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摘 要 芒果壮铗普瘿蚊是近年来在中国爆发成灾的主要害虫，2003年被命名为新种Procontarinia robusta Li，Bu & Zhang， 2003。通过对其幼虫、蛹、成虫形态的电镜扫描观察以及虫瘿形态特征观察，并结合分子生物学技术测定线粒体COⅠ基因片段序列（488 bp），确定了P. robusta与早先报道的P. matteiana Kieffer & Cecconi，1907为同一物种，两者是同物异名。
关键词 Procontarinia robusta； Procontarinia matteiana； 同物异名； 电镜扫描； 线粒体COⅠ基因
中图分类号 S433 文献标识码 A
Evidences of Procontarinia robusta Synonyms on Morphological
Structure and the Mitochondrial COⅠ Gene
CAI Hongjiao1， WANG Hongyi2 *， LIAO Furong2， LUO Yujie3， GAO Zhan1
1 Fishery College， Jimei University， Xiamen， Fujian 361021， China
2 Xiamen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau， Xiamen， Fujian 361012， China
3 Xiamen No.1 Middle School， Xiamen， Fujian 361003， China
Abstract Procontarinia robusta Li & Bu & Zhang（Diptera： Cecidomyiidae）has outbroke in recent years and was defined as a new species in 2003. The morphological characteristic of larvae， pupae， adults and galls were observed by scanning electron microscope. Meanwhile， the sequence of 488 bp gene of mitochondrial COⅠ gene was determined to compare within different populaitons. Our study proved that P. robusta and P. matteianan are synonyms from the evidences of morphological structre and the mitochondrial COⅠ gene.
Key words Procontarinia robusta； Procontarinia matteianan； Synonyms； Scanning electron microscope； Mitochondrial COⅠ gene
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.08.019
世界上芒果瘿蚊害虫有21个物种[1]和10个未知种[2]，在21个已知种中有15种属于普瘿蚊属（Procontarinia），由于瘿蚊的虫瘿容易看见，但是成虫个体微小很难采集，该属的分类一直都比较困难。
芒果壮铗普瘿蚊1999年在福建省厦门市岛内芒果[Mangifera indica L.（Anacardiaceae）]行道树上首次发现[3-4]，寄主专一性强，只为害芒果树，为害严重的每个叶片可达到500多个虫瘿数，受害植株叶片受害率常达100%。2003年通过成虫形态描述，由李军等鉴定为新种Procontarinia robusta Li，Bu & Zhang， 2003[5]，属双翅目（Diptera），瘿蚊科（Cecidomyiidae），普瘿蚊属（Procontarinai Kieffer & Ceeconi）。近几年在福建省扩散趋势逐年增加，导致芒果园产量降低，果树生长发育受阻，芒果壮铗普瘿蚊是否是新种或者为入侵害虫值得商榷。因此通过现有历史资料比较虫瘿与瘿蚊成虫形态描述，发现与早先报道的东南亚地区印度、印度尼西亚、东帝汶发生的P. matteiana Kieffer & Cecconi物种相同[6-7]。早在一个多世纪之前就有文献对该虫命名。此外虫瘿形态与瘿蚊物种一一对应关系在很多物种上得到验证[1]，不同的物种导致虫瘿形态不同，虽然瘿蚊的形态肉眼很难观察，但虫瘿的形态肉眼非常容易判断从而推断瘿蚊种类，本文从虫瘿形态特征、幼虫、蛹的生物学特性，以及线粒体COⅠⅠ基因来阐述该虫P. robusta应与P. matteianan的同种异名。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 昆虫采集 以芒果壮铗普瘿蚊成虫为试验虫源，根据该虫的地理分布和文献查询，选用福建省5个地理种群和东南亚东帝汶种群进行分析（表1）。采集芒果树上即将羽化的虫瘿叶片，枝条末端棉花加水包裹保湿，放入密封袋内，待羽化后收集放入无水酒精离心管中，写好采集标签，-20 ℃保存备用。东帝汶岛瘿蚊物种（P. matteiana）由Peter Kolesik博士提供。
1.1.2 电镜扫描系统 扫描电镜型号：TM-1000 SEM（Tokyo， Japan）。用镊子在解剖镜下细心拨开虫瘿，挑取幼虫、蛹待用，从密封袋取出刚羽化的雌雄各3头，置于蒸馏水中清洗后，经过乙醇脱水，自然干燥，用导电胶粘于扫描电镜样台上，喷金，在电镜下观察，加速电压10 kV。 1.2 方法
1.2.1 DNA提取、PCR扩增及测序 COⅠ基因序列片段（488 bp）提取技术参考Kolesik等的方法[8]，总DNA提取采用DNA提取试剂盒（购自TaKaRa宝生物工程（大连）生物工程有限公司）。每个地理种群各取3只，每只分别提取DNA，PCR扩增纯化及测序，重复3次。引物为：5′-GGATCACCTGAT
ATAGCATTCCC-3′（COIS）。5′-CCCGGTAAAATTAA
AATATAAACTTC-3′（COIA）[9]。PCR反应体系为50 μL：dNTP Mixture（10 mmol/L）1 μL，10×Easy TaqTM Polymerase Buffer（includes 20 mmol/L MgCl2）5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各2.0 μL，Easy TaqTM DNA Polymerase（5 U/μL）0.6 μL，模板DNA 6 μL，加灭菌双蒸水（DDW）至终体积。PCR反应程序：95 ℃预变性3 min；94 ℃变性45 s，52℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35个循环；最后72 ℃延伸10 min。PCR产物的克隆与测序委托大连宝生物工程公司完成。
1.2.2 数据处理 利用Chroms软件读取测序结果，利用DNAMAN软件进行拼接及同源性比较，利用MEGA 4.0软件计算种群内及种群件的遗传距离，并将序列在NCBI上进行比对。
2 结果与分析
2.1 虫瘿形态特征
成虫产卵于叶背，幼虫孵化后侵入叶肉，刺激叶肉在叶片正面形成圆柱形凸起，而叶背几乎观察不到任何症状，随着幼虫的虫龄增加虫瘿增大，虫瘿颜色由乳白色逐渐变成淡黄色、深绿色、最后形成坚硬的黑色虫瘿（图1、2）。幼虫在虫瘿内生长化蛹，生长后期虫瘿顶端形成深褐色圆形盖子，瘿蚊羽化时破壳而出（图3）。成熟虫瘿直径约为0.5 mm，高度为1～2 mm（图4）。瘿蚊害虫具有显著的为害特征专一性，即特定物种与其形成的虫瘿形态一一对应[1]。Kieffer等将该虫命名为Procontarinia matteianan[10]。Mani曾描述印度芒果树上该虫虫瘿的特征，书中展示的图238#与厦门本地形态一致[6]。
2.2 卵、幼虫形态特征
卵肉眼基本不可见，产卵于叶背，直径约为0.14～0.15 mm[11]。幼虫淡黄色，一共3龄，1龄体长0.15～0.60 mm，2龄体长0.60～1.00 mm，3龄体长1.00～2.10 mm[11]。幼虫无头无足型，头部圆锥形缩入体内，胸部3节，2龄幼虫可见第一胸节腹面有一红褐色三叉戟状剑骨片，腹部9节，各一对气门，腹部侧面有明显的刺突性鳞片（图5）。
2.3 成虫形态特征
成虫描述见李军等[5]及Cai等[2]（图6）的报道：雄虫体长具有淡黄色腹部有三条平行的深棕色盾片。触角鞭节和腹部均稀疏的覆盖刚毛。雌雄个体微小，翅展后翅长为1.40～1.90 mm。雄虫触角12+2，鞭节为双节型，每个鞭节近球形，由一圈环丝和一圈长刚毛组成（图7）。
雌虫触角鞭节筒状，基部着生一圈短粗刚毛，中部由一圈波浪状环丝缠绕在各结节（图7）。产卵器极短，唇片状，末端着生一圈长刚毛，其余地方短毛覆盖（图8），雄虫具有强壮的钳状抱握器，中间为管状阳茎（图8）。其形态描述特征与Kieffer描述一致[10]。
2.4 COⅠ基因DNA比对
扩增所得的COⅠ基因序列长度为488 bp左右，与预期的产物大小相近（图9）。将所得序列进行拼接校对，在NCBI网站上进行BLAST比对，结果显示，所测的序列与昆虫mtDNA COⅠ基因（瘿蚊科，普瘿蚊属等）具有很高的同源性（84%～100%），因此可以确定测定的序列为COⅠ基因序列。不同地理种群瘿蚊COⅠ基因可清楚判读区域为488 bp。
对不同地理种群的序列进行对比，得到同源性的比较值（表2）。从表2可知，东帝汶、福州、厦门集美、泉州和漳州地区的芒果壮铗普瘿蚊同源性100%，可以确定P. robusta与P. matteiana为同一物种。与厦门思明地区的芒果壮铗普瘿蚊仅有2个碱基差异，同源性也校高，外在NCBI上选择同属于普瘿蚊属的2个物种比对，与澳洲P. pustulata和日本物种P. mangicola相比，同源性为83.20%～85.45%。可以确定本试验虫种与P. pustulata和P. mangicola并非同一个物种。
3 讨论与结论
由于瘿蚊的个体非常微小，分类鉴定非常困难，但是瘿蚊的瘿壳特殊专一性是区别的主要依据，也就是说每个瘿蚊物种的瘿壳形态构造差异很大，可作为主要分类依据之一，虽然前人对瘿蚊的成虫形态有详细的描述，但是本文结合电镜图片，更加清晰直观从瘿蚊的为害特性、虫瘿特征、瘿蚊各个虫态生物学特性进一步验证了芒果壮铗普瘿蚊P. robusta与P. matteiana为同物异名，通过分子生物学技术测序COⅠ基因片段，两者的同源性为99.59%，其中东帝汶岛与福州、漳州、泉州的地理种群为100%，进一步验证2个物种为同物异名。Cai等测定显示P. robusta与东帝汶P. matteiana的 COⅠ基因一致[2]。因此笔者认为P. robusta与P.matteianan应为同物异名。通过线粒体COⅠ基因比对，确定了东帝汶与国内种群分子水平上没有差异性。
参考文献
[1] Gagné R J. Update for a catalog of the Cecidomyiidae of the world[OL]. http：//www.ars.usda.gov/SP2UserFiles/Place/12754100/Gagne_2010_World_Catalog_Cecidomyiidae.pdf]. Accessed on 2010. 10/08/2011. [2] Cai H J， Kolesik P， Wang H Y， et al. Description of the immature stages and gall morpholgy， and molecular characterisation of Procontarinia robusta， a gall midge（Diptera： Cecidomyiidae）damaging leaves of mango Mangifera indica L.（Anarcadiaceae）in southern Asia[J]. Aust J Entomol， 2013， 52： 206-211.
[3] 张清源， 林振基， 王宏毅， 等.一种新的危害芒果树叶的瘿蚊害虫[J]. 华东昆虫学报， 2003， 12（2）： 107-109.
[4] 苏燕苹， 张万旗， 王 谨， 等.芒果壮铗普瘿蚊在厦门危害情况及化学防治研究[J]. 福建热作科技， 2006， 31（3）： 1-3.
[5] 李 军， 卜文俊， 张清源. 危害芒果叶片的瘿蚊科——中国新纪录和一新种[J]. 动物分类学报， 2003， 28（1）： 148-151.
[6] Mani M S. Cecidotherca Indica[J]. Agra University J Res（Science）， 1959， 8： 91-279.
[7] Docters van Leeuwen-Reijnvaan J， Docters van Leeuwen W M. The zoocecidia of the Netherlands East Indies[M]. Batavia： Drukkerij de Unie， 1926： 324.
[8] Kolesik P， Rice A D， Bellis G A， et al. Procontarinia pustulata， a new gall midge species（Diptera： Cecidomyiidae）feeding on mango， Mangifera indica（Anarcadiaceae）， in northern Australia and Papua New Guinea[J]. Aust J Entomol， 2009， 48（4）： 310-316.
[9] Yukawa J， Uechi N， Horikiri M， et al. Description of the soybean pod gall midge， Asphondylia yushimai sp. n.（Diptera： Cecidomyiidae）， a major pest of soybean and findings of host alternation[J]. B Entomol Res， 2003， 93： 76-86.
[10] Kieffer J J. Description de galles et d'insectes gallicoles d'Asie[J]. Marcellia， 1909， 7： 149-167.
[11] 王伟新， 王宏毅.芒果壮铗普瘿蚊生物学初报[J]. 福建农业学报， 2005， 20（2）： 74-76.
责任编辑：赵军明
关键词 Procontarinia robusta； Procontarinia matteiana； 同物异名； 电镜扫描； 线粒体COⅠ基因
中图分类号 S433 文献标识码 A
Evidences of Procontarinia robusta Synonyms on Morphological
Structure and the Mitochondrial COⅠ Gene
CAI Hongjiao1， WANG Hongyi2 *， LIAO Furong2， LUO Yujie3， GAO Zhan1
1 Fishery College， Jimei University， Xiamen， Fujian 361021， China
2 Xiamen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau， Xiamen， Fujian 361012， China
3 Xiamen No.1 Middle School， Xiamen， Fujian 361003， China
Abstract Procontarinia robusta Li & Bu & Zhang（Diptera： Cecidomyiidae）has outbroke in recent years and was defined as a new species in 2003. The morphological characteristic of larvae， pupae， adults and galls were observed by scanning electron microscope. Meanwhile， the sequence of 488 bp gene of mitochondrial COⅠ gene was determined to compare within different populaitons. Our study proved that P. robusta and P. matteianan are synonyms from the evidences of morphological structre and the mitochondrial COⅠ gene.
Key words Procontarinia robusta； Procontarinia matteianan； Synonyms； Scanning electron microscope； Mitochondrial COⅠ gene
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.08.019
世界上芒果瘿蚊害虫有21个物种[1]和10个未知种[2]，在21个已知种中有15种属于普瘿蚊属（Procontarinia），由于瘿蚊的虫瘿容易看见，但是成虫个体微小很难采集，该属的分类一直都比较困难。
芒果壮铗普瘿蚊1999年在福建省厦门市岛内芒果[Mangifera indica L.（Anacardiaceae）]行道树上首次发现[3-4]，寄主专一性强，只为害芒果树，为害严重的每个叶片可达到500多个虫瘿数，受害植株叶片受害率常达100%。2003年通过成虫形态描述，由李军等鉴定为新种Procontarinia robusta Li，Bu & Zhang， 2003[5]，属双翅目（Diptera），瘿蚊科（Cecidomyiidae），普瘿蚊属（Procontarinai Kieffer & Ceeconi）。近几年在福建省扩散趋势逐年增加，导致芒果园产量降低，果树生长发育受阻，芒果壮铗普瘿蚊是否是新种或者为入侵害虫值得商榷。因此通过现有历史资料比较虫瘿与瘿蚊成虫形态描述，发现与早先报道的东南亚地区印度、印度尼西亚、东帝汶发生的P. matteiana Kieffer & Cecconi物种相同[6-7]。早在一个多世纪之前就有文献对该虫命名。此外虫瘿形态与瘿蚊物种一一对应关系在很多物种上得到验证[1]，不同的物种导致虫瘿形态不同，虽然瘿蚊的形态肉眼很难观察，但虫瘿的形态肉眼非常容易判断从而推断瘿蚊种类，本文从虫瘿形态特征、幼虫、蛹的生物学特性，以及线粒体COⅠⅠ基因来阐述该虫P. robusta应与P. matteianan的同种异名。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 昆虫采集 以芒果壮铗普瘿蚊成虫为试验虫源，根据该虫的地理分布和文献查询，选用福建省5个地理种群和东南亚东帝汶种群进行分析（表1）。采集芒果树上即将羽化的虫瘿叶片，枝条末端棉花加水包裹保湿，放入密封袋内，待羽化后收集放入无水酒精离心管中，写好采集标签，-20 ℃保存备用。东帝汶岛瘿蚊物种（P. matteiana）由Peter Kolesik博士提供。
1.1.2 电镜扫描系统 扫描电镜型号：TM-1000 SEM（Tokyo， Japan）。用镊子在解剖镜下细心拨开虫瘿，挑取幼虫、蛹待用，从密封袋取出刚羽化的雌雄各3头，置于蒸馏水中清洗后，经过乙醇脱水，自然干燥，用导电胶粘于扫描电镜样台上，喷金，在电镜下观察，加速电压10 kV。 1.2 方法
1.2.1 DNA提取、PCR扩增及测序 COⅠ基因序列片段（488 bp）提取技术参考Kolesik等的方法[8]，总DNA提取采用DNA提取试剂盒（购自TaKaRa宝生物工程（大连）生物工程有限公司）。每个地理种群各取3只，每只分别提取DNA，PCR扩增纯化及测序，重复3次。引物为：5′-GGATCACCTGAT
ATAGCATTCCC-3′（COIS）。5′-CCCGGTAAAATTAA
AATATAAACTTC-3′（COIA）[9]。PCR反应体系为50 μL：dNTP Mixture（10 mmol/L）1 μL，10×Easy TaqTM Polymerase Buffer（includes 20 mmol/L MgCl2）5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各2.0 μL，Easy TaqTM DNA Polymerase（5 U/μL）0.6 μL，模板DNA 6 μL，加灭菌双蒸水（DDW）至终体积。PCR反应程序：95 ℃预变性3 min；94 ℃变性45 s，52℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35个循环；最后72 ℃延伸10 min。PCR产物的克隆与测序委托大连宝生物工程公司完成。
1.2.2 数据处理 利用Chroms软件读取测序结果，利用DNAMAN软件进行拼接及同源性比较，利用MEGA 4.0软件计算种群内及种群件的遗传距离，并将序列在NCBI上进行比对。
2 结果与分析
2.1 虫瘿形态特征
成虫产卵于叶背，幼虫孵化后侵入叶肉，刺激叶肉在叶片正面形成圆柱形凸起，而叶背几乎观察不到任何症状，随着幼虫的虫龄增加虫瘿增大，虫瘿颜色由乳白色逐渐变成淡黄色、深绿色、最后形成坚硬的黑色虫瘿（图1、2）。幼虫在虫瘿内生长化蛹，生长后期虫瘿顶端形成深褐色圆形盖子，瘿蚊羽化时破壳而出（图3）。成熟虫瘿直径约为0.5 mm，高度为1～2 mm（图4）。瘿蚊害虫具有显著的为害特征专一性，即特定物种与其形成的虫瘿形态一一对应[1]。Kieffer等将该虫命名为Procontarinia matteianan[10]。Mani曾描述印度芒果树上该虫虫瘿的特征，书中展示的图238#与厦门本地形态一致[6]。
2.2 卵、幼虫形态特征
卵肉眼基本不可见，产卵于叶背，直径约为0.14～0.15 mm[11]。幼虫淡黄色，一共3龄，1龄体长0.15～0.60 mm，2龄体长0.60～1.00 mm，3龄体长1.00～2.10 mm[11]。幼虫无头无足型，头部圆锥形缩入体内，胸部3节，2龄幼虫可见第一胸节腹面有一红褐色三叉戟状剑骨片，腹部9节，各一对气门，腹部侧面有明显的刺突性鳞片（图5）。
2.3 成虫形态特征
成虫描述见李军等[5]及Cai等[2]（图6）的报道：雄虫体长具有淡黄色腹部有三条平行的深棕色盾片。触角鞭节和腹部均稀疏的覆盖刚毛。雌雄个体微小，翅展后翅长为1.40～1.90 mm。雄虫触角12+2，鞭节为双节型，每个鞭节近球形，由一圈环丝和一圈长刚毛组成（图7）。
雌虫触角鞭节筒状，基部着生一圈短粗刚毛，中部由一圈波浪状环丝缠绕在各结节（图7）。产卵器极短，唇片状，末端着生一圈长刚毛，其余地方短毛覆盖（图8），雄虫具有强壮的钳状抱握器，中间为管状阳茎（图8）。其形态描述特征与Kieffer描述一致[10]。
2.4 COⅠ基因DNA比对
扩增所得的COⅠ基因序列长度为488 bp左右，与预期的产物大小相近（图9）。将所得序列进行拼接校对，在NCBI网站上进行BLAST比对，结果显示，所测的序列与昆虫mtDNA COⅠ基因（瘿蚊科，普瘿蚊属等）具有很高的同源性（84%～100%），因此可以确定测定的序列为COⅠ基因序列。不同地理种群瘿蚊COⅠ基因可清楚判读区域为488 bp。
对不同地理种群的序列进行对比，得到同源性的比较值（表2）。从表2可知，东帝汶、福州、厦门集美、泉州和漳州地区的芒果壮铗普瘿蚊同源性100%，可以确定P. robusta与P. matteiana为同一物种。与厦门思明地区的芒果壮铗普瘿蚊仅有2个碱基差异，同源性也校高，外在NCBI上选择同属于普瘿蚊属的2个物种比对，与澳洲P. pustulata和日本物种P. mangicola相比，同源性为83.20%～85.45%。可以确定本试验虫种与P. pustulata和P. mangicola并非同一个物种。
3 讨论与结论
由于瘿蚊的个体非常微小，分类鉴定非常困难，但是瘿蚊的瘿壳特殊专一性是区别的主要依据，也就是说每个瘿蚊物种的瘿壳形态构造差异很大，可作为主要分类依据之一，虽然前人对瘿蚊的成虫形态有详细的描述，但是本文结合电镜图片，更加清晰直观从瘿蚊的为害特性、虫瘿特征、瘿蚊各个虫态生物学特性进一步验证了芒果壮铗普瘿蚊P. robusta与P. matteiana为同物异名，通过分子生物学技术测序COⅠ基因片段，两者的同源性为99.59%，其中东帝汶岛与福州、漳州、泉州的地理种群为100%，进一步验证2个物种为同物异名。Cai等测定显示P. robusta与东帝汶P. matteiana的 COⅠ基因一致[2]。因此笔者认为P. robusta与P.matteianan应为同物异名。通过线粒体COⅠ基因比对，确定了东帝汶与国内种群分子水平上没有差异性。
参考文献
[1] Gagné R J. Update for a catalog of the Cecidomyiidae of the world[OL]. http：//www.ars.usda.gov/SP2UserFiles/Place/12754100/Gagne_2010_World_Catalog_Cecidomyiidae.pdf]. Accessed on 2010. 10/08/2011. [2] Cai H J， Kolesik P， Wang H Y， et al. Description of the immature stages and gall morpholgy， and molecular characterisation of Procontarinia robusta， a gall midge（Diptera： Cecidomyiidae）damaging leaves of mango Mangifera indica L.（Anarcadiaceae）in southern Asia[J]. Aust J Entomol， 2013， 52： 206-211.
[3] 张清源， 林振基， 王宏毅， 等.一种新的危害芒果树叶的瘿蚊害虫[J]. 华东昆虫学报， 2003， 12（2）： 107-109.
[4] 苏燕苹， 张万旗， 王 谨， 等.芒果壮铗普瘿蚊在厦门危害情况及化学防治研究[J]. 福建热作科技， 2006， 31（3）： 1-3.
[5] 李 军， 卜文俊， 张清源. 危害芒果叶片的瘿蚊科——中国新纪录和一新种[J]. 动物分类学报， 2003， 28（1）： 148-151.
[6] Mani M S. Cecidotherca Indica[J]. Agra University J Res（Science）， 1959， 8： 91-279.
[7] Docters van Leeuwen-Reijnvaan J， Docters van Leeuwen W M. The zoocecidia of the Netherlands East Indies[M]. Batavia： Drukkerij de Unie， 1926： 324.
[8] Kolesik P， Rice A D， Bellis G A， et al. Procontarinia pustulata， a new gall midge species（Diptera： Cecidomyiidae）feeding on mango， Mangifera indica（Anarcadiaceae）， in northern Australia and Papua New Guinea[J]. Aust J Entomol， 2009， 48（4）： 310-316.
[9] Yukawa J， Uechi N， Horikiri M， et al. Description of the soybean pod gall midge， Asphondylia yushimai sp. n.（Diptera： Cecidomyiidae）， a major pest of soybean and findings of host alternation[J]. B Entomol Res， 2003， 93： 76-86.
[10] Kieffer J J. Description de galles et d'insectes gallicoles d'Asie[J]. Marcellia， 1909， 7： 149-167.
[11] 王伟新， 王宏毅.芒果壮铗普瘿蚊生物学初报[J]. 福建农业学报， 2005， 20（2）： 74-76.
责任编辑：赵军明