【摘 要】
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目的 利用基因工程方法克隆SD大鼠Atohl基因CDS,构建大鼠核转录因子Atohl的真核表达载体并在真核细胞中表达.方法 从SD大鼠结肠粘膜提取总RNA,采用逆转录PCR法扩增Atohl基因C
【机 构】
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西安交通大学医学院第二附属医院耳鼻咽喉头颈外科病院
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目的 利用基因工程方法克隆SD大鼠Atohl基因CDS,构建大鼠核转录因子Atohl的真核表达载体并在真核细胞中表达.方法 从SD大鼠结肠粘膜提取总RNA,采用逆转录PCR法扩增Atohl基因CDS区序列并TA克隆至PMD-19T载体中.测序鉴定后将Atohl基因连接于含有EGFP和内部核糖体转入位点(internal ribosome entrysite,IRES)的真核细胞表达载体pIRES2-EGFP中,对重组质粒进行酶切鉴定和测序鉴定后,以脂质体介导法转染至293T细胞,荧光显微镜、PT-PCR和Western blot检测其在293T细胞中的表达.结果 扩增得到大鼠Atohl CDS区长1056 bp,编码351个氨基酸,与GeneBank公布的参考序列对比,有两处碱基发生突变,但克隆序列编码的氨基酸序列与参考序列完全一致,两处碱基应为单核苷酸多态性(SNP),突变为无义突变,不影响蛋白表达.双酶切和测序结果证明Atohl已正确地克隆到真核表达载体pIRES2-EGFP中,转染293T细胞48 h后,荧光显微镜下观察到荧光蛋白的表达,PT-PCR和Western blot证实Atohl 的mRNA和蛋白能在293T细胞中正确表达.结论 成功构建了真核表达载体pAtohl-IRES2-EGFP,并在293T细胞中成功表达,为进一步研究Atohl的功能、作用机制及感音神经性耳聋的基因治疗奠定了基础.
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