【摘 要】
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背景：从深低温冻存脐血中获得大量高纯度无滋养层细胞、无动物源成分的NK细胞，以便更好地开展NK细胞杀伤肿瘤的实验研究，此次研究通过使用NK扩增培养试剂盒和血清替代物，以获得安全、高效的体外扩增培养NK细胞的方法。目的：建立一种从冷冻脐血中采用纯细胞因子扩增NK细胞的技术体系并证明其体外杀瘤能力。方法：解冻液氮存储的冻存脐血，优化复苏体系，采用Ficoll密度梯度离心的方法收集脐血单个核细胞，接种于
【基金项目】
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山东省重点研发计划（重大科技创新工程）项目（2019JZZY011012），项目负责人：曲廷瑜；
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背景：从深低温冻存脐血中获得大量高纯度无滋养层细胞、无动物源成分的NK细胞，以便更好地开展NK细胞杀伤肿瘤的实验研究，此次研究通过使用NK扩增培养试剂盒和血清替代物，以获得安全、高效的体外扩增培养NK细胞的方法。目的：建立一种从冷冻脐血中采用纯细胞因子扩增NK细胞的技术体系并证明其体外杀瘤能力。方法：解冻液氮存储的冻存脐血，优化复苏体系，采用Ficoll密度梯度离心的方法收集脐血单个核细胞，接种于预先铺板的T175培养瓶中，采用细胞因子试剂盒+血清替代物法培养21 d后收集细胞并计数，应用流式细胞术检测细胞中CD3-CD56+的比例，并将所得数据与K562滋养层细胞+胎牛血清的培养方法进行对比分析。同时以髓系白血病细胞K562为靶细胞，采用CCK-8试剂盒检测不同效靶比NK细胞杀伤K562细胞的作用。最后进行了12 h内的模拟储存运输实验，采用流式检测CD3-CD56+的比例变化，并使用Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡率。结果与结论：（1）采用K562滋养层细胞+胎牛血清的培养方法扩增培养14 d，细胞扩增（51.47±4.28）倍；采用细胞因子试剂盒+血清替代物法扩增培养21 d，细胞数量5×10~9以上，细胞扩增（328.32±116.36）倍，细胞扩增倍数明显升高，2种方法获得的CD3-CD56+纯度比例均在80%以上，未见明显差异；（2）纯细胞因子方法培养后的NK细胞对K562细胞的杀伤效果（效靶比=10∶1）达80%以上；（3）在12 h的模拟储运实验中，CD3-CD56+的比例变化不明显，直至第12小时，NK细胞凋亡率<7%;（4）结果表明：优化复苏体系和纯细胞因子扩增方法可以高效培养出高纯度的NK细胞，同时具有有效杀伤K562肿瘤细胞的能力，且经过12 h储运后仍然具有良好的细胞纯度和较低的凋亡率。
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