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【摘 要】目的：探究肺癌细胞分泌的外泌体对顺铂的敏感性调节。方法：通过超速离心从肺癌细胞A549上清液中分离得到外泌体，采用透射电子显微镜（TEM）来观察外泌体的形貌，蛋白质印迹法检测CD63和CD81的蛋白表达；将肺癌细胞来源外泌体一组用顺铂处理，另一组不进行处理，将2组外泌体与肺癌细胞共同培养，然后用CCK-8法来检测外泌体在同源细胞中对顺铂的敏感性调节过程中的作用。结果：外泌体在透射电子显微镜下观察到具有盘状的形貌，直径约30-100nm；蛋白质印迹法显示外泌体富含CD63和CD81蛋白；未顺铂处理的exosome干预细胞组较PBS处理的细胞组细胞存活率高4%，而顺铂处理的exosome干预细胞组较未顺铂处理的exosome干预细胞组细胞存活率高24%，P<0.05。结论：肺癌细胞来源的顺铂处理的外泌体降低了肺癌细胞对顺铂的敏感性，这可能为肺癌的化疗提供一种新的靶点和思路。
【關键词】肺癌；外泌体； 化疗
【中图分类号】R197 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2019）02-0091-02
Lung cancer cell-derived cisplatin-treated exosomes reduce the sensitivity of lung cancer cells to cisplatin
Yang yi Zhang zhi jun（Corresponding author）
（Center for reproductive medicine， Taihe hospital， Shiyan442000， Hubei， China）
【Abstract】Objective：To investigate the sensitivity of exosomes secreted by lung cancer cells to cisplatin. Methods：Exosomes were isolated from the supernatant of lung cancer cell A549 by ultracentrifugation. The morphology of exosomes was observed by transmission electron microscopy （TEM）. The protein expression of CD63 and CD81 was detected by Western blotting. One group was treated with cisplatin and the other group was not treated. Two groups of exosomes were co-cultured with lung cancer cells， and then CCK-8 method was used to detect the sensitivity of exosomes to cisplatin in homologous cells. The role of the adjustment process. Results：Exosomes were observed to have a disk-like morphology under transmission electron microscopy with a diameter of about 30-100 nm. Western blotting showed that exosomes were rich in CD63 and CD81 proteins. The non-cisplatin-treated exosome intervention cell group had a 4% higher cell viability than the PBS-treated cell group， while the cisplatin-treated exosome intervention cell group had a 24% higher cell viability than the non-cisplatin-treated exosome intervention cell group， P < 0.05. Conclusion：Lung cancer cell-derived cisplatin-treated exosomes reduce the sensitivity of lung cancer cells to cisplatin， which may provide a new target and idea for chemotherapy of lung cancer.
【Key word】Lung cancer； Exosome； Chemotherapy
肺癌的发病率和致死率在所有恶性肿瘤中居于首位，并且逐年上升，严重危害着人民健康。肺癌起病隐匿，病情发展迅速，影响肺癌预后的最主要因素是分期，约75%～85%的肺癌患者在诊断时就已属晚期，失去彻底切除机会[1-3]。外泌体（exosome，Exo）是由多种细胞如树突状细胞、肿瘤细胞等经内吞逆出芽形成许多小囊泡，直径约30～100nm。它可以在不直接接触的情况下完成细胞间生物信号传导[4]。本研究成功从肺癌细胞中提出外泌体，并揭示了肺癌细胞来源的外泌体能调节肺癌细胞对顺铂化疗敏感性，这为肺癌的治疗提供了一种新的思路和靶点
1 资料与方法
1.1 细胞培养 肺癌细胞A549 购于上海细胞库。将其接种到培养液中37 ℃、5 % CO2的恒温箱内150rpm培养，培养48h传代一次。培养液成分：RPMI 1640培养液中添加10U/L庆大霉素和10% 灭活胎牛血清。 1.2提取exosomes、电镜制样和检测蛋白表达 收集培养48h后的培养液上清液，将上清液用离心机多次离心去除胞体和碎片杂质，取浓缩液，在4℃下继续离心得到的下层沉淀即是exosomes。
将得到的exosomes沉淀溶解稀释，取20ul滴到铜网，室温下晾干，即可置于透射扫描电镜下进行观察并拍摄照片。
1.3CCK-8法检测细胞的存活率 将A549肺癌细胞（对数生长期）接种到96 孔板中（ 细胞数约6×103个/孔），24h后加入不同浓度梯度的顺铂（浓度为0-10μg/ml），培养48h。每孔加入100ul1：9的CCK-8和培养液，30min后，用紫外可见光分光仪在450nm波长下测吸光度。
1.4统计学方法 所有数据均采用SPSS22.0软件进行统计分析，计量资料应用平均值±标准差（ ），计量资料组间比较采用对照组独立样本t检验，计数资料以百分率（%）表示，采用x2检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1肺癌细胞A549来源exosomes形态和蛋白表达
从透射显微电镜图中可以达到Exosome的形态为圆盘状（图1A），直径约为30-100nm，大小尺寸为纳米级。从图1B中可以发现具有特异性表达CD63和CD81蛋白，这证明我们提取的是细胞分泌到细胞外的exosomes，而不是其他物质，提取成功。
2.2exosome对顺铂敏感性调解过程中的影响
不同浓度梯度的顺铂对肺癌细胞有一定的抑制作用，浓度越大，细胞存活率就越低，在3ug/ml的顺铂浓度时，细胞存活率为50%（图2）。分别用顺铂处理过的exosome和顺铂处理的exosome预处理细胞，并与对照PBS组作比较（图3）。未顺铂处理的exosome干预细胞组较PBS处理的细胞组细胞存活率高4%，而顺铂处理的exosome干预細胞组较未顺铂处理的exosome干预细胞组细胞存活率高24%。
3 讨论
自1987年，Johnstone等首次观察到外泌体，成功分离纯化并命名为exosomes之后，外泌体的研究引起了广泛的关注。2001年，有研究发现，肿瘤来源的外泌体（tumor-derived exosome，TEX）表面富含肿瘤抗原，可使细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）主动杀伤肿瘤细胞[5]。由此，Exo在肿瘤领域的研究逐渐推上了热潮。Exo也被看作是一种热休克蛋白的载体，热休克蛋白（Hsp）可在各种应激状态下被诱导，作为一种“危险信号”诱发机体产生有效的抗肿瘤免疫应答，又称为应激蛋白[6]。此研究显示，抑制肺癌细胞Exo的生成或释放将为肺癌的治疗提供新的方法。
本研究通过透射电子显微镜观察到了肺癌细胞A549分泌的exosome的形态为圆盘状，蛋白质印迹法也顺利检测到CD63和CD81两种特异性蛋白质。CCK-8法检测到的细胞成活率明显经顺铂处理组要比未经顺铂处理组要高。这说明exosome会影响同源细胞对顺铂敏感性有所降低，不利于癌症患者顺铂化疗的治疗。
综上所述，肺癌细胞分泌的exosome可以在细胞间传递信息，导致同源细胞对顺铂敏感性的降低。换句话说，减少exosome的分泌和细胞间的传递可以增加顺铂化疗的敏感性和疗效，可以在治疗肺癌药物研究中加以应用，是一种新的治疗思路。
参考文献
[1]M.J.Tsai，etal.Cysteinyl leukotriene receptor antagonists decrease cancer risk in asthma patients.Sci. Rep.6（2016），23979.
[2]KOSAKA N. Decoding the secret of cancer by means of extracellular vesicles[J]. J Clin Med，2016，5（2）：22.
[3]Ana Lukic ， Casper J.E. Wahlund ， Cristina Gómeza， Daniel Brodin ， Bengt Samuelsson ， Craig E. Wheelock ， Susanne Gabrielssonb， Olof R?dmark.Exosomes and cells from lung cancer pleural exudates transform LTC4 to LTD4， promoting cell migration and survival via CysLT1.Cancer Letters. 2019，444，1-8.
[4]LiZhou， Tang feng， LvQun Zhang， Qingqing Zhu， Ping Zhan， Suhua Zhu， Jianya Zhang， Yong Song.The biology， function and clinical implications of exosomes in lung cancerCancerLetters，2017，407，84-92.
[5]解世林，曲晶磊，范一博，等.Akt和SRC在Exosomes促进同源肺癌细胞迁移中的作用[J].中国医科大学学报，2017，46（04）：294-297.
[6]Y. Liu， etal.Tumor exosomal RNAs promote lung pre-metastatic niche formation by activating alveolar epithelial TLR3 to recruit neutrophils， Cancer Cell. 2016，30 （2）：243–256.
十堰市科技局项目
项目名称 ：Exosomes对肺癌发生发展的影响和机制的研究（项目编号：18Y40）
【關键词】肺癌；外泌体； 化疗
【中图分类号】R197 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2019）02-0091-02
Lung cancer cell-derived cisplatin-treated exosomes reduce the sensitivity of lung cancer cells to cisplatin
Yang yi Zhang zhi jun（Corresponding author）
（Center for reproductive medicine， Taihe hospital， Shiyan442000， Hubei， China）
【Abstract】Objective：To investigate the sensitivity of exosomes secreted by lung cancer cells to cisplatin. Methods：Exosomes were isolated from the supernatant of lung cancer cell A549 by ultracentrifugation. The morphology of exosomes was observed by transmission electron microscopy （TEM）. The protein expression of CD63 and CD81 was detected by Western blotting. One group was treated with cisplatin and the other group was not treated. Two groups of exosomes were co-cultured with lung cancer cells， and then CCK-8 method was used to detect the sensitivity of exosomes to cisplatin in homologous cells. The role of the adjustment process. Results：Exosomes were observed to have a disk-like morphology under transmission electron microscopy with a diameter of about 30-100 nm. Western blotting showed that exosomes were rich in CD63 and CD81 proteins. The non-cisplatin-treated exosome intervention cell group had a 4% higher cell viability than the PBS-treated cell group， while the cisplatin-treated exosome intervention cell group had a 24% higher cell viability than the non-cisplatin-treated exosome intervention cell group， P < 0.05. Conclusion：Lung cancer cell-derived cisplatin-treated exosomes reduce the sensitivity of lung cancer cells to cisplatin， which may provide a new target and idea for chemotherapy of lung cancer.
【Key word】Lung cancer； Exosome； Chemotherapy
肺癌的发病率和致死率在所有恶性肿瘤中居于首位，并且逐年上升，严重危害着人民健康。肺癌起病隐匿，病情发展迅速，影响肺癌预后的最主要因素是分期，约75%～85%的肺癌患者在诊断时就已属晚期，失去彻底切除机会[1-3]。外泌体（exosome，Exo）是由多种细胞如树突状细胞、肿瘤细胞等经内吞逆出芽形成许多小囊泡，直径约30～100nm。它可以在不直接接触的情况下完成细胞间生物信号传导[4]。本研究成功从肺癌细胞中提出外泌体，并揭示了肺癌细胞来源的外泌体能调节肺癌细胞对顺铂化疗敏感性，这为肺癌的治疗提供了一种新的思路和靶点
1 资料与方法
1.1 细胞培养 肺癌细胞A549 购于上海细胞库。将其接种到培养液中37 ℃、5 % CO2的恒温箱内150rpm培养，培养48h传代一次。培养液成分：RPMI 1640培养液中添加10U/L庆大霉素和10% 灭活胎牛血清。 1.2提取exosomes、电镜制样和检测蛋白表达 收集培养48h后的培养液上清液，将上清液用离心机多次离心去除胞体和碎片杂质，取浓缩液，在4℃下继续离心得到的下层沉淀即是exosomes。
将得到的exosomes沉淀溶解稀释，取20ul滴到铜网，室温下晾干，即可置于透射扫描电镜下进行观察并拍摄照片。
1.3CCK-8法检测细胞的存活率 将A549肺癌细胞（对数生长期）接种到96 孔板中（ 细胞数约6×103个/孔），24h后加入不同浓度梯度的顺铂（浓度为0-10μg/ml），培养48h。每孔加入100ul1：9的CCK-8和培养液，30min后，用紫外可见光分光仪在450nm波长下测吸光度。
1.4统计学方法 所有数据均采用SPSS22.0软件进行统计分析，计量资料应用平均值±标准差（ ），计量资料组间比较采用对照组独立样本t检验，计数资料以百分率（%）表示，采用x2检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1肺癌细胞A549来源exosomes形态和蛋白表达
从透射显微电镜图中可以达到Exosome的形态为圆盘状（图1A），直径约为30-100nm，大小尺寸为纳米级。从图1B中可以发现具有特异性表达CD63和CD81蛋白，这证明我们提取的是细胞分泌到细胞外的exosomes，而不是其他物质，提取成功。
2.2exosome对顺铂敏感性调解过程中的影响
不同浓度梯度的顺铂对肺癌细胞有一定的抑制作用，浓度越大，细胞存活率就越低，在3ug/ml的顺铂浓度时，细胞存活率为50%（图2）。分别用顺铂处理过的exosome和顺铂处理的exosome预处理细胞，并与对照PBS组作比较（图3）。未顺铂处理的exosome干预细胞组较PBS处理的细胞组细胞存活率高4%，而顺铂处理的exosome干预細胞组较未顺铂处理的exosome干预细胞组细胞存活率高24%。
3 讨论
自1987年，Johnstone等首次观察到外泌体，成功分离纯化并命名为exosomes之后，外泌体的研究引起了广泛的关注。2001年，有研究发现，肿瘤来源的外泌体（tumor-derived exosome，TEX）表面富含肿瘤抗原，可使细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）主动杀伤肿瘤细胞[5]。由此，Exo在肿瘤领域的研究逐渐推上了热潮。Exo也被看作是一种热休克蛋白的载体，热休克蛋白（Hsp）可在各种应激状态下被诱导，作为一种“危险信号”诱发机体产生有效的抗肿瘤免疫应答，又称为应激蛋白[6]。此研究显示，抑制肺癌细胞Exo的生成或释放将为肺癌的治疗提供新的方法。
本研究通过透射电子显微镜观察到了肺癌细胞A549分泌的exosome的形态为圆盘状，蛋白质印迹法也顺利检测到CD63和CD81两种特异性蛋白质。CCK-8法检测到的细胞成活率明显经顺铂处理组要比未经顺铂处理组要高。这说明exosome会影响同源细胞对顺铂敏感性有所降低，不利于癌症患者顺铂化疗的治疗。
综上所述，肺癌细胞分泌的exosome可以在细胞间传递信息，导致同源细胞对顺铂敏感性的降低。换句话说，减少exosome的分泌和细胞间的传递可以增加顺铂化疗的敏感性和疗效，可以在治疗肺癌药物研究中加以应用，是一种新的治疗思路。
参考文献
[1]M.J.Tsai，etal.Cysteinyl leukotriene receptor antagonists decrease cancer risk in asthma patients.Sci. Rep.6（2016），23979.
[2]KOSAKA N. Decoding the secret of cancer by means of extracellular vesicles[J]. J Clin Med，2016，5（2）：22.
[3]Ana Lukic ， Casper J.E. Wahlund ， Cristina Gómeza， Daniel Brodin ， Bengt Samuelsson ， Craig E. Wheelock ， Susanne Gabrielssonb， Olof R?dmark.Exosomes and cells from lung cancer pleural exudates transform LTC4 to LTD4， promoting cell migration and survival via CysLT1.Cancer Letters. 2019，444，1-8.
[4]LiZhou， Tang feng， LvQun Zhang， Qingqing Zhu， Ping Zhan， Suhua Zhu， Jianya Zhang， Yong Song.The biology， function and clinical implications of exosomes in lung cancerCancerLetters，2017，407，84-92.
[5]解世林，曲晶磊，范一博，等.Akt和SRC在Exosomes促进同源肺癌细胞迁移中的作用[J].中国医科大学学报，2017，46（04）：294-297.
[6]Y. Liu， etal.Tumor exosomal RNAs promote lung pre-metastatic niche formation by activating alveolar epithelial TLR3 to recruit neutrophils， Cancer Cell. 2016，30 （2）：243–256.
十堰市科技局项目
项目名称 ：Exosomes对肺癌发生发展的影响和机制的研究（项目编号：18Y40）