【摘 要】
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目的 建立用于重组H5N1流感血凝素杆状病毒滴度检测的荧光定量PCR(qPCR)法,并进行验证及初步应用.方法 利用Bac-to-Bac技术构建重组穿梭质粒(rBacmid-H5),以其为模板,梯度PCR扩增H5基因,优化退火温度和引物浓度,建立qPCR检测方法,对该方法的专属性、重复性进行验证,确定线性范围及检测限.应用建立的qPCR方法对H5杆状病毒连续传代4次以及连续培养0～6d的样品进行检测,并与免疫荧光法进行比较.结果 在退火温度55℃,1 μL 10 mmol/L引物条件下,建立了qPCR法,
【机 构】
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国药中生生物技术研究院有限公司,北京101111;北京生物制品研究所有限责任公司,北京100176
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目的 建立用于重组H5N1流感血凝素杆状病毒滴度检测的荧光定量PCR(qPCR)法,并进行验证及初步应用.方法 利用Bac-to-Bac技术构建重组穿梭质粒(rBacmid-H5),以其为模板,梯度PCR扩增H5基因,优化退火温度和引物浓度,建立qPCR检测方法,对该方法的专属性、重复性进行验证,确定线性范围及检测限.应用建立的qPCR方法对H5杆状病毒连续传代4次以及连续培养0～6d的样品进行检测,并与免疫荧光法进行比较.结果 在退火温度55℃,1 μL 10 mmol/L引物条件下,建立了qPCR法,该方法检测H5基因,专属性良好;模板浓度在1.15×103～4.25×109copies/μL之间,线性关系良好,R2=0.999;6次重复检测重组H5杆状病毒培养3d样品,RSD为1.01％,重复性较好.H5病毒连续传代4次,病毒滴度保持相对稳定,培养0～6d病毒滴度在第3天达到较高值,且检测值均高于免疫荧光法.结论 建立了qPCR法进行H5N1流感血凝素重组杆状病毒滴度的特异性检测.
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