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摘 要：目的：观察夏枯草提取物对人食管癌Eca-109细胞Survivin和Caspase-3基因表达影响，研究夏枯草抗食管癌作用及其机制。方法：IC50浓度夏枯草提取物作用于食管癌Eca-109细胞，CCK-8法检测细胞增殖抑制率，RT-PCR、Western Blotting法检测Survivin和Caspase-3基因及蛋白表达，Annexin-V-FITC/PI法检测细胞凋亡率。结果：食管癌Eca-109细胞出现增殖抑制， Survivin表达减少，Caspase-3表达增加，细胞凋亡率增高。结论：夏枯草可抑制食管癌Eca-109细胞增殖，抑制Survivin表达，促进Caspase-3表达，促进细胞凋亡。
关键词：夏枯草;食管癌;凋亡;Survivin;Caspase-3
夏枯草具有消炎、抗菌、降血糖、抗病毒、抗肿瘤等药理学作用[1]。本实验研究夏枯草对食管癌Eca-109细胞Survivin和Caspase-3基因表达的影响，探讨夏枯抗食管癌作用及机制，为临床应用夏枯草治疗食管癌提供科学依据。
1 材料和方法
1.1 材料
食管癌Eca-109细胞系，牡丹江医学院科研中心提供;夏枯草，购自Sigma-Aldrich中国公司;RPMI1640培养基、胰蛋白酶、原装胎牛血清，Gibco公司;顺铂，齐鲁制药厂;RT-PCR试剂盒、Cell Counting Kit-8、GAPDH小鼠单抗，碧云天生物技术研究所;Annexin-V-FITC/PI凋亡双染试剂盒，BD公司;兔抗人Survivin抗体、鼠抗人Caspase-3抗体，武汉博士德生物工程公司。
1.2 方法
1.2.1 细胞准备工作 食管癌Eca-109细胞培养于RPMI 1640培养基中（含10%胎牛血清），置37℃，饱和湿度为5%CO2的培养箱内培养，2～3 d传代1次，选取处于对数生长期细胞用于实验。
1.2.2 实验分组情况 共分3组：夏枯草作用组（浓度为IC50，Pr组）、阳性对照组（加顺铂5 μg/mL，Po组）、空白对照组（加培养液，Bl组）。
1.2.3 观察细胞形态变化 各组细胞常规孵育培养24、48、72 h后，置于倒置显微镜下观察各组细胞形态变化情况。
1.2.4 CCK-8法测定各组细胞增殖抑制率 在96孔培养板上按照4×105/孔接种各组细胞，接种3板，每板每组接种12复孔，加入4个剂量（0、50、100、200 μg/mL，每个剂量3复孔）的夏枯草提取物，分别于接种后24、48、72 h取1板，向待测孔内加入CCK-8試剂10 μL，培养箱孵育1 h后用酶标仪测定450 nm处的吸光度值（OD值），每次每组测定5复孔。以培养液做空白对照并调零，每个时间点重复检测3次，取平均值，计算细胞增值抑制率，进一步求出半数抑制浓度（IC50）。
细胞增殖抑制率=1-细胞存活率
即：细胞增殖抑制率=（1-实验组OD值/空白对照组OD值）×100%
1.2.5 RT-PCR法检测Survivin和Caspase-3基因表达收集常规培养48 h后的各组细胞，利用Trizol试剂一步法提取总RNA。按照RT-PCR试剂盒说明书进行反转录合成cDNA。参考文献[2-3]，设计Suivivin、Caspase-3、GAPDH引物序列如下：Suivivin基因扩增产物约363 bp，上游P1：5′-AGCCCTTTCTCAACGACCAC，下游P2：5′-GCACTTTCTTCGAGTTTCC;Caspase-3基因扩增产物约194 bp，上游P1：5′-CGTGTCATAAAATACCAGTGGA，下游P2：5′-AAATTCTGTTGCCACCTTTCG;GAPDH基因扩增产物长度约280 bp，上游P3：5′-GGTGGACCTGACCTGCCGTCTAGA，下游P4：5′-TTACTCCTTGGAGGCCATGTGGG。PCR反应条件：94℃预变性5 min;94 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30次循环;72 ℃延伸10 min。扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，并在凝胶分析系统下成像，测定各组光密度值。通过Survivin/GAPDH和Caspase-3/GAPDH光密度比值进行定量分析。
1.2.6 Western Blotting法检测Survivin和Caspase-3蛋白表达 收集培养48 h后的各组细胞，加入RIPA裂解缓冲液，进行蛋白提取及蛋白定量，SDS-PAGE电泳后进行转膜、封闭，兔抗人Survivin抗体、鼠抗人Caspase-3抗体（1∶400）一抗孵育，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔或羊抗小鼠IgG（1∶400）二抗孵育，ECL反应后用quantity one 4.6.2软件进行定量分析。
1.2.7 流式细胞仪检测细胞凋亡 将处于对数生长期的各组食管癌Eca-109细胞制成单细胞悬液，收集浓度为1×106细胞/mL的细胞悬液3 mL，按Annexin-V-FITC/PI凋亡试剂盒说明分别处理各组细胞进行双染，30 min内用流式细胞仪检测细胞凋亡率。
1.2.8 统计学分析 实验数据以均数±标准差（±s）表示，统计学处理采用SPSS 22.0软件包，进行方差分析。
2 结果与分析
2.1 各组细胞的形态学变化
倒置显微镜下观察，夏枯草作用组食管癌细24 h后呈现贴壁不佳现象，细胞体积缩小;48 h后细胞数量减少且大量细胞悬浮于培养液中，细胞膜出现空泡、褶皱，胞浆内颗粒增多，胞核染色质浓缩，细胞固缩成圆形。对照组细胞生长良好，密集贴壁。
2.2 细胞增殖抑制率测定 与空白对照组相比，夏枯草作用组，阳性对照组各时间点对细胞均有增殖抑制作用，且呈量效和时效关系，差别有统计学意义（P<0.01）（表1）。经过 Graph Pad Prism5 软件计算得到 48 h IC50=168 μg/mL。
2.3 RT-PCR法检测Survivin和Caspase-3基因表达
夏枯草作用组、阳性对照组与空白对照组相比，Survivin基因表达水平降低，Caspase-3基因表达水平增高（P<0.01）（图1 、表2）。
2.4 Western blotting法檢测Survivin和Caspase-3蛋白表达
结果显示，与空白对照组相比，夏枯草作用组、阳性对照组Survivin蛋白表达量减少，Caspase-3蛋白表达量增多（P<0.01）（图2、表3）。
2.5 各组细胞凋亡情况
夏枯草组细胞凋亡率增高，与空白对照组相比差异具有显著性（P<0.01）（表4）。
3 讨论
开发新的、高效低毒的抗肿瘤药物具有重要临床意义[4]。肿瘤的发生与细胞凋亡失衡、机体免疫功能处于失稳态有关[5]，诱导肿瘤细胞凋亡是目前抗肿瘤中草药的作用机制之一。肿瘤细胞异常增殖的主要原因与细胞凋亡抑制基因表达增多，促细胞凋亡基因表达减少有关，Survivin和Caspase-3作为研究的热门基因，与肿瘤的很多生物学特性密切相关，尤其是在肿瘤细胞凋亡调控中的作用受到广泛关注。Survivin在正常人体组织中几乎不表达，在绝大多数恶性肿瘤组织中却高表达[6-7]，具有抑制细胞凋亡作用;Caspase-3是Caspase家族的重要成员之一，是凋亡发生中的关键控制因素，具有凋亡促进作用，使细胞凋亡进入不可逆阶段[8]。研究表明，多种抗肿瘤药物可能是通过调节Survivin和Caspase-3基因表达而发挥抗肿瘤作用[9]。本研究表明，夏枯草使食管癌细胞增殖减慢，细胞中Caspase-3基因表达量增多，Survivin基因表达量减少，细胞凋亡率增多。通过实验结果推断，夏枯草可能通过抑制Survivin基因表达、促进Caspase-3基因表达而促进细胞凋亡，进而发挥抑制食管癌细胞增殖的作用，提示食管癌的异常增殖可能与Survivin和Caspase-3基因表达失衡有关，为临床食管癌中药辅助治疗及靶点确定提供科学依据。◇
参考文献
[1]Hwang Y J，et al.In vitro antioxidant and anticancer effects of solvent fractions from Prunellavulgaris var.lilacina[J].BMC Complement Altern Med，2013，13（1）：310-315.
[2]李永军，孙晓慧.白藜芦醇对食管癌细胞凋亡相关基因Survivin和bax表达的影响[J].中国肿瘤，2009，18（2）：140-143.
[3]郑学芝，胡静，孙卫，等.Nucleostemin基因特异性RNA干扰对胃癌细胞增殖和凋亡的影响[J].西安交通大学学报（医学版），2009，30（2）：203-205.
[4]Duff J M，Peters H C，Zingarelli W，et al.Comparative Effectiveness of preoperative treatment regimens in patients with potentially resectable esophageal cancer[J].Jama Surgery，2017，152（1）：103-105.
[5]Gary D.Stoner.Etiology and chemoprevention of esophageal squamous cell carcainoma[J].Carcinogenesis，2001，22（11）：1737-1746.
[6]Sun B，Xu H，Zhang G，et al.Basic fibroblast growth factor upregu-lates surviving expression in hepatocellular carcinoma cells via aprotein kinase B-dependent pathway[J].Oncol Rep，2013，30（1）：385-390.
[7]Bongiovanni L，D’Andrea A，Romanucci M，et al. Epithelial-to-mesenchymal transition：immunohistochemical investigationof related molecules in canine cutaneous epithelial tumours[J].Vet Dermatol，2013（24）：195-203.
[8]Zheng CG，Chen R，Xie JB，et al.Immunohistochemical expression of Notch1，Jagged1，NF-Kb and MMP-9 in colorectal cancer patients and the relationship to clinicopathological parameters[J].Cancer Biomark，2015，15（6）：889-897.
[9]Qin R，Wen Y，Wang W，et al.The role of postoperative adjuvant chemotherapy for lymph node-positive esophageal squamous cell carcinoma：a propensity score matching analysis[J].Medical Oncology，2016，33（314）：1536-1541. Effects and Mechanism of Prunella vulgaris on Expressions of Survivin and Caspase-3 in Esophageal Cancer Cells
ZHENG Xue-zhi1，GUO Ran1，LI Jia2，WANG Wen-ting 1，ZHANG Xu-dong1，XU Qiu-ling1
（1Department of Physiology，Mudanjiang Medical University，Mudanjiang 157011，China;2The Second People’s Hospital of Mudangjiang，Mudanjiang 157011，China）
Abstract：Objective To investigate the effects of Prunella vulgaris on expressions of Survivin and Caspase-3 in Esophageal cancer Eca-109 cells and study the anti-esophageal cancer effect of Prunella vulgaris and its mechanism.Method Esophageal cancer Eca-109 cells were co-cultured with Prunella vulgaris concentration of IC50，the rate of cell proliferation inhibition was detected by CCK-8 assay.The levels of Survivin and Caspase-3 expression were detected by RT-PCR and western blotting，the cells apoptosis ratio were detected by Annexin-V-FITC/PI kit.Result Prunella vulgaris could effectively inhibit esophageal cancer Eca-109 Cells proliferation，reduce the level of Survivin expression and increase the level of Caspase-3 expression，increase rate of apoptosis.Conclusion Prunella vulgaris substantially inhibited esophageal cancer Eca-109 cells proliferation，reduceed the level of Survivin expression，increaseed the level of Caspase-3 expression and induced apoptosis.
Keywords：Prunella vulgaris;esophageal cancer;apoptosis;Survivin;Caspase-3
关键词：夏枯草;食管癌;凋亡;Survivin;Caspase-3
夏枯草具有消炎、抗菌、降血糖、抗病毒、抗肿瘤等药理学作用[1]。本实验研究夏枯草对食管癌Eca-109细胞Survivin和Caspase-3基因表达的影响，探讨夏枯抗食管癌作用及机制，为临床应用夏枯草治疗食管癌提供科学依据。
1 材料和方法
1.1 材料
食管癌Eca-109细胞系，牡丹江医学院科研中心提供;夏枯草，购自Sigma-Aldrich中国公司;RPMI1640培养基、胰蛋白酶、原装胎牛血清，Gibco公司;顺铂，齐鲁制药厂;RT-PCR试剂盒、Cell Counting Kit-8、GAPDH小鼠单抗，碧云天生物技术研究所;Annexin-V-FITC/PI凋亡双染试剂盒，BD公司;兔抗人Survivin抗体、鼠抗人Caspase-3抗体，武汉博士德生物工程公司。
1.2 方法
1.2.1 细胞准备工作 食管癌Eca-109细胞培养于RPMI 1640培养基中（含10%胎牛血清），置37℃，饱和湿度为5%CO2的培养箱内培养，2～3 d传代1次，选取处于对数生长期细胞用于实验。
1.2.2 实验分组情况 共分3组：夏枯草作用组（浓度为IC50，Pr组）、阳性对照组（加顺铂5 μg/mL，Po组）、空白对照组（加培养液，Bl组）。
1.2.3 观察细胞形态变化 各组细胞常规孵育培养24、48、72 h后，置于倒置显微镜下观察各组细胞形态变化情况。
1.2.4 CCK-8法测定各组细胞增殖抑制率 在96孔培养板上按照4×105/孔接种各组细胞，接种3板，每板每组接种12复孔，加入4个剂量（0、50、100、200 μg/mL，每个剂量3复孔）的夏枯草提取物，分别于接种后24、48、72 h取1板，向待测孔内加入CCK-8試剂10 μL，培养箱孵育1 h后用酶标仪测定450 nm处的吸光度值（OD值），每次每组测定5复孔。以培养液做空白对照并调零，每个时间点重复检测3次，取平均值，计算细胞增值抑制率，进一步求出半数抑制浓度（IC50）。
细胞增殖抑制率=1-细胞存活率
即：细胞增殖抑制率=（1-实验组OD值/空白对照组OD值）×100%
1.2.5 RT-PCR法检测Survivin和Caspase-3基因表达收集常规培养48 h后的各组细胞，利用Trizol试剂一步法提取总RNA。按照RT-PCR试剂盒说明书进行反转录合成cDNA。参考文献[2-3]，设计Suivivin、Caspase-3、GAPDH引物序列如下：Suivivin基因扩增产物约363 bp，上游P1：5′-AGCCCTTTCTCAACGACCAC，下游P2：5′-GCACTTTCTTCGAGTTTCC;Caspase-3基因扩增产物约194 bp，上游P1：5′-CGTGTCATAAAATACCAGTGGA，下游P2：5′-AAATTCTGTTGCCACCTTTCG;GAPDH基因扩增产物长度约280 bp，上游P3：5′-GGTGGACCTGACCTGCCGTCTAGA，下游P4：5′-TTACTCCTTGGAGGCCATGTGGG。PCR反应条件：94℃预变性5 min;94 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30次循环;72 ℃延伸10 min。扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，并在凝胶分析系统下成像，测定各组光密度值。通过Survivin/GAPDH和Caspase-3/GAPDH光密度比值进行定量分析。
1.2.6 Western Blotting法检测Survivin和Caspase-3蛋白表达 收集培养48 h后的各组细胞，加入RIPA裂解缓冲液，进行蛋白提取及蛋白定量，SDS-PAGE电泳后进行转膜、封闭，兔抗人Survivin抗体、鼠抗人Caspase-3抗体（1∶400）一抗孵育，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔或羊抗小鼠IgG（1∶400）二抗孵育，ECL反应后用quantity one 4.6.2软件进行定量分析。
1.2.7 流式细胞仪检测细胞凋亡 将处于对数生长期的各组食管癌Eca-109细胞制成单细胞悬液，收集浓度为1×106细胞/mL的细胞悬液3 mL，按Annexin-V-FITC/PI凋亡试剂盒说明分别处理各组细胞进行双染，30 min内用流式细胞仪检测细胞凋亡率。
1.2.8 统计学分析 实验数据以均数±标准差（±s）表示，统计学处理采用SPSS 22.0软件包，进行方差分析。
2 结果与分析
2.1 各组细胞的形态学变化
倒置显微镜下观察，夏枯草作用组食管癌细24 h后呈现贴壁不佳现象，细胞体积缩小;48 h后细胞数量减少且大量细胞悬浮于培养液中，细胞膜出现空泡、褶皱，胞浆内颗粒增多，胞核染色质浓缩，细胞固缩成圆形。对照组细胞生长良好，密集贴壁。
2.2 细胞增殖抑制率测定 与空白对照组相比，夏枯草作用组，阳性对照组各时间点对细胞均有增殖抑制作用，且呈量效和时效关系，差别有统计学意义（P<0.01）（表1）。经过 Graph Pad Prism5 软件计算得到 48 h IC50=168 μg/mL。
2.3 RT-PCR法检测Survivin和Caspase-3基因表达
夏枯草作用组、阳性对照组与空白对照组相比，Survivin基因表达水平降低，Caspase-3基因表达水平增高（P<0.01）（图1 、表2）。
2.4 Western blotting法檢测Survivin和Caspase-3蛋白表达
结果显示，与空白对照组相比，夏枯草作用组、阳性对照组Survivin蛋白表达量减少，Caspase-3蛋白表达量增多（P<0.01）（图2、表3）。
2.5 各组细胞凋亡情况
夏枯草组细胞凋亡率增高，与空白对照组相比差异具有显著性（P<0.01）（表4）。
3 讨论
开发新的、高效低毒的抗肿瘤药物具有重要临床意义[4]。肿瘤的发生与细胞凋亡失衡、机体免疫功能处于失稳态有关[5]，诱导肿瘤细胞凋亡是目前抗肿瘤中草药的作用机制之一。肿瘤细胞异常增殖的主要原因与细胞凋亡抑制基因表达增多，促细胞凋亡基因表达减少有关，Survivin和Caspase-3作为研究的热门基因，与肿瘤的很多生物学特性密切相关，尤其是在肿瘤细胞凋亡调控中的作用受到广泛关注。Survivin在正常人体组织中几乎不表达，在绝大多数恶性肿瘤组织中却高表达[6-7]，具有抑制细胞凋亡作用;Caspase-3是Caspase家族的重要成员之一，是凋亡发生中的关键控制因素，具有凋亡促进作用，使细胞凋亡进入不可逆阶段[8]。研究表明，多种抗肿瘤药物可能是通过调节Survivin和Caspase-3基因表达而发挥抗肿瘤作用[9]。本研究表明，夏枯草使食管癌细胞增殖减慢，细胞中Caspase-3基因表达量增多，Survivin基因表达量减少，细胞凋亡率增多。通过实验结果推断，夏枯草可能通过抑制Survivin基因表达、促进Caspase-3基因表达而促进细胞凋亡，进而发挥抑制食管癌细胞增殖的作用，提示食管癌的异常增殖可能与Survivin和Caspase-3基因表达失衡有关，为临床食管癌中药辅助治疗及靶点确定提供科学依据。◇
参考文献
[1]Hwang Y J，et al.In vitro antioxidant and anticancer effects of solvent fractions from Prunellavulgaris var.lilacina[J].BMC Complement Altern Med，2013，13（1）：310-315.
[2]李永军，孙晓慧.白藜芦醇对食管癌细胞凋亡相关基因Survivin和bax表达的影响[J].中国肿瘤，2009，18（2）：140-143.
[3]郑学芝，胡静，孙卫，等.Nucleostemin基因特异性RNA干扰对胃癌细胞增殖和凋亡的影响[J].西安交通大学学报（医学版），2009，30（2）：203-205.
[4]Duff J M，Peters H C，Zingarelli W，et al.Comparative Effectiveness of preoperative treatment regimens in patients with potentially resectable esophageal cancer[J].Jama Surgery，2017，152（1）：103-105.
[5]Gary D.Stoner.Etiology and chemoprevention of esophageal squamous cell carcainoma[J].Carcinogenesis，2001，22（11）：1737-1746.
[6]Sun B，Xu H，Zhang G，et al.Basic fibroblast growth factor upregu-lates surviving expression in hepatocellular carcinoma cells via aprotein kinase B-dependent pathway[J].Oncol Rep，2013，30（1）：385-390.
[7]Bongiovanni L，D’Andrea A，Romanucci M，et al. Epithelial-to-mesenchymal transition：immunohistochemical investigationof related molecules in canine cutaneous epithelial tumours[J].Vet Dermatol，2013（24）：195-203.
[8]Zheng CG，Chen R，Xie JB，et al.Immunohistochemical expression of Notch1，Jagged1，NF-Kb and MMP-9 in colorectal cancer patients and the relationship to clinicopathological parameters[J].Cancer Biomark，2015，15（6）：889-897.
[9]Qin R，Wen Y，Wang W，et al.The role of postoperative adjuvant chemotherapy for lymph node-positive esophageal squamous cell carcinoma：a propensity score matching analysis[J].Medical Oncology，2016，33（314）：1536-1541. Effects and Mechanism of Prunella vulgaris on Expressions of Survivin and Caspase-3 in Esophageal Cancer Cells
ZHENG Xue-zhi1，GUO Ran1，LI Jia2，WANG Wen-ting 1，ZHANG Xu-dong1，XU Qiu-ling1
（1Department of Physiology，Mudanjiang Medical University，Mudanjiang 157011，China;2The Second People’s Hospital of Mudangjiang，Mudanjiang 157011，China）
Abstract：Objective To investigate the effects of Prunella vulgaris on expressions of Survivin and Caspase-3 in Esophageal cancer Eca-109 cells and study the anti-esophageal cancer effect of Prunella vulgaris and its mechanism.Method Esophageal cancer Eca-109 cells were co-cultured with Prunella vulgaris concentration of IC50，the rate of cell proliferation inhibition was detected by CCK-8 assay.The levels of Survivin and Caspase-3 expression were detected by RT-PCR and western blotting，the cells apoptosis ratio were detected by Annexin-V-FITC/PI kit.Result Prunella vulgaris could effectively inhibit esophageal cancer Eca-109 Cells proliferation，reduce the level of Survivin expression and increase the level of Caspase-3 expression，increase rate of apoptosis.Conclusion Prunella vulgaris substantially inhibited esophageal cancer Eca-109 cells proliferation，reduceed the level of Survivin expression，increaseed the level of Caspase-3 expression and induced apoptosis.
Keywords：Prunella vulgaris;esophageal cancer;apoptosis;Survivin;Caspase-3