论文部分内容阅读
【目的】克隆获得南江黄羊IGFBP-2（Insulin-like growth factor binding protein-2）基因的CDS区全序列,对其进行生物信息学分析,并分析IGFBP-2的mRNA和蛋白组织表达特征,为深入研究该基因在出生后山羊生长和发育过程中的作用以及表达调控提供基础资料。【方法】下载NCBI的Gen Bank数据库中公布的绵羊（Ovis aries,NM001009436）和牛（Bos taurus,NM174555）的IGFBP-2基因的mRNA序列,经序列比对后采用保守区域序列并利用Primer Premier 6.0软件设计克隆引物,经PCR扩增后采用TA克隆技术获取含有阳性克隆子的菌液,送公司测序得到山羊IGFBP-2基因的完整编码区序列,并利用Edit Seq、DNAMAN 6.0、MEGA 6.0和Ex PASy在线平台等软件对CDS区序列和其编码的氨基酸序列进行生物信息学分析;获得山羊IGFBP-2基因CDS区序列后,利用该序列设计实时荧光定量PCR（Q-PCR）引物,采用Q-PCR和蛋白质免疫印迹杂交（Western blotting）方法检测了IGFBP-2的mRNA和蛋白在出生后南江黄羊不同组织（心脏、肝脏、肺、背最长肌、半膜肌和臂三头肌）和不同发育阶段（3、30、60、90和120 d）的表达情况。【结果】1克隆得到954bp的南江黄羊IGFBP-2基因的CDS区全序列,碱基组成为GC含量69.39%,AT含量30.61%,共编码317个氨基酸残基,预测的山羊IGFBP-2蛋白分子量大小为33.8808 kD,等电点为7.82,二级结构由无规卷曲（68.14%）、α-螺旋（18.30%）和延伸链（13.56%）三种形式组成;蛋白结构域分析发现,IGFBP-2蛋白序列包含保守的IB（IGFBP homologues）和TY（Thyroglobulin typeΙrepeats）结构域,IB结构域位于第37—125位氨基酸处,TY结构域位于第250—302位氨基酸处;2磷酸化位点预测发现,IGFBP-2蛋白中存在Ser（5）和Thr（7）共12个磷酸化位点;糖基化位点预测发现,IGFBP-2蛋白序列中存在10个N-糖基化位点和2个O-糖基化位点;3CDS区序列相似性比较发现,山羊IGFBP-2与绵羊、牛、猪、人和小鼠的相似性分别达到98.99%、97.73%、87.12%、78.33%和76.26%;氨基酸序列相似性比较发现,山羊IGFBP-2与绵羊、牛、猪、人和小鼠的相似性分别达到99.24%、98.10%、87.07%、70.27%和73.00%;4系统进化树分析发现,山羊IGFBP-2与绵羊和牛的亲缘关系最近;5组织表达分析表明,IGFBP-2在肝脏中的mRNA和蛋白的相对表达量均最高（P<0.01）,背最长肌次之;在不同发育阶段的肝脏组织中,IGFBP-2 mRNA和蛋白相对表达量均呈现一直上升的趋势;在不同发育阶段的背最长肌组织中,IGFBP-2的mRNA表达水平呈现一种"上升-下降-上升"的波动平衡。【结论】获得了山羊IGFBP-2基因完整的编码区序列和组织表达特征,生物信息学分析发现IGFBP-2基因的编码区序列具有物种间的保守性,肝脏是山羊IGFBP-2的mRNA和蛋白表达的主要组织,同时在山羊不同发育阶段的肝脏和背最长肌组织中,IGFBP-2基因的mRNA和蛋白表达丰度呈现一定的规律性,表明IGFBP-2基因可能在出生后山羊的早期生长发育过程中发挥着重要的作用。