10 m）、浙江德清县（100 m）霜冻害发生频繁的枇杷产区，在枇杷不同部位及根围土壤中取样。
1.2.1.2 样品处理。取1.0 g根围土或1.0 g新鲜叶片或叶芽磨碎加入9.0 ml无菌水于三角瓶中，振荡10 min，稀释至梯度浓度为1×10-5、1×10-6、1×10-7 g/ml，分别取0.1 ml各浓度稀释液均匀涂抹于PSA培养基上，在22 ℃下培养36 h，挑选所有不同特征菌落，点接于混有INA细菌L4的KB平板上。测定抑菌圈半径，3次重复。 1.2.2 抑菌圈测定。
取0.2 ml 3.0×108cfu/ml INA细菌L4菌液放入培养皿内，对孙福在等的抑菌圈法进行改进[19]，测量抑菌圈、菌落、抑菌带半径，观察透明度等，重复3次。
1.2.3 杀灭INA细菌能力测定。
复筛的9个菌株分别在PSA斜面培养基上28 ℃培养36 h，INAL4细菌在KB斜面培养基上22 ℃培养36 h，备用。将培养好的拮抗菌和INA细菌配成浓度均为3.0×108cfu/ml的菌液，各取5.0 ml菌液配制成混合液。将混合液放入4 ℃冰箱中[5]，5 h后各取1.0 ml混合液按照1∶1×105、1∶1×106、1∶1×107的比例稀释，各取0.2 ml稀释液于KB培养基上培养，并设INA细菌原液为对照，重复3皿，在22 ℃下培养3 d，观察记录冰核细菌的菌落数量。处理完毕后，立即放入4 ℃冰箱中24 h，再测定冰核细菌的菌落数量。
1.2.4 破坏冰核蛋白能力测定。
采用Lindow等改进的小液滴冻结法测定冰核活性[8]。配制混合液方法同“1.2.3”。用微量加样器吸取0.2 ml细菌悬浮液，滴加到-5.0 ℃的测试表面上，每滴0.1 ml，每种菌液滴10滴，重复2次。以无菌水和INA细菌L4 3.0×108 cfu/ml作对照。用低温恒温槽测定冻滴数。在2 min内记下冻滴数，换算成冻滴率和破坏率。探针验证小液滴是否冻结以第1次结果为准。
冻滴率=冻结个数/试验总个数×100%
破坏率=不冻结个数/试验总个数×100%
2 结果与分析
2.1 分离到的菌株对INA细菌的抑菌能力测定
从9个不同地区和海拔的枇杷根际土样、枇杷不同部位上分离纯化128个菌株。发现55个菌株对INA有抑菌效果。对INA细菌有抑菌效果的55个菌株中，抑菌圈半徑大于10 cm的有15株，占11.7%；抑菌圈半径大于5 cm且小于10 cm的有22株，占17.2%；抑菌圈半径大于0且小于5 cm的有18株，占14.0%。没有拮抗作用的菌株有73株，占57.0%。拮抗菌株获得率为43.0%。具拮抗能力的55个菌株中，强菌株占27.3%，中强菌株占40.0%，弱菌株占32.7%。根据拮抗菌抑菌圈半径大、增殖速度快、抑菌带清晰程度等特点要求，最终确定了9个菌株作为复筛试验对象，分别为BL36、BL27、BL33、BL30、BL43、BL28、BL31、BL35和BL38。
2.2 拮抗菌对INA细菌抑菌作用比较
INA细菌与抑菌带接触的菌落边缘厚，而对照INA细菌生长正常，菌落铺展整个平板，说明这些拮抗菌产生的拮抗物质对INA菌落的扩展均具有较强的抑制作用。由表2可知，BL36拮抗系数达1.28，抑菌圈半径为27.2 mm，抑菌带宽度为6.0 mm，表现都是最佳，抑菌效果好于其他8个拮抗菌，达到极显著水平。BL43、BL35等6个拮抗菌的拮抗系数没有差异，但抑菌圈半径、抑菌圈宽度、拮抗菌半径之间差异大，无法直接进行利用。
2.3 不同拮抗菌对枇杷INA细菌的杀菌作用
9个拮抗菌与枇杷INA细菌L4按照1∶1的比例混合后，在4 ℃冰箱中处理5 h后，BL33对INA细菌的杀菌率达到98.5%，BL36的杀菌率达到98.0%，杀菌效果较好。处理24 h后，BL33、BL36的杀菌率达100%；拮抗菌BL36、BL33的杀菌效果好于其他7个拮抗菌，差异达到极显著水平。由表2和表3综合分析得出：第一，INA拮抗菌对INA细菌的杀菌作用与产生的抑菌圈大小无关。如菌株BL27等，抑菌圈较大但对INA细菌的杀菌作用与其他的拮抗菌比较却相对较弱。第二，BL38、BL28等4个拮抗菌的杀菌效果随着时间的延长，杀菌率反而下降，该4个菌株的杀菌有效期短。其三，除了BL33、BL36的杀菌率达100%外，其他7个拮抗菌杀菌都不彻底，不能直接应用。综上所述，拮抗菌BL36、BL33是杀灭冰核活性细菌良好的生物防治菌株。
2.4 不同拮抗菌破坏枇杷INA细菌冰核活性结果
对放置5和24 h的混合液于-5 ℃下测定冻滴率。由表4可知，处理5 h后，9个拮抗菌菌株与INA细菌的混合液都有不同程度的冻结现象，其中，BL36的冻滴率为20%，破坏率为80%，效果最佳；BL33、BL38 等4个菌株的冻滴率为40%，破坏率为60%；拮抗菌的破坏率达50%以上。24 h后，BL36、BL33的冻滴率均为10%，破坏率为90%；BL36、BL33等3个拮抗菌对冰核蛋白的破坏率随着时间的延长而提高。BL31、BL35破坏冰核蛋白能力均随着时间的延长而有所下降。综上所述，BL36在5和24 h的破坏能力都是最好的。
3 结论与讨论
针对诱发枇杷霜冻害的冰核细菌，从枇杷根际土壤分离到55个拮抗菌，说明自然界普遍存在着INA细菌拮抗菌。根据增殖速度快、抑菌带宽且清晰程度高的拮抗菌株筛选要求，选出BL36、BL33、BL27等9个强拮抗菌菌株。对INA细菌杀菌能力测定发现处理5和24 h后，BL36的杀菌能力较好且稳定；用VaLi法测定破坏冰核蛋白能力发现BL36在5和24 h破坏冰核活性能力都是最好， BL33次之。拮抗菌BL36在争夺生存空间和营养、杀灭冰核活性细菌、降低冰核蛋白数量3个方面综合效果最佳。
拮抗菌对INA细菌主要通过争夺生存空间和营养来抑制冰核细菌的数量，相应降低冰蛋白的数量来达到抑菌防御霜冻的目的，由于生防菌增殖和扩展要有一个过程，因此在实际生产中，应与药剂复配使用，才能更好地防除冰核细菌，减轻枇杷霜冻害。
参考文献
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[6] 朱红，孙福在，何礼远.诱发农作物霜冻害的冰核细菌冰核活性研究[C]//首届全国中青所植物学术讨论会优秀论文集.北京：中国科学技术出版社，1991：191-197.
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[10] BIGG E K.The supercooling of water[J].Proc Soc，1953，66：686-694.
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