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目的
构建靶向survivin基因的微小RNA(miRNA)真核表达载体,探讨其对人结肠癌细胞(HT-29)增殖、凋亡的影响。
方法设计合成针对survivin基因的miRNA序列,定向克隆至pcDNATM6.2-GW/Em GFP-miR真核表达载体上,构建靶向survivin的miRNA重组质粒。HT-29细胞接种于6孔板,分为空白对照组、转染试剂组、空质粒组(阴性对照组)以及目的基因组(阳性对照组)4组。瞬时转染后收集各组细胞,应用流式细胞仪检测各组细胞的增殖指数及凋亡率,实时荧光定量聚合酶链反应和免疫印迹法(Western blot)检测靶基因(survivin)mRNA和蛋白的表达。
结果HT-29细胞转染后,目的基因组增殖指数与正常组、转染试剂组、空质粒组相比明显降低(17.98%±2.35% vs 38.04%±2.11% vs 36.73%±2.51% vs 36.57%±3.05%; t=20.05,P<0.01;t=18.75,P<0.01;t=18.59,P<0.01),凋亡率明显增高(19.54%±1.74% vs 3.13%±0.29% vs 3.70%±0.44% vs 3.61%±0.50%; t=16.40,P<0.01;t=15.84,P<0.01;t=15.92,P<0.01)。目的基因组survivin mRNA与其他各组相比明显降低(t=0.68,P<0.01;t=0.58,P<0.01;t=0.61,P<0.01),蛋白的表达亦明显降低(t=0.64,P<0.01;t=0.62,P<0.01;t=0.67,P<0.01)。
结论靶向沉默结肠癌HT-29细胞的survivin基因可以明显抑制细胞增殖,并诱导细胞凋亡。