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摘要 2007年在陕西韩城发现一种新的小麥病毒病害，症状表现为严重矮缩、黄化、条斑和分蘖增多等，发病面积约0.07万hm2，病田减产达50％，严重地块甚至绝收。本研究通过对采集自我国陕西韩城的7个样品进行PCR鉴定、全基因组序列测定及比较，证实陕西韩城样品确是小麦矮缩病毒(WDV)侵染所致，并对发病原因及其流行趋势进行了分析。这是小麦矮缩病在我国麦田大发生的首次报道。
关键词 小麦矮缩病毒(WDV)；分子鉴定；发生
中图分类号 S435.121.49
韩城市位于陕西省东北部，总面积1621 km2，有耕地面积2.67万hm2，其中麦田面积1.57万hm2，主要分为山、塬、川3种类型，面积分别为0.53万、0.91万hm2和0.13万hm2。2007年春季，症状表现为严重矮缩、黄化、条斑和分蘖增多等的小麦病毒病害在北部地区的新城、西庄和龙门镇等地严重发生，发病面积约为0.07万hm2，发病田平均病株率为80％，严重矮缩病株约占20％，发病田减产达50％～80％。根据这些症状和发病特点，初步判断是小麦矮缩病。
小麦矮缩病毒(WDV)是玉米线条病毒属的成员，属于第1亚组联体病毒，基因组由2 739～2 750个核苷酸组成，编码4个蛋白，包括运动蛋白(MP)、外壳蛋白(CP)、两个复制相关蛋白(Rep A和Rep)及两个基因间隔区(LIR和SIR)。该病毒已经在欧洲的很多国家有过报道，例如捷克、瑞典、匈牙利、法国、德国、和土耳其等。近年来，在非洲的突尼斯和赞比亚又有发现。发病后的小麦严重矮缩、黄化、条斑。该病害已经在非洲、欧洲、亚洲和大洋洲引起了严重的经济损失。
小麦矮缩病毒(WDV)的传毒介体是条沙叶蝉(Psammotettix striatus)，寄主包括小麦(tristicumaestivum)、大麦(Hordeum vulgare)、燕麦(Avenasativa)和多种杂草。以前我国对该病毒未见记载，自2003年春季开始，本实验室在全国不同小麦生态区进行田间调查，在许多地区发现了严重矮化，黄化且不能抽穗的小麦植株。基于这些症状，怀疑是由小麦矮缩病毒(WDV)所致。2007年本实验室首次鉴定出山西省农业科学院试验麦田发生严重矮化的小麦植株是由WDV侵染所致，从而证实了该病毒在我国的存在。本研究通过对韩城样品进行PCR鉴定和序列分析，证实韩城样品确由WDV侵染所致，结合当地生态特点对发病原因及其流行趋势进行了分析。
1 材料与方法
1．1 试验材料
2007年4月20～21日在陕西韩城采集表现严重矮化，分蘖增多，黄化且不能抽穗的小麦标样31个。记录采集时间、地点、寄主、发病症状特点，并分别编号。带回实验室后剪成5～10 cm片段置-70℃保存。挑选其中的7个症状典型的样品进行分析。
1．2 小麦矮缩病毒(WDV)的分子鉴定
1．2．1 植物总DNA的提取
提取方法参照Williamson等方法，由CTAB法提取，0.8％琼脂糖电泳检测DNA浓度，然后置于-20℃冰箱备用。
1．2．2 引物设计
依据GeneBank上已登录的WDV不同地区分离物的基因组全序列，对其进行比对，利用VecterNT 9.0软件，根据保守序列设计4对鉴定引物：245F/806R、245F/1 886R、1 381F/1 886R、1761F/435R和3对测序引物：40F/806R、735F/1 886R、1 828F/118R(引物序列见表1)。引物均合成于北京奥科生物技术有限责任公司。
1．2．3 小麦矮缩病毒(WDV)分离物的PCR鉴定
利用设计好的4对引物，鉴定从陕西韩城采集的标样。PCR反应体系为模板DNA20 ng，引物2 pmol/uL。10×Buffer 2.5 uL，dNTPs 2uL，Taq酶0.15 uL，用水调至终体积25uL。PCR反应程序为94℃变性4 min；94℃45 s、56℃45 s，72℃1 min，30个循环；最后72℃延伸10 min。PCR产物用0.8％琼脂糖电泳检测。用于PCR反应的试剂购于TaKaRa生物技术公司。
1．2．4 小麦矮缩病毒(WDV)基因组全序列测定
用设计的3对测序引物扩增覆盖小麦矮缩病毒(WDV)全基因组序列(扩增策略见图1)，并将获得的扩增片段连接到PMD18-T载体，试验步骤参照PMD18-T试剂盒说明书进行。PCR鉴定阳性克隆并测序，最后对测序结果进行拼接。PMD18-T载体试剂盒购于TaKaRa生物技术公司，IPTG、X-gal、氨苄音霍素购自北京绿牛源牛物技术公司。
1．2．5 小麦矮缩病毒(WDV)基因组序列比较
利用Vecter NT 9.0软件对获得的7个陕西韩城小麦矮缩病毒(WDV)分离物序列和从GenBank下载的5个不同来源的小麦矮缩病毒(WDV)分离物序列进行序列相似性比较，并对其开放阅读框和非编码区的核苷酸和推导的氨基酸序列进行分析。利用MEGA 4.0对其进行系统进化树的构建。
1．2．6 小麦矮缩病发病原因调查分析
于2007年4月中旬调查了韩城市大田小麦矮缩病的发病率，发病地块的介体昆虫种类，虫口密度，种植的小麦品种等。结合冬春气象资料对小麦矮缩病大发生的原因进行了分析。
2 结果与分析
2．1 小麦矮缩病毒(WDV)分离物的PCR鉴定
以已知阳性样品(2004年的山西太原分离物，GeneBank登录序列号DQ868528)[1胡作为阳性对照，用来鉴定于2007年4月采集自陕西省韩城市表现矮缩症状的小麦标样。结果显示所有标样均能扩增出阳性条带，4对引物245F/806R、1 381F/1886R、245F/1 886R、1 761F/435R分别扩增出562bp，506 bp，1 642 bp，2 275 bp的特异片段，大小分别与小麦矮缩病毒(WDV)基因中对应引物之间的片段大小相吻合(图2)。
2．2 小麦矮缩病毒(WDV)分离物核苷酸序列测定
以3对测序引物(40F/806R、735F/1 886R、1 828F/118R)PCR扩增韩城小麦标样，分别扩增出片段1、片段2、片段3(图3)。对获得的扩增产物进行克隆测序，并对测序结果进行拼接，最终获得了7个WDV分离物的全序列。
2．3 小麦矮缩病毒(WDV)分离物基因组序列分析
通过对获得的采集自陕西省韩城市的7个陕西 韩城小麦矮缩病毒(WDV)分离物全序列和5个不同来源的小麦矮缩病毒(WDV)分离物的核苷酸序列进行相似性比较，其核苷酸序列同源性为97.1％～99.5％。其中的SXHC-10、SXHC-2与中国太原分离物(GenBank登录号：DQ868528)序列同源性最高，为99.5％；选取SXHC-19的基因组开放阅读框(ORF)、非编码区(UTR)的核苷酸序列和推导的氨基酸序列序列与5个不同地区的WDV9离物相应片段进行比较，发现这些核苷酸序列和推导的氨基酸序列同源性也很高，分别达到96.39/5～99.6％和95.5％～100％(表2)。
在测定获得的所有WDV标样中，其基因组结构符合小麦矮缩病毒(WDV)基因组基本构成。基因组ORFl起始于171位，在433位终止，编码运动蛋白(MP)。ORF2起始于415位，终止于1 197位，编码外壳蛋白(CP)。ORF3起始于2511位，在1 369位终止，编码复制相关蛋白Rep。ORF4起始于2 511位，在1 717位终止，编码复制相关蛋白RepA。SIR起始于1 198位，终止于1 369位。LIR在1～170位、2 512～2 750位，含有联体病毒复制起始所需的“TAATATTAC”的9碱基保守序列和其他作用元件。
对SXHC-19号分离物与5个来自其他地区的WDV分离物基因组全序列核苷酸序列进行系统进化分析表明(图4)：SXHC-19号分离物与其他5个不同来源的分离物均位于一个大组，与中国太原分离物(DQ868528)亲缘关系最近。因此，引起陕西韩城小麦植株矮化、黄化、分蘖增多的病原是小麦矮缩病毒(WDV)。
2．4 小麦矮缩病发生与流行原因分析
2007年4月15～18日对韩城市麦田进行了普查，发现小麦矮缩病毒的传毒介体条沙叶蝉普遍发生，平均虫口密度为600头/m2，其中北部塬区和山区发生最重，虫口密度为1 000头/m2，严重田块达2 000头/m2。发病小麦品种主要为小偃22和小偃6号新系，发病田平均病株率为80％，严重矮缩病株约占20％，发病田减产达50％～80％。对气象资料分析表明，2006～2007年冬季气温偏高，有利于介体条沙叶蝉的越冬，而起2007年3月底至4月初又出现了低温倒春寒的反常天气，造成了小麦植株抗病性的降低，促进了矮缩病的发生。
3 讨论
小麦矮缩病毒(WDV)于1961年在前捷克斯洛伐克首先报道，随后在瑞典、匈牙利、法国和德国陆续发现。近年来，在西班牙、土耳其、美国、突尼斯、赞比亚和中国又有发现。发病后的小麦出现严重矮缩、黄化、条斑、不能抽穗等症状，使小麦产量大幅度降低。小麦矮缩病毒(WDV)已经在非洲、欧洲、亚洲和大洋洲引起了严重的经济损失，而且有逐年上升的趋势。
本研究对采集自我国陕西韩城的7个小麦矮缩病毒分离物进行了PCR鉴定、全基因组序列测定和分析。结果显示，以4对鉴定引物PCR扩增所有韩城样品，扩增出的条带分别与小麦矮缩病毒(WDV)基因组中对应引物之间的片段大小吻合。经测序获得的陕西韩城分离物基因组全序列大小与国内外公布的小麦矮缩病毒(WDV)序列相符，基因组的开放阅读框和非编码区序列也与国内外公布的小麦矮缩病毒(WDV)的结构一致；系统进化分析表明陕西韩城分离物基因组与国内外公布的小麦矮缩病毒(WDV)基因组也属于同一个进化分支。本研究测定的陕西韩城分离物基因组全序列可以为其分類地位提供依据。
2004年以前小麦矮缩病毒在我国并未见报道。自2003年春季开始，本实验室在全国不同小麦生态区进行田间调查，在许多地区发现了严重矮化，黄化且不能抽穗的小麦植株。基于这些症状，怀疑是由小麦矮缩病毒(WDV)所致，并于2007年本实验室首次报道了WDV在山西省太原麦田的发生。小麦矮缩病的发生与寄主小麦、病毒、介体条沙叶蝉等在特定生态环境条件下的相互作用有关。近年来全球气温升高现象普遍发生，导致暖冬出现频率加大，有利于介体昆虫的越冬和传毒，加之缺乏对现在推广小麦品种抗病性的了解，有关小麦矮缩病在我国的发生与危害应该予以更大地关注。
关键词 小麦矮缩病毒(WDV)；分子鉴定；发生
中图分类号 S435.121.49
韩城市位于陕西省东北部，总面积1621 km2，有耕地面积2.67万hm2，其中麦田面积1.57万hm2，主要分为山、塬、川3种类型，面积分别为0.53万、0.91万hm2和0.13万hm2。2007年春季，症状表现为严重矮缩、黄化、条斑和分蘖增多等的小麦病毒病害在北部地区的新城、西庄和龙门镇等地严重发生，发病面积约为0.07万hm2，发病田平均病株率为80％，严重矮缩病株约占20％，发病田减产达50％～80％。根据这些症状和发病特点，初步判断是小麦矮缩病。
小麦矮缩病毒(WDV)是玉米线条病毒属的成员，属于第1亚组联体病毒，基因组由2 739～2 750个核苷酸组成，编码4个蛋白，包括运动蛋白(MP)、外壳蛋白(CP)、两个复制相关蛋白(Rep A和Rep)及两个基因间隔区(LIR和SIR)。该病毒已经在欧洲的很多国家有过报道，例如捷克、瑞典、匈牙利、法国、德国、和土耳其等。近年来，在非洲的突尼斯和赞比亚又有发现。发病后的小麦严重矮缩、黄化、条斑。该病害已经在非洲、欧洲、亚洲和大洋洲引起了严重的经济损失。
小麦矮缩病毒(WDV)的传毒介体是条沙叶蝉(Psammotettix striatus)，寄主包括小麦(tristicumaestivum)、大麦(Hordeum vulgare)、燕麦(Avenasativa)和多种杂草。以前我国对该病毒未见记载，自2003年春季开始，本实验室在全国不同小麦生态区进行田间调查，在许多地区发现了严重矮化，黄化且不能抽穗的小麦植株。基于这些症状，怀疑是由小麦矮缩病毒(WDV)所致。2007年本实验室首次鉴定出山西省农业科学院试验麦田发生严重矮化的小麦植株是由WDV侵染所致，从而证实了该病毒在我国的存在。本研究通过对韩城样品进行PCR鉴定和序列分析，证实韩城样品确由WDV侵染所致，结合当地生态特点对发病原因及其流行趋势进行了分析。
1 材料与方法
1．1 试验材料
2007年4月20～21日在陕西韩城采集表现严重矮化，分蘖增多，黄化且不能抽穗的小麦标样31个。记录采集时间、地点、寄主、发病症状特点，并分别编号。带回实验室后剪成5～10 cm片段置-70℃保存。挑选其中的7个症状典型的样品进行分析。
1．2 小麦矮缩病毒(WDV)的分子鉴定
1．2．1 植物总DNA的提取
提取方法参照Williamson等方法，由CTAB法提取，0.8％琼脂糖电泳检测DNA浓度，然后置于-20℃冰箱备用。
1．2．2 引物设计
依据GeneBank上已登录的WDV不同地区分离物的基因组全序列，对其进行比对，利用VecterNT 9.0软件，根据保守序列设计4对鉴定引物：245F/806R、245F/1 886R、1 381F/1 886R、1761F/435R和3对测序引物：40F/806R、735F/1 886R、1 828F/118R(引物序列见表1)。引物均合成于北京奥科生物技术有限责任公司。
1．2．3 小麦矮缩病毒(WDV)分离物的PCR鉴定
利用设计好的4对引物，鉴定从陕西韩城采集的标样。PCR反应体系为模板DNA20 ng，引物2 pmol/uL。10×Buffer 2.5 uL，dNTPs 2uL，Taq酶0.15 uL，用水调至终体积25uL。PCR反应程序为94℃变性4 min；94℃45 s、56℃45 s，72℃1 min，30个循环；最后72℃延伸10 min。PCR产物用0.8％琼脂糖电泳检测。用于PCR反应的试剂购于TaKaRa生物技术公司。
1．2．4 小麦矮缩病毒(WDV)基因组全序列测定
用设计的3对测序引物扩增覆盖小麦矮缩病毒(WDV)全基因组序列(扩增策略见图1)，并将获得的扩增片段连接到PMD18-T载体，试验步骤参照PMD18-T试剂盒说明书进行。PCR鉴定阳性克隆并测序，最后对测序结果进行拼接。PMD18-T载体试剂盒购于TaKaRa生物技术公司，IPTG、X-gal、氨苄音霍素购自北京绿牛源牛物技术公司。
1．2．5 小麦矮缩病毒(WDV)基因组序列比较
利用Vecter NT 9.0软件对获得的7个陕西韩城小麦矮缩病毒(WDV)分离物序列和从GenBank下载的5个不同来源的小麦矮缩病毒(WDV)分离物序列进行序列相似性比较，并对其开放阅读框和非编码区的核苷酸和推导的氨基酸序列进行分析。利用MEGA 4.0对其进行系统进化树的构建。
1．2．6 小麦矮缩病发病原因调查分析
于2007年4月中旬调查了韩城市大田小麦矮缩病的发病率，发病地块的介体昆虫种类，虫口密度，种植的小麦品种等。结合冬春气象资料对小麦矮缩病大发生的原因进行了分析。
2 结果与分析
2．1 小麦矮缩病毒(WDV)分离物的PCR鉴定
以已知阳性样品(2004年的山西太原分离物，GeneBank登录序列号DQ868528)[1胡作为阳性对照，用来鉴定于2007年4月采集自陕西省韩城市表现矮缩症状的小麦标样。结果显示所有标样均能扩增出阳性条带，4对引物245F/806R、1 381F/1886R、245F/1 886R、1 761F/435R分别扩增出562bp，506 bp，1 642 bp，2 275 bp的特异片段，大小分别与小麦矮缩病毒(WDV)基因中对应引物之间的片段大小相吻合(图2)。
2．2 小麦矮缩病毒(WDV)分离物核苷酸序列测定
以3对测序引物(40F/806R、735F/1 886R、1 828F/118R)PCR扩增韩城小麦标样，分别扩增出片段1、片段2、片段3(图3)。对获得的扩增产物进行克隆测序，并对测序结果进行拼接，最终获得了7个WDV分离物的全序列。
2．3 小麦矮缩病毒(WDV)分离物基因组序列分析
通过对获得的采集自陕西省韩城市的7个陕西 韩城小麦矮缩病毒(WDV)分离物全序列和5个不同来源的小麦矮缩病毒(WDV)分离物的核苷酸序列进行相似性比较，其核苷酸序列同源性为97.1％～99.5％。其中的SXHC-10、SXHC-2与中国太原分离物(GenBank登录号：DQ868528)序列同源性最高，为99.5％；选取SXHC-19的基因组开放阅读框(ORF)、非编码区(UTR)的核苷酸序列和推导的氨基酸序列序列与5个不同地区的WDV9离物相应片段进行比较，发现这些核苷酸序列和推导的氨基酸序列同源性也很高，分别达到96.39/5～99.6％和95.5％～100％(表2)。
在测定获得的所有WDV标样中，其基因组结构符合小麦矮缩病毒(WDV)基因组基本构成。基因组ORFl起始于171位，在433位终止，编码运动蛋白(MP)。ORF2起始于415位，终止于1 197位，编码外壳蛋白(CP)。ORF3起始于2511位，在1 369位终止，编码复制相关蛋白Rep。ORF4起始于2 511位，在1 717位终止，编码复制相关蛋白RepA。SIR起始于1 198位，终止于1 369位。LIR在1～170位、2 512～2 750位，含有联体病毒复制起始所需的“TAATATTAC”的9碱基保守序列和其他作用元件。
对SXHC-19号分离物与5个来自其他地区的WDV分离物基因组全序列核苷酸序列进行系统进化分析表明(图4)：SXHC-19号分离物与其他5个不同来源的分离物均位于一个大组，与中国太原分离物(DQ868528)亲缘关系最近。因此，引起陕西韩城小麦植株矮化、黄化、分蘖增多的病原是小麦矮缩病毒(WDV)。
2．4 小麦矮缩病发生与流行原因分析
2007年4月15～18日对韩城市麦田进行了普查，发现小麦矮缩病毒的传毒介体条沙叶蝉普遍发生，平均虫口密度为600头/m2，其中北部塬区和山区发生最重，虫口密度为1 000头/m2，严重田块达2 000头/m2。发病小麦品种主要为小偃22和小偃6号新系，发病田平均病株率为80％，严重矮缩病株约占20％，发病田减产达50％～80％。对气象资料分析表明，2006～2007年冬季气温偏高，有利于介体条沙叶蝉的越冬，而起2007年3月底至4月初又出现了低温倒春寒的反常天气，造成了小麦植株抗病性的降低，促进了矮缩病的发生。
3 讨论
小麦矮缩病毒(WDV)于1961年在前捷克斯洛伐克首先报道，随后在瑞典、匈牙利、法国和德国陆续发现。近年来，在西班牙、土耳其、美国、突尼斯、赞比亚和中国又有发现。发病后的小麦出现严重矮缩、黄化、条斑、不能抽穗等症状，使小麦产量大幅度降低。小麦矮缩病毒(WDV)已经在非洲、欧洲、亚洲和大洋洲引起了严重的经济损失，而且有逐年上升的趋势。
本研究对采集自我国陕西韩城的7个小麦矮缩病毒分离物进行了PCR鉴定、全基因组序列测定和分析。结果显示，以4对鉴定引物PCR扩增所有韩城样品，扩增出的条带分别与小麦矮缩病毒(WDV)基因组中对应引物之间的片段大小吻合。经测序获得的陕西韩城分离物基因组全序列大小与国内外公布的小麦矮缩病毒(WDV)序列相符，基因组的开放阅读框和非编码区序列也与国内外公布的小麦矮缩病毒(WDV)的结构一致；系统进化分析表明陕西韩城分离物基因组与国内外公布的小麦矮缩病毒(WDV)基因组也属于同一个进化分支。本研究测定的陕西韩城分离物基因组全序列可以为其分類地位提供依据。
2004年以前小麦矮缩病毒在我国并未见报道。自2003年春季开始，本实验室在全国不同小麦生态区进行田间调查，在许多地区发现了严重矮化，黄化且不能抽穗的小麦植株。基于这些症状，怀疑是由小麦矮缩病毒(WDV)所致，并于2007年本实验室首次报道了WDV在山西省太原麦田的发生。小麦矮缩病的发生与寄主小麦、病毒、介体条沙叶蝉等在特定生态环境条件下的相互作用有关。近年来全球气温升高现象普遍发生，导致暖冬出现频率加大，有利于介体昆虫的越冬和传毒，加之缺乏对现在推广小麦品种抗病性的了解，有关小麦矮缩病在我国的发生与危害应该予以更大地关注。