论文部分内容阅读
烟草作为一种重要的叶用经济作物，叶色是反映其生长发育、生理状态的标志，尤其是成熟度。烟草中发现许多叶色突变体[1]，其种类主要包括白肋、灰黄、紫色和黄铜色等变异，其性状可能由一对基因或多对基因共同控制[2-3]。张兴伟等[4]分析认为，叶绿素含量是数量性状，易受环境影响；第一青果期烤烟叶绿素含量的遗传受一对加性-显性主基因+加性-显性-上位性多基因控制。白肋烟的叶绿素含量为正常绿色型的1/3，由两对连锁的隐性核基因控制[5-6]。灰黄型叶色，其叶绿素含量为正常绿色型的1/2，由显性单基因控制。黄绿型叶色由1对隐性基因控制[7]。紫色叶色突变是由位于B染色体上的显性基因“R”控制的[8]；橘红色叶色的形成受隐性单基因控制，而红铜色叶色由两对隐性重叠基因共同控制[9]。
调控烟草叶色突变的基因分子机制较为复杂，主要分为以下几类途径：叶绿素生物合成及分解途径；蛋白转运和定位相关基因；光呼吸途径；嘧啶从头合成途径。突变基因可直接或间接干扰叶绿素的合成及稳定。
1 四吡咯生物合成途径相关基因
叶绿素和血红素是四吡咯途径的主要终产物，植物中叶绿素合成途径中包含20多个基因编码的16 种酶，目前在烟草中鉴定获得数个基因参与阻断四吡咯生物合成途径。
谷氨酰-tRNA还原酶（GluTR）是其中一个重要的酶，将谷氨酰-tRNA转化成谷氨酸-1-半醛，随后通过谷氨酸-1-半醛氨基转移酶（GSA-AT）形成5-氨基乙酰丙酸（5-ALA），而5-ALA是生物合成叶绿素等四吡咯化合物的前体物和限速点。Lein等[10]（2008）发现转基因烟草内源性谷氨酰-tRNA还原酶hemA基因共抑制作用导致烟草叶绿素缺陷、叶片坏死和生长迟缓等现象。
GSA-AT催化谷氨酸酯转化为δ-氨基酮戊酸酯的最后一步。H?fgen等（1994）[11]和Lein等[10]（2008）分别利用反义RNA和正义cDNA片段抑制实验表明，GSA-AT是四吡咯途径中合成δ-氨基酮戊酸盐所必需的，GSA-AT表达抑制会导致植株严重受损，转基因烟草发生色素丢失现象，尤其是叶脉部位色素丢失严重。
四吡咯生物合成途径的第四步是在胆色素原脱氨酶（PBDG）作用下，由4分子的胆色素原合成羟甲基胆素。烟草P_1516转基因株系中的一段cDNA序列与拟南芥pbdg基因同源，将该cDNA序列转入烟草中发现，转基因植株表现色素减少，并伴有生长发育迟缓，证明pbdg基因在烟草生长中同样是必需的基因[10]。
镁原卟啉IX螯合酶（镁螯合酶）位于四吡咯生物合成的分支点，由CHLD，CHLI和CHLH三个亚基组成。其中，CHLI和CHLH之前已在烟草中进行过反义沉默研究[12-13]。CHLH沉默植株表现为叶绿素缺失[10，12]。Shimura等[14]（2011）发现在病毒侵染的植物中，病毒卫星RNA能够与镁原卟啉螯合酶亚单位I基因（ChlI）mRNA 一段特异的22-nt序列互补，Y-sat基因抑制了参与叶绿体合成关键基因ChlI的反应机制，进而导致烟草叶片发黄[14]。
叶绿素合成的最后步骤是通过叶绿素合成酶催化叶绿素酸酯为叶绿素a。叶绿素合成酶反应所必需的
叶绿基焦磷酸是由香叶酰还原酶（CHLP）催化香叶基焦磷酸得到的。抑制CHLP 基因的转基因烟草植株表现出不同程度的失绿 [10，15]。
2 叶绿体相关蛋白基因
蛋白水解活性ClpP亚基对于烟草Clp的功能是必需的。目前，基于表达序列标签和基因沉默技术，已获得大量与叶绿体功能有关的表型变异，如光合作用、CO2固定或叶绿体发育。Lein等[10]（2008）发现，烟草中与拟南芥核编码的Clp蛋白酶亚基ClpP5和ClpP6高度同源的基因受到抑制后，其株系叶子严重发白，生长也受到强烈抑制；烟草ClpRI和ClpR4基因表达下调可以致使转基因烟草表型发生显著变异，这些亚基似乎对Clp的功能也很重要。
alb3蛋白是至少两种叶绿体结合蛋白插入到类囊体膜上所必需的[16]。alb3同源基因受到抑制的烟草突变株系表现为叶片微黄色甚至白色。
叶片中叶绿体的主要功能是进行光合作用和固定CO2，为植物的生长发育提供能量。烟草叶绿体ATP合酶的γ亚基抑制株系因光合作用受阻导致色素缺陷表型[17]。铁氧还蛋白NADP+-氧化还原酶（FNR）的反义抑制会因为光合作用下降而导致植物发育迟缓[10]。
两个基因核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶（RuBisCO）和景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶（SBP）编码的蛋白参与卡尔文循环。Quick等[18]（1991）和Harrison等[19]（1998）分别通过反向抑制手段表明，RuBisCO和SBP转基因烟草植株有很明显的表型变化。
3 光呼吸相关基因
植物线粒体中，甘氨酸脱羧酶（GDC）中两个亚基和丝氨酸羟甲基转移酶（SHMT）参与光呼吸甘氨酸转化为丝氨酸的过程。烟草中甘氨酸脱羧酶（GDC）的P蛋白亚基抑制会降低光合作用并阻碍生长。烟草GDC非酶H蛋白亚基抑制后叶片显现萎黄脉络和轻微生长迟缓，表明H-蛋白的表达水平对于发挥GDC功能至关重要[10]。甘氨酸脱羧酶反应产生大量的细胞毒性代谢产物氨，通过质体上的谷氨酰胺合成酶（GS2）催化转化为谷氨酰胺进行无害处理。转基因烟草的GS2反义抑制能够导致坏死性病变，并最终因氨积累而死亡[20]。SHMT基因表达抑制，能够使色素减少和光合作用速率下降，引起烟草植株生长迟缓和叶片灰色，表明SHMT强烈影响光呼吸作用 [10]。
4 嘧啶从头合成途径
嘧啶从头合成中的乳清酸途径是指由氨甲酰磷酸、天冬氨酸和磷酸焦磷酸形成尿苷-5-单磷酸（UMP）的过程[21]。氨甲酰磷酸合成酶（CPSaseLU）是催化嘧啶从头合成的初始步骤；尿苷-5-单磷酸合酶（UMPS）是具有双功能的催化酶，参与嘧啶的从头合成途径最后两步。Lein等（2008）通过筛选分别从转基因烟草株系P_3044和E_18965中发现CPSaseLU和UMPS两种酶。株系P_3044表现严重的网纹褪绿和发育迟缓。植株中表达cDNA插入大亚基片段与CPSaseLU序列相似。E_18965株系表达cDNA序列与UMPS序列相似，植株表现色素丢失，叶缘坏死性损伤症状[10]。 5 展望
烟草是收获叶片的特殊经济作物，调控叶色代谢途径可以创造出优良的生产性状。在卷烟工业中，白肋烟具有香气独特、组织疏松、填充性强和良好的调和香气与吃味，是混合型卷烟的重要原料[22]。黄叶突变体基因能够促进烟叶成熟，提高烟叶成熟的集中度，可以用于培育一次或者两次成熟的烟草新品种[23]。
烟草中的质体色素对烟草的生长发育、成熟烘烤和香气量具有显著的影响[24]。目前，从EMS诱变和T-DNA插入的烟草突变体库中已经获得了大量的叶色突变体。伴随着烟草基因组测序的完成以及叶色相关基因调控机制的研究深入，将加快叶色相关基因在烟草分子育种中的应用。
参考文献
[1] Bae C H， Abe T， Matsuyama T， et al. Regulation of chloroplast gene expression is affected in “ali”， a novel tobacco albino mutant[J]. Ann Bot， 2001， 88（4）： 545-553.
[2] Leon P， Arroyo A， Mackenzie S. Nuclear control of plastid and mitochondrial development in higher plants[J]. Ann Rev Plant Physiol Mol Biol， 1998， 49： 453-480.
[3] Monde R A， Zito F， Olive J， et al. Post-transcriptional defects in tobacco chloroplast mutants lacking the cytochrome b6/f complex[J]. Plant J， 2000， 21（1）： 61-72.
[4]张兴伟，王志德，牟建民，等. 烤烟叶绿素含量遗传分析[J].中国烟草学报，2011，17（3）：48-52.
[5] Henika F S. The inheritance of the White Burley character in tobacco[J]. J Agric Res， 1932， 44： 477-493.
[6] Wu Q Z， Wu X R， Zhang X F， et al. Mapping of two white stem genes in tetraploid common tobacco （Nicotiana tabacum L.）[J]. Mol Breeding， 2014， 34（3）： 1065-1074.
[7] 佟道儒. 烟草育种学[ M] . 北京：中国农业出版社，1997.
[8] 丁巨波. 烟草育种学[ M]. 北京：农业出版社，1976.
[9] 杨铁钊. 烟草育种学[ M]. 北京：中国农业出版社，2011.
[10] Lein W， Usadel B， Stitt M， et al. Large-scale phenotyping of transgenic tobacco plants （Nicotiana tabacum） to identify essential leaf functions[J]. Plant Biotechnol J， 2008， 6： 246-263.
[11] H?fgen R， Axelsen K B， Kannangara C G， et al. A visible marker for antisense mRNA expression in plants： inhibition of chlorophyII synthesis with a glutamate-1-semialdehyde aminotransferase antisense gene[J]. Proc Nati Acad Sci USA， 1994， 91： 1726-1730.
[12] Papenbrock J， Mock H P， Tanaka R， et al. Role of magnesium chelatase activity in the early steps of the tetrapyrrole biosynthetic pathway[J]. Plant Physiol， 2000a， 122： 1161-1169.
[13] Papenbrock J， Pfundel E， Mock H P， et al. Decreased and increased expression of the subunit CHL I diminishes Mg chelatase activity and reduces chlorophyll synthesis in transgenic tobacco plants[J]. Plant J， 2000b， 22： 155-164.
[14] Shimura H， Pantaleo V， Ishihara T， et al. A viral satellite RNA induces yellow symptoms on tobacco by targeting a gene involved in chlorophyll biosynthesis using the RNA silencing machinery[J]. Plos Pathog， 2011， 7（5）： e1002021.
[15] Tanaka R， Oster U， Kruse E， et al. Reduced activity of geranylgeranyl reductase leads to loss of chlorophyll and tocopherol and to partially geranylgeranylated chlorophyll in transgenic tobacco plants expressing antisense RNA for geranylgeranyl reductase[J]. Plant Physiol， 1999， 120： 695-704. [16] Woolhead C A， Thompson S J， Moore M， et al. Distinct Albino3-dependent and -independent pathways for thylakoid membrane protein insertion[J]. J Biol Chem， 2011， 276： 40841-40846.
[17] Larsson K H， Napier J A， Gray J C. Import and processing of the precursor form of the gamma subunit of the chloroplast ATP synthase from tobacco[J]. Plant Mol Biol， 1992， 19： 343-349.
[18] Quick W P， Schurr U， Fichtner K， et al. The impact of decreased Rubisco on photosynthesis， growth， allocation and storage in tobacco plants which have been transformed with antisense rbcS[J]. Plant J， 1991， 1： 51-58.
[19] Harrison E P， Willingham N M， Lloyd J C， et al. Reduced sedoheptulose-1，7-bisphosphatase levels in transgenic tobacco lead to decreased photosynthetic capacity and altered carbohydrate accumulation[J]. Planta， 1998， 204： 27-36.
[20] Migge A， Becker T W. Greenhouse-grown conditionally lethal tobacco plants obtained by expression of plastidic glutamine synthetase antisense RNA may contribute to biological safety[J]. Plant Sci， 2000， 153： 107-112.
[21] Zrenner R， Stitt M， Sonnewald U， et al. Pyrimidine and purine biosynthesis and degradation in plants[J]. Annu Rev Plant Biol， 2006， 57： 805-836.
[22] 何冰，刘玲珑，张文伟，等. 植物叶色突变体[J]. 植物生理学通讯，2006，42（1）：1-9.
[23] 陈春艳，刘仁祥，聂琼，等. 突变体黄叶性状基因对烟叶集中成熟的影响[J]. 江西农业学报，2011，23（3）：106-108.
[24] 邵慧芳，李爱军，代慧娟，等. 烟草质体色素研究进展[J]. 中国农学通报，2007，23（12）：128-132.
调控烟草叶色突变的基因分子机制较为复杂，主要分为以下几类途径：叶绿素生物合成及分解途径；蛋白转运和定位相关基因；光呼吸途径；嘧啶从头合成途径。突变基因可直接或间接干扰叶绿素的合成及稳定。
1 四吡咯生物合成途径相关基因
叶绿素和血红素是四吡咯途径的主要终产物，植物中叶绿素合成途径中包含20多个基因编码的16 种酶，目前在烟草中鉴定获得数个基因参与阻断四吡咯生物合成途径。
谷氨酰-tRNA还原酶（GluTR）是其中一个重要的酶，将谷氨酰-tRNA转化成谷氨酸-1-半醛，随后通过谷氨酸-1-半醛氨基转移酶（GSA-AT）形成5-氨基乙酰丙酸（5-ALA），而5-ALA是生物合成叶绿素等四吡咯化合物的前体物和限速点。Lein等[10]（2008）发现转基因烟草内源性谷氨酰-tRNA还原酶hemA基因共抑制作用导致烟草叶绿素缺陷、叶片坏死和生长迟缓等现象。
GSA-AT催化谷氨酸酯转化为δ-氨基酮戊酸酯的最后一步。H?fgen等（1994）[11]和Lein等[10]（2008）分别利用反义RNA和正义cDNA片段抑制实验表明，GSA-AT是四吡咯途径中合成δ-氨基酮戊酸盐所必需的，GSA-AT表达抑制会导致植株严重受损，转基因烟草发生色素丢失现象，尤其是叶脉部位色素丢失严重。
四吡咯生物合成途径的第四步是在胆色素原脱氨酶（PBDG）作用下，由4分子的胆色素原合成羟甲基胆素。烟草P_1516转基因株系中的一段cDNA序列与拟南芥pbdg基因同源，将该cDNA序列转入烟草中发现，转基因植株表现色素减少，并伴有生长发育迟缓，证明pbdg基因在烟草生长中同样是必需的基因[10]。
镁原卟啉IX螯合酶（镁螯合酶）位于四吡咯生物合成的分支点，由CHLD，CHLI和CHLH三个亚基组成。其中，CHLI和CHLH之前已在烟草中进行过反义沉默研究[12-13]。CHLH沉默植株表现为叶绿素缺失[10，12]。Shimura等[14]（2011）发现在病毒侵染的植物中，病毒卫星RNA能够与镁原卟啉螯合酶亚单位I基因（ChlI）mRNA 一段特异的22-nt序列互补，Y-sat基因抑制了参与叶绿体合成关键基因ChlI的反应机制，进而导致烟草叶片发黄[14]。
叶绿素合成的最后步骤是通过叶绿素合成酶催化叶绿素酸酯为叶绿素a。叶绿素合成酶反应所必需的
叶绿基焦磷酸是由香叶酰还原酶（CHLP）催化香叶基焦磷酸得到的。抑制CHLP 基因的转基因烟草植株表现出不同程度的失绿 [10，15]。
2 叶绿体相关蛋白基因
蛋白水解活性ClpP亚基对于烟草Clp的功能是必需的。目前，基于表达序列标签和基因沉默技术，已获得大量与叶绿体功能有关的表型变异，如光合作用、CO2固定或叶绿体发育。Lein等[10]（2008）发现，烟草中与拟南芥核编码的Clp蛋白酶亚基ClpP5和ClpP6高度同源的基因受到抑制后，其株系叶子严重发白，生长也受到强烈抑制；烟草ClpRI和ClpR4基因表达下调可以致使转基因烟草表型发生显著变异，这些亚基似乎对Clp的功能也很重要。
alb3蛋白是至少两种叶绿体结合蛋白插入到类囊体膜上所必需的[16]。alb3同源基因受到抑制的烟草突变株系表现为叶片微黄色甚至白色。
叶片中叶绿体的主要功能是进行光合作用和固定CO2，为植物的生长发育提供能量。烟草叶绿体ATP合酶的γ亚基抑制株系因光合作用受阻导致色素缺陷表型[17]。铁氧还蛋白NADP+-氧化还原酶（FNR）的反义抑制会因为光合作用下降而导致植物发育迟缓[10]。
两个基因核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶（RuBisCO）和景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶（SBP）编码的蛋白参与卡尔文循环。Quick等[18]（1991）和Harrison等[19]（1998）分别通过反向抑制手段表明，RuBisCO和SBP转基因烟草植株有很明显的表型变化。
3 光呼吸相关基因
植物线粒体中，甘氨酸脱羧酶（GDC）中两个亚基和丝氨酸羟甲基转移酶（SHMT）参与光呼吸甘氨酸转化为丝氨酸的过程。烟草中甘氨酸脱羧酶（GDC）的P蛋白亚基抑制会降低光合作用并阻碍生长。烟草GDC非酶H蛋白亚基抑制后叶片显现萎黄脉络和轻微生长迟缓，表明H-蛋白的表达水平对于发挥GDC功能至关重要[10]。甘氨酸脱羧酶反应产生大量的细胞毒性代谢产物氨，通过质体上的谷氨酰胺合成酶（GS2）催化转化为谷氨酰胺进行无害处理。转基因烟草的GS2反义抑制能够导致坏死性病变，并最终因氨积累而死亡[20]。SHMT基因表达抑制，能够使色素减少和光合作用速率下降，引起烟草植株生长迟缓和叶片灰色，表明SHMT强烈影响光呼吸作用 [10]。
4 嘧啶从头合成途径
嘧啶从头合成中的乳清酸途径是指由氨甲酰磷酸、天冬氨酸和磷酸焦磷酸形成尿苷-5-单磷酸（UMP）的过程[21]。氨甲酰磷酸合成酶（CPSaseLU）是催化嘧啶从头合成的初始步骤；尿苷-5-单磷酸合酶（UMPS）是具有双功能的催化酶，参与嘧啶的从头合成途径最后两步。Lein等（2008）通过筛选分别从转基因烟草株系P_3044和E_18965中发现CPSaseLU和UMPS两种酶。株系P_3044表现严重的网纹褪绿和发育迟缓。植株中表达cDNA插入大亚基片段与CPSaseLU序列相似。E_18965株系表达cDNA序列与UMPS序列相似，植株表现色素丢失，叶缘坏死性损伤症状[10]。 5 展望
烟草是收获叶片的特殊经济作物，调控叶色代谢途径可以创造出优良的生产性状。在卷烟工业中，白肋烟具有香气独特、组织疏松、填充性强和良好的调和香气与吃味，是混合型卷烟的重要原料[22]。黄叶突变体基因能够促进烟叶成熟，提高烟叶成熟的集中度，可以用于培育一次或者两次成熟的烟草新品种[23]。
烟草中的质体色素对烟草的生长发育、成熟烘烤和香气量具有显著的影响[24]。目前，从EMS诱变和T-DNA插入的烟草突变体库中已经获得了大量的叶色突变体。伴随着烟草基因组测序的完成以及叶色相关基因调控机制的研究深入，将加快叶色相关基因在烟草分子育种中的应用。
参考文献
[1] Bae C H， Abe T， Matsuyama T， et al. Regulation of chloroplast gene expression is affected in “ali”， a novel tobacco albino mutant[J]. Ann Bot， 2001， 88（4）： 545-553.
[2] Leon P， Arroyo A， Mackenzie S. Nuclear control of plastid and mitochondrial development in higher plants[J]. Ann Rev Plant Physiol Mol Biol， 1998， 49： 453-480.
[3] Monde R A， Zito F， Olive J， et al. Post-transcriptional defects in tobacco chloroplast mutants lacking the cytochrome b6/f complex[J]. Plant J， 2000， 21（1）： 61-72.
[4]张兴伟，王志德，牟建民，等. 烤烟叶绿素含量遗传分析[J].中国烟草学报，2011，17（3）：48-52.
[5] Henika F S. The inheritance of the White Burley character in tobacco[J]. J Agric Res， 1932， 44： 477-493.
[6] Wu Q Z， Wu X R， Zhang X F， et al. Mapping of two white stem genes in tetraploid common tobacco （Nicotiana tabacum L.）[J]. Mol Breeding， 2014， 34（3）： 1065-1074.
[7] 佟道儒. 烟草育种学[ M] . 北京：中国农业出版社，1997.
[8] 丁巨波. 烟草育种学[ M]. 北京：农业出版社，1976.
[9] 杨铁钊. 烟草育种学[ M]. 北京：中国农业出版社，2011.
[10] Lein W， Usadel B， Stitt M， et al. Large-scale phenotyping of transgenic tobacco plants （Nicotiana tabacum） to identify essential leaf functions[J]. Plant Biotechnol J， 2008， 6： 246-263.
[11] H?fgen R， Axelsen K B， Kannangara C G， et al. A visible marker for antisense mRNA expression in plants： inhibition of chlorophyII synthesis with a glutamate-1-semialdehyde aminotransferase antisense gene[J]. Proc Nati Acad Sci USA， 1994， 91： 1726-1730.
[12] Papenbrock J， Mock H P， Tanaka R， et al. Role of magnesium chelatase activity in the early steps of the tetrapyrrole biosynthetic pathway[J]. Plant Physiol， 2000a， 122： 1161-1169.
[13] Papenbrock J， Pfundel E， Mock H P， et al. Decreased and increased expression of the subunit CHL I diminishes Mg chelatase activity and reduces chlorophyll synthesis in transgenic tobacco plants[J]. Plant J， 2000b， 22： 155-164.
[14] Shimura H， Pantaleo V， Ishihara T， et al. A viral satellite RNA induces yellow symptoms on tobacco by targeting a gene involved in chlorophyll biosynthesis using the RNA silencing machinery[J]. Plos Pathog， 2011， 7（5）： e1002021.
[15] Tanaka R， Oster U， Kruse E， et al. Reduced activity of geranylgeranyl reductase leads to loss of chlorophyll and tocopherol and to partially geranylgeranylated chlorophyll in transgenic tobacco plants expressing antisense RNA for geranylgeranyl reductase[J]. Plant Physiol， 1999， 120： 695-704. [16] Woolhead C A， Thompson S J， Moore M， et al. Distinct Albino3-dependent and -independent pathways for thylakoid membrane protein insertion[J]. J Biol Chem， 2011， 276： 40841-40846.
[17] Larsson K H， Napier J A， Gray J C. Import and processing of the precursor form of the gamma subunit of the chloroplast ATP synthase from tobacco[J]. Plant Mol Biol， 1992， 19： 343-349.
[18] Quick W P， Schurr U， Fichtner K， et al. The impact of decreased Rubisco on photosynthesis， growth， allocation and storage in tobacco plants which have been transformed with antisense rbcS[J]. Plant J， 1991， 1： 51-58.
[19] Harrison E P， Willingham N M， Lloyd J C， et al. Reduced sedoheptulose-1，7-bisphosphatase levels in transgenic tobacco lead to decreased photosynthetic capacity and altered carbohydrate accumulation[J]. Planta， 1998， 204： 27-36.
[20] Migge A， Becker T W. Greenhouse-grown conditionally lethal tobacco plants obtained by expression of plastidic glutamine synthetase antisense RNA may contribute to biological safety[J]. Plant Sci， 2000， 153： 107-112.
[21] Zrenner R， Stitt M， Sonnewald U， et al. Pyrimidine and purine biosynthesis and degradation in plants[J]. Annu Rev Plant Biol， 2006， 57： 805-836.
[22] 何冰，刘玲珑，张文伟，等. 植物叶色突变体[J]. 植物生理学通讯，2006，42（1）：1-9.
[23] 陈春艳，刘仁祥，聂琼，等. 突变体黄叶性状基因对烟叶集中成熟的影响[J]. 江西农业学报，2011，23（3）：106-108.
[24] 邵慧芳，李爱军，代慧娟，等. 烟草质体色素研究进展[J]. 中国农学通报，2007，23（12）：128-132.