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摘 要：本文采用高效液相测定了双丹颗粒中丹酚酸B、丹参酮ⅡA、丹皮酚的含量，固定相为：安捷伦Cl8（4.6mm×250mm，5um），甲醇-乙腈-甲酸-水（15：3：1：81）为流动相，检测波长为286nm；丹酚酸B在0.2～12mg·mL-1范围内呈良好的线性关系；丹参酮ⅡA在0.02～1.2mg·mL-1范围内呈良好的线性关系；丹皮酚在0.1～6mg·mL-1范圍内呈良好的线性关系。丹酚酸B、丹参酮ⅡA、丹皮酚的平均回收率分别为99.5%、99.6%、99.3%，RSD分别为0.82%、0.76%、0.66%。此方法简便、准确、重现性好，可用于双丹颗粒中丹酚酸B、丹参酮ⅡA、丹皮酚的含量测定。
关键词：双丹颗粒；丹皮酚；含量
双丹颗粒为黄褐色的颗粒，气芳香，味微苦，具有活血化瘀，通络止痛的功效。双丹颗粒常用于心血瘀阻所致胸痹心痛。双丹颗粒通过麻醉犬正常心脏血流动力学及心肌耗氧量实验，可显著增加冠脉血流量、扩张冠脉血管、改善心肌的供血、对缺血的心肌有保护作用。丹参具有改善血液循环、抗菌、抗炎、抗氧化、抗凝血和细胞保护等作用[1-8]。本实验采用高效液相色谱法对双丹颗粒中的丹酚酸B、丹参酮ⅡA、丹皮酚的进行了含量测定。
1 仪器与试药
BL10-250C双频加热型超声波清洗器（天津市恒奥科技发展有限公司）；EX1600四元低压梯度液相色谱仪（南京科捷分析仪器有限公司）；Histoon Lab I-05实验室超纯水器（科尔顿（中国）有限公司）；奥豪斯Explorer专业型分析天平（奥豪斯仪器上海有限公司）；JΜLABO TW系列通用水浴槽（优莱博技术（北京）有限公司）；IKA RV10 数显型旋转蒸仪（广州仪科实验室技术有限公司）；TU-1901 双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）。丹酚酸B、丹参酮ⅡA、丹皮酚对照品由中国药品生物制品检定所提供。乙腈、甲醇为色谱纯，其他试药均为分析纯，水为蒸馏水。
2 含量测定
2.1 色谱条件：依据查阅文献及考查的结果[9-12]，确定色谱条件如下：色谱柱为安捷伦Cl8规格为（4.6mm×250mm，5um）；甲醇-乙腈-甲酸-水（15：3：1：81）为流动相；检测波长为286nm；流速1.0mL·min-1；柱温：30℃。理论板数按丹酚酸B峰计算应不得低于2000。
2.2 供试品溶液的制备
取双丹颗粒适量，研细，精密称取，置50mL量瓶中，加流动相适量，超声处理10分钟使溶解，放置至室温，加流动相稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45μm）滤过，即得。
2.3 对照品溶液的制备
分别精密称取丹酚酸B、丹参酮ⅡA、丹皮酚对照品约5mg、0.5mg、2mg，置10mL容量瓶中，用加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
2.4 阴性干扰试验
在处方中去丹参，制成阴性对照溶液，用以上选定的测定条件进行吸收曲线绘制，观察在与丹酚酸B、丹参酮ⅡA、丹皮酚相同的保留时间处是否存在吸收峰，结果表明：在选定条件下测得的阴性液吸收曲线在与丹酚酸B、丹参酮ⅡA、丹皮酚相同保留时间处不存在吸收峰，因此说明选定的条件测定丹酚酸B、丹参酮ⅡA、丹皮酚无干扰，具有较强的专属性。
2.5 标准曲线的制备
制备浓度为0.2mg·mL-1、0.4mg·mL-1、0.6mg·mL-1、0.8mg·mL-1、1.0mg·mL-1、1.2mg·mL-1的丹酚酸B对照品溶液，制备浓度为0.02mg·mL-1、0.04mg·mL-1、0.06mg·mL-1、0.08mg·mL-1、0.10mg·mL-1、0.12mg·mL-1的丹参酮ⅡA对照品溶液，制备浓度为0.01mg·mL-1、0.02mg·mL-1、0.03mg·mL-1、0.04mg·mL-1、0.05mg·mL-1、0.06mg·mL-1的丹皮酚对照品溶液。分别按丹酚酸B、丹参酮ⅡA、丹皮酚的测定参数继续测定。以峰面积积分值A（μg）为横坐标，进样量为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。试验表明，丹酚酸B在0.2～12mg·mL-1范围内呈良好的线性关系；丹参酮ⅡA在0.02～1.2mg·mL-1范围内呈良好的线性关系；丹皮酚在0.1～6mg·mL-1范围内呈良好的线性关系。
2.6 精密度试验
依照2.3项下制备对照品溶液，精密吸取丹酚酸B、丹参酮ⅡA、丹皮酚对照品溶液10μL重复进样6次，测定峰面积积分值，对照品峰面积积分值的RSD分别为0.55%、0.63%、0.65%。结果表明，本实验精密度良好。
2.7 重现性试验
分别称取同批双丹颗粒样品6份，分别依照2.2项下供试品制备方法制备供试品，按质量标准含量测定项下方法测定含量，并计算样品的RSD值分别为0.53%、0.56%、0.63%，结果表明，此含量测定方法的重现性良好。
2.8 稳定性试验
依照2.2项下供试品制备方法制备供试品溶液，分别在0，2，4，8h精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，进样测定，供试品丹酚酸B、丹参酮ⅡA、丹皮酚峰面积积分值的RSD分别为0.55%、0.63%、0.61%。结果表明丹酚酸B、丹参酮ⅡA、丹皮酚至少在8h内稳定。
2.9 回收率试验
采用加样回收试验，取已知含量的同一批供试品各6份，精密称定，分精密添加一定量的丹酚酸B、丹参酮ⅡA、丹皮酚对照品，按供试品制备所述方法制备供试品溶液，测定含量（同时测定样品含量），计算回收率。6次测定丹酚酸B、丹参酮ⅡA、丹皮酚的平均回收率为99.5%、99.6%、99.3%，RSD分别为0.82%、0.76%、0.66%。
3 讨论 分别考察甲醇-四氢呋喃-0.075mol/L醋酸钠缓冲液（pH4.5）（40：10：50），甲醇-水-冰醋酸（33∶66∶1），甲醇-水-冰醋酸（13∶86∶1），甲醇-水-冰醋酸（65：35：0.1），甲醇-乙腈-甲酸-水（15：3：1：81），乙腈-水（50：50）不同比例的流動相，结果以甲醇-乙腈-甲酸-水（15：3：1：81）为流动相，供试品各峰分离效果最好，故选用甲醇-乙腈-甲酸-水（15：3：1：81）为流动相。本方法简单、快捷、准确。实验表明此方法可用于双丹颗粒中丹酚酸B、丹参酮ⅡA、丹皮酚的含量测定。
参考文献
[1]贾娜，项海芝，杨松松.丹参水溶性部分丹酚酸的进展述评[J].辽宁中医学院学报，2006（3）.
[2]冯玲玲，周吉源.丹参的研究现状与应用前景[J].中国野生植物资源，2004（2）.
[3]吕亚青.丹参的化学成分及临床应用进展[J].中国药房，2007（12）.
[4]关昕，吴立军，解黎雯.丹参现代研究概况[J].实用中医药杂志，2005（7）.
[5]刘艾林，李铭源，王一涛，杜冠华.丹参药理学活性物质基础研究现状[J].中国药学杂志，2007（9）.
[6]赵小亮，雷浩东，张继.丹参有效成分提取的研究概述[J].安徽农业科学，2007（6）.
[7]闫瑾，崔志清.丹参及其有效成分的药理作用研究述略[J].中医药学刊，2004（9）.
[8]王新胜，吴艳芳，赵瑞娜.丹参地上部分活性成分TLC分析[J].海峡药学，2007（12）.
[9]齐永秀，曹明亮，万建建，刘春霞，高允生.高效液相色谱法测定白花丹参根、茎、叶中丹参素和原儿茶醛的含量[J].中国医院药学杂志，2007（12）.
[10]李福荣，史卫锋，夏作理.HPLC-MS法测定白花丹参中丹酚酸B的含量[J].中国药房，2007（21）.
[11]齐永秀，曹明亮，王晓丹，高允生，夏作理.泰山野生丹参与种植丹参根、茎、叶中三种有效成分含量的分析比较[J].药物生物技术，2006（4）.
[12]李福荣，史卫锋，夏作理.HPLC-MS法测定白花丹参叶中丹酚酸B的含量[J].中华中医药学刊，2007（8）.
关键词：双丹颗粒；丹皮酚；含量
双丹颗粒为黄褐色的颗粒，气芳香，味微苦，具有活血化瘀，通络止痛的功效。双丹颗粒常用于心血瘀阻所致胸痹心痛。双丹颗粒通过麻醉犬正常心脏血流动力学及心肌耗氧量实验，可显著增加冠脉血流量、扩张冠脉血管、改善心肌的供血、对缺血的心肌有保护作用。丹参具有改善血液循环、抗菌、抗炎、抗氧化、抗凝血和细胞保护等作用[1-8]。本实验采用高效液相色谱法对双丹颗粒中的丹酚酸B、丹参酮ⅡA、丹皮酚的进行了含量测定。
1 仪器与试药
BL10-250C双频加热型超声波清洗器（天津市恒奥科技发展有限公司）；EX1600四元低压梯度液相色谱仪（南京科捷分析仪器有限公司）；Histoon Lab I-05实验室超纯水器（科尔顿（中国）有限公司）；奥豪斯Explorer专业型分析天平（奥豪斯仪器上海有限公司）；JΜLABO TW系列通用水浴槽（优莱博技术（北京）有限公司）；IKA RV10 数显型旋转蒸仪（广州仪科实验室技术有限公司）；TU-1901 双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）。丹酚酸B、丹参酮ⅡA、丹皮酚对照品由中国药品生物制品检定所提供。乙腈、甲醇为色谱纯，其他试药均为分析纯，水为蒸馏水。
2 含量测定
2.1 色谱条件：依据查阅文献及考查的结果[9-12]，确定色谱条件如下：色谱柱为安捷伦Cl8规格为（4.6mm×250mm，5um）；甲醇-乙腈-甲酸-水（15：3：1：81）为流动相；检测波长为286nm；流速1.0mL·min-1；柱温：30℃。理论板数按丹酚酸B峰计算应不得低于2000。
2.2 供试品溶液的制备
取双丹颗粒适量，研细，精密称取，置50mL量瓶中，加流动相适量，超声处理10分钟使溶解，放置至室温，加流动相稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45μm）滤过，即得。
2.3 对照品溶液的制备
分别精密称取丹酚酸B、丹参酮ⅡA、丹皮酚对照品约5mg、0.5mg、2mg，置10mL容量瓶中，用加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
2.4 阴性干扰试验
在处方中去丹参，制成阴性对照溶液，用以上选定的测定条件进行吸收曲线绘制，观察在与丹酚酸B、丹参酮ⅡA、丹皮酚相同的保留时间处是否存在吸收峰，结果表明：在选定条件下测得的阴性液吸收曲线在与丹酚酸B、丹参酮ⅡA、丹皮酚相同保留时间处不存在吸收峰，因此说明选定的条件测定丹酚酸B、丹参酮ⅡA、丹皮酚无干扰，具有较强的专属性。
2.5 标准曲线的制备
制备浓度为0.2mg·mL-1、0.4mg·mL-1、0.6mg·mL-1、0.8mg·mL-1、1.0mg·mL-1、1.2mg·mL-1的丹酚酸B对照品溶液，制备浓度为0.02mg·mL-1、0.04mg·mL-1、0.06mg·mL-1、0.08mg·mL-1、0.10mg·mL-1、0.12mg·mL-1的丹参酮ⅡA对照品溶液，制备浓度为0.01mg·mL-1、0.02mg·mL-1、0.03mg·mL-1、0.04mg·mL-1、0.05mg·mL-1、0.06mg·mL-1的丹皮酚对照品溶液。分别按丹酚酸B、丹参酮ⅡA、丹皮酚的测定参数继续测定。以峰面积积分值A（μg）为横坐标，进样量为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。试验表明，丹酚酸B在0.2～12mg·mL-1范围内呈良好的线性关系；丹参酮ⅡA在0.02～1.2mg·mL-1范围内呈良好的线性关系；丹皮酚在0.1～6mg·mL-1范围内呈良好的线性关系。
2.6 精密度试验
依照2.3项下制备对照品溶液，精密吸取丹酚酸B、丹参酮ⅡA、丹皮酚对照品溶液10μL重复进样6次，测定峰面积积分值，对照品峰面积积分值的RSD分别为0.55%、0.63%、0.65%。结果表明，本实验精密度良好。
2.7 重现性试验
分别称取同批双丹颗粒样品6份，分别依照2.2项下供试品制备方法制备供试品，按质量标准含量测定项下方法测定含量，并计算样品的RSD值分别为0.53%、0.56%、0.63%，结果表明，此含量测定方法的重现性良好。
2.8 稳定性试验
依照2.2项下供试品制备方法制备供试品溶液，分别在0，2，4，8h精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，进样测定，供试品丹酚酸B、丹参酮ⅡA、丹皮酚峰面积积分值的RSD分别为0.55%、0.63%、0.61%。结果表明丹酚酸B、丹参酮ⅡA、丹皮酚至少在8h内稳定。
2.9 回收率试验
采用加样回收试验，取已知含量的同一批供试品各6份，精密称定，分精密添加一定量的丹酚酸B、丹参酮ⅡA、丹皮酚对照品，按供试品制备所述方法制备供试品溶液，测定含量（同时测定样品含量），计算回收率。6次测定丹酚酸B、丹参酮ⅡA、丹皮酚的平均回收率为99.5%、99.6%、99.3%，RSD分别为0.82%、0.76%、0.66%。
3 讨论 分别考察甲醇-四氢呋喃-0.075mol/L醋酸钠缓冲液（pH4.5）（40：10：50），甲醇-水-冰醋酸（33∶66∶1），甲醇-水-冰醋酸（13∶86∶1），甲醇-水-冰醋酸（65：35：0.1），甲醇-乙腈-甲酸-水（15：3：1：81），乙腈-水（50：50）不同比例的流動相，结果以甲醇-乙腈-甲酸-水（15：3：1：81）为流动相，供试品各峰分离效果最好，故选用甲醇-乙腈-甲酸-水（15：3：1：81）为流动相。本方法简单、快捷、准确。实验表明此方法可用于双丹颗粒中丹酚酸B、丹参酮ⅡA、丹皮酚的含量测定。
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[6]赵小亮，雷浩东，张继.丹参有效成分提取的研究概述[J].安徽农业科学，2007（6）.
[7]闫瑾，崔志清.丹参及其有效成分的药理作用研究述略[J].中医药学刊，2004（9）.
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[10]李福荣，史卫锋，夏作理.HPLC-MS法测定白花丹参中丹酚酸B的含量[J].中国药房，2007（21）.
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