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[摘 要]本研究对发生在福建省养殖海区坛紫菜（Pyropia haitanensis）叶状体绿烂病开展了细菌分离研究，旨在找出患有绿烂病的坛紫菜叶状体上的菌种分布特点。用常规的细菌分离方法从患病藻体得到7株优势细菌X1～X7，将7株菌的16SrRNA序列进行对比，结果显示这7株菌归为5个属：Cellulophaga sp.、Vibrio sp.、Cobetia sp.、Pseudoalteromonas sp. 、Postechiella sp.。
[关键词]坛紫菜；绿烂病；菌群分离
中图分类号：S946.2 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2015）21-0099-01
紫菜被称为“海洋蔬菜”，是一种重要的经济类型红藻。我国是紫菜养殖主要的品种为坛紫菜（P. haitanensis） 和条斑紫菜（P. yezoensis）[1]。紫菜养殖过程中会有各种各样的疾病发生，如绿烂病、赤腐病、缩曲症、黄斑病、色圈病等[2-12]。本文是对发生在福建省莆田养殖海区坛紫菜叶状体绿烂病开展的病原分離研究，旨在发现患绿烂病的叶状体上细菌的菌种特点，为以后深入的研究提供基础数据。
1 材料与方法
1.1 坛紫菜叶状体来源
患绿烂病的坛紫菜叶片采自福建坛紫菜养殖场。选取典型的发病叶状体带回实验室马上进行处理。实验室条件置于温度20℃，海水比重为1.022，光照62.5μmol/m2·s，光暗周期L：D=12：12的条件下进行充气培养，每隔3天添加紫菜PES培养基[13]。
1.2 病原菌的分离纯化及保藏
选取从海区采回的患病叶状体上病状明显的区域，除去藻体表面杂质，用灭菌海水漂洗，后进行研磨匀浆，逐级稀释匀浆液并取适量涂布ZoBell22l6E海水培养基于28℃培养，观察菌落生长和形态，挑取形态一致的优势菌落在新鲜培养基上重复划线纯化3次以上，获得病原菌的纯化菌落。
将纯化好的菌株进行编号，并接种于新鲜配制的22l6E海水液体培养基内28℃培养24h后，按照菌液：保种液=1：1的比例进行保种，-80℃冰箱内保存备用。
1.3 菌株菌落形态的观察
纯化后的菌株接种到2216E海水培养基上，28℃条件下培养，观察菌落的大小、颜色、表面形态、气味等。
1.4 菌株的16SrRNA序列鉴定
提取细菌基因组DNA作为模板，以27F和1492r为PCR引物扩增16SrRNA基因[14]，所得PCR产物送上海华大进行测序，测序结果在GenBank中进行BLAST同源性比对。
1.5 细菌的酶活检测
对细菌按照常规的方法进行脂酶、淀粉酶、明胶酶等分泌能力的检测，进一步检测细菌。
2 结果
2.1 海区坛紫菜患病症状
刚采回的患病野生坛紫菜叶状体上有许多病斑，病斑呈圆形或亚圆形，大小不等，小的如针孔状，大的直径可达3～4mm。肉眼观察患病叶状体表面有红色和黄绿色两种病斑颜色，其中黄绿色病斑占据大部分。发病的部位不定但多集中在中部和边缘。患病叶状体在实验室内培养一段时间后，病症进一步加重，原来较小的病斑逐渐扩大与邻近的病斑相连成大病斑，最终，藻体腐烂解体。
2.2 病原菌分离及其特征
在2216E培养基上共分离得到7株优势菌，分别编号为X1～X7，有关病原菌菌落特性描述见表1。
将7株菌的16SrRNA序列与NCBI上序列进行对比，比对结果显示这7株菌归为5个属，分别为Cellulophaga sp.、Vibrio sp.、Cobetia sp.、Pseudoalteromonas sp.、Postechiella sp.，如表2所示。对细菌进行酶活检测后发现，7株细菌都不能够分泌淀粉酶；只有X6菌株能分泌酯酶；除X1和X5外，都能够分泌明胶酶。
3 讨论
条斑紫菜绿斑病首次由日本的齐藤雄之助报道[15]，之后从患绿斑病的条斑紫菜中分离出微球菌（Micrococcus sp.）、假单胞菌（Pseudomonas sp.）以及弧菌属（Vibriosp.）的细菌[4，5，16]。而有关坛紫菜绿烂病病原菌未有报道。本研究对坛紫菜患有绿烂病的叶状体进行细菌分离，得到Cellulophaga sp.、Vibrio sp.、Cobetia sp.、Pseudoalteromonas sp.、Postechiella sp.属的7株优势菌，与患有绿烂病的条斑紫菜中分离出的菌群比较能够发现都含有假单胞菌（Pseudomonas sp.）以及弧菌属（Vibriosp.）的细菌。酶活检测结果发现上述细菌大部分具有明胶酶的分泌能力。分离得到的细菌需要进行进一步的人工回感实验来确定是否为坛紫菜的致病菌。
本次观察到的坛紫菜绿斑病发生时间在12月份，由于自然环境、气候和养殖水体变化等原因，容易引起紫菜病害，这段时间应该采取严格的监控手段，一旦发病，及时控制病情，减少养殖的损失。
参考文献
[1]曾呈奎， 王素娟， 刘思俭，等.海藻栽培学[M].上海：上海科学出版社，1985：204-206.
[2]新崎盛敏.アマノリ類に寄生する壷状菌について[J].日本水産学会誌，1960，26（6）：543-548.
[3]Lin D H，Lin Y S.Studies on the green disease of Porphyrahaitanensis Chang &Zhengcaused by nitrogen deficiency[J].Hydrobiologia，1984，116-117（1）：453-455.
[4]中尾羲房，小野原隆幸，松原孝之等.ノリ病害細菌学的研究—Ⅰ.細菌による緑斑病様障害の実験的病症[J].日本水産学会誌，1972，38（6）：561-564.
[5]藤田雄二.ノリに緑斑病様障害なおてす细菌の粗酵素による葉体崩裂[J].日本水産学会誌，1973，39（8）：911-915.
[6]马家海. 江苏南部沿海条斑紫菜壶状菌病的调查研究[J].上海水产大学学报，1992，1（3-4）：185-188.
[7]马家海. 条斑紫菜赤腐病的初步研究[J].上海水产大学学报，1996，5（1）：1-7.
[8]马家海，张礼明，等.条斑紫菜缩曲症的研究[J].中国水产科学，1999，6（2）：82-88.
[9]闫咏，马家海，许璞，等.1株引起条斑紫菜绿斑病的柠檬假交替单胞菌[J].中国水产科学，2002，9（4）：353-358.
[10]陈秋萍，江最新.洞头县坛紫菜大面积病烂原因分析[J]. 浙江水产学院报，1991，10（2）：144-148.
[11]徐丽宁，杨锐.紫菜病害及防治[J].水利渔业，2005，25（6）：103-105.
[12]谢双如.坛紫菜几种常见病害防治技术[J].中国水产，2007，（2）：64-65.
[13]马家海.条斑紫菜赤腐病的初步研究[J].上海水产大学学报，1996，5（1）：1-7.
[14]洪义国，孙谧，张云波，等.16SrRNA在海洋微生物系统分子分类鉴定及分子检测中的应用[J].海洋水产研究，2002，23（1）：58-63.
[15]齐藤雄之助，松里寿彦， 吉川浩二.ノリの病気，绿斑病（新称），ちりめん症 （新称） につぃて[J].南西水研所研究报告，1972，5：1-9.
[16]须藤俊造. アサクサノソの[アナグサレ病]（新称）について[J].日水誌， 1954，19：1176-1178.
[关键词]坛紫菜；绿烂病；菌群分离
中图分类号：S946.2 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2015）21-0099-01
紫菜被称为“海洋蔬菜”，是一种重要的经济类型红藻。我国是紫菜养殖主要的品种为坛紫菜（P. haitanensis） 和条斑紫菜（P. yezoensis）[1]。紫菜养殖过程中会有各种各样的疾病发生，如绿烂病、赤腐病、缩曲症、黄斑病、色圈病等[2-12]。本文是对发生在福建省莆田养殖海区坛紫菜叶状体绿烂病开展的病原分離研究，旨在发现患绿烂病的叶状体上细菌的菌种特点，为以后深入的研究提供基础数据。
1 材料与方法
1.1 坛紫菜叶状体来源
患绿烂病的坛紫菜叶片采自福建坛紫菜养殖场。选取典型的发病叶状体带回实验室马上进行处理。实验室条件置于温度20℃，海水比重为1.022，光照62.5μmol/m2·s，光暗周期L：D=12：12的条件下进行充气培养，每隔3天添加紫菜PES培养基[13]。
1.2 病原菌的分离纯化及保藏
选取从海区采回的患病叶状体上病状明显的区域，除去藻体表面杂质，用灭菌海水漂洗，后进行研磨匀浆，逐级稀释匀浆液并取适量涂布ZoBell22l6E海水培养基于28℃培养，观察菌落生长和形态，挑取形态一致的优势菌落在新鲜培养基上重复划线纯化3次以上，获得病原菌的纯化菌落。
将纯化好的菌株进行编号，并接种于新鲜配制的22l6E海水液体培养基内28℃培养24h后，按照菌液：保种液=1：1的比例进行保种，-80℃冰箱内保存备用。
1.3 菌株菌落形态的观察
纯化后的菌株接种到2216E海水培养基上，28℃条件下培养，观察菌落的大小、颜色、表面形态、气味等。
1.4 菌株的16SrRNA序列鉴定
提取细菌基因组DNA作为模板，以27F和1492r为PCR引物扩增16SrRNA基因[14]，所得PCR产物送上海华大进行测序，测序结果在GenBank中进行BLAST同源性比对。
1.5 细菌的酶活检测
对细菌按照常规的方法进行脂酶、淀粉酶、明胶酶等分泌能力的检测，进一步检测细菌。
2 结果
2.1 海区坛紫菜患病症状
刚采回的患病野生坛紫菜叶状体上有许多病斑，病斑呈圆形或亚圆形，大小不等，小的如针孔状，大的直径可达3～4mm。肉眼观察患病叶状体表面有红色和黄绿色两种病斑颜色，其中黄绿色病斑占据大部分。发病的部位不定但多集中在中部和边缘。患病叶状体在实验室内培养一段时间后，病症进一步加重，原来较小的病斑逐渐扩大与邻近的病斑相连成大病斑，最终，藻体腐烂解体。
2.2 病原菌分离及其特征
在2216E培养基上共分离得到7株优势菌，分别编号为X1～X7，有关病原菌菌落特性描述见表1。
将7株菌的16SrRNA序列与NCBI上序列进行对比，比对结果显示这7株菌归为5个属，分别为Cellulophaga sp.、Vibrio sp.、Cobetia sp.、Pseudoalteromonas sp.、Postechiella sp.，如表2所示。对细菌进行酶活检测后发现，7株细菌都不能够分泌淀粉酶；只有X6菌株能分泌酯酶；除X1和X5外，都能够分泌明胶酶。
3 讨论
条斑紫菜绿斑病首次由日本的齐藤雄之助报道[15]，之后从患绿斑病的条斑紫菜中分离出微球菌（Micrococcus sp.）、假单胞菌（Pseudomonas sp.）以及弧菌属（Vibriosp.）的细菌[4，5，16]。而有关坛紫菜绿烂病病原菌未有报道。本研究对坛紫菜患有绿烂病的叶状体进行细菌分离，得到Cellulophaga sp.、Vibrio sp.、Cobetia sp.、Pseudoalteromonas sp.、Postechiella sp.属的7株优势菌，与患有绿烂病的条斑紫菜中分离出的菌群比较能够发现都含有假单胞菌（Pseudomonas sp.）以及弧菌属（Vibriosp.）的细菌。酶活检测结果发现上述细菌大部分具有明胶酶的分泌能力。分离得到的细菌需要进行进一步的人工回感实验来确定是否为坛紫菜的致病菌。
本次观察到的坛紫菜绿斑病发生时间在12月份，由于自然环境、气候和养殖水体变化等原因，容易引起紫菜病害，这段时间应该采取严格的监控手段，一旦发病，及时控制病情，减少养殖的损失。
参考文献
[1]曾呈奎， 王素娟， 刘思俭，等.海藻栽培学[M].上海：上海科学出版社，1985：204-206.
[2]新崎盛敏.アマノリ類に寄生する壷状菌について[J].日本水産学会誌，1960，26（6）：543-548.
[3]Lin D H，Lin Y S.Studies on the green disease of Porphyrahaitanensis Chang &Zhengcaused by nitrogen deficiency[J].Hydrobiologia，1984，116-117（1）：453-455.
[4]中尾羲房，小野原隆幸，松原孝之等.ノリ病害細菌学的研究—Ⅰ.細菌による緑斑病様障害の実験的病症[J].日本水産学会誌，1972，38（6）：561-564.
[5]藤田雄二.ノリに緑斑病様障害なおてす细菌の粗酵素による葉体崩裂[J].日本水産学会誌，1973，39（8）：911-915.
[6]马家海. 江苏南部沿海条斑紫菜壶状菌病的调查研究[J].上海水产大学学报，1992，1（3-4）：185-188.
[7]马家海. 条斑紫菜赤腐病的初步研究[J].上海水产大学学报，1996，5（1）：1-7.
[8]马家海，张礼明，等.条斑紫菜缩曲症的研究[J].中国水产科学，1999，6（2）：82-88.
[9]闫咏，马家海，许璞，等.1株引起条斑紫菜绿斑病的柠檬假交替单胞菌[J].中国水产科学，2002，9（4）：353-358.
[10]陈秋萍，江最新.洞头县坛紫菜大面积病烂原因分析[J]. 浙江水产学院报，1991，10（2）：144-148.
[11]徐丽宁，杨锐.紫菜病害及防治[J].水利渔业，2005，25（6）：103-105.
[12]谢双如.坛紫菜几种常见病害防治技术[J].中国水产，2007，（2）：64-65.
[13]马家海.条斑紫菜赤腐病的初步研究[J].上海水产大学学报，1996，5（1）：1-7.
[14]洪义国，孙谧，张云波，等.16SrRNA在海洋微生物系统分子分类鉴定及分子检测中的应用[J].海洋水产研究，2002，23（1）：58-63.
[15]齐藤雄之助，松里寿彦， 吉川浩二.ノリの病気，绿斑病（新称），ちりめん症 （新称） につぃて[J].南西水研所研究报告，1972，5：1-9.
[16]须藤俊造. アサクサノソの[アナグサレ病]（新称）について[J].日水誌， 1954，19：1176-1178.