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摘要：研究大肠杆菌表达的水稻α-半乳糖苷酶基因工程菌菌体破碎的条件。以菌液酶活性为指标，用超声波破碎、溶菌酶降解及菌体反复冻融3种方法破碎细胞。结果表明：超声波功率为200 W、破碎时间为1 min时测得的菌液酶的活性最大，为7.757 7
U/mL，细胞破碎效果最好；菌体反复冻融条件下测得的菌液酶活性随冻融次数的增加而增大，但样品处理时间过长；菌液酶活性随加入溶菌酶浓度增加而增加，但有处理时间长、用量大、细胞破碎不完全的缺点。
关键词：α-半乳糖苷酶；超声波破碎；溶菌酶；反复冻融
中图分类号：Q55 文献标识码：A 文章编号：1674-1161（2014）10-0037-03
α-半乳糖苷酶（α-Galactosidase， EC 3.2.1.22）属外切糖苷酶，其专一性地催化半乳聚糖中非还原末端α-半乳糖苷键的水解，并能作用于含有α-半乳糖苷的糖蛋白和糖脂质，广泛存在于植物、动物和微生物中，在食品、医药、饲料等诸多领域有广泛的应用。许多微生物来源的或用基因工程菌表达的α-半乳糖苷酶属胞内酶，需要破碎细胞壁以释放其活性。细胞壁的破碎方法很多，已有研究者用研磨、超声波、高压匀浆、酸洗玻璃珠漩涡振荡、反复冻融、酶解、煮沸等方法来破碎细胞壁提取胞内活性物质。
本研究以大肠杆菌表达的水稻α-半乳糖苷酶基因工程菌为对象，比较采用超声波破碎、溶菌酶降解及菌体反复冻融3种方法破碎菌体对酶活性释放的影响，筛选最适的破碎条件，为进一步实现酶的纯化奠定基础。
1 材料与方法
1.1 供试材料
水稻α-半乳糖苷酶基因工程菌（pET32-84411/Origami），由沈阳师范大学食品生物技术实验室提供；所用试剂购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。
1.2 仪器设备
洁净工作台，全温培养振荡器，恒温水浴槽，超声波细胞破碎机，冷冻离心机，制冰机，紫外可见分光光度计。
1.3 试验方法
1.3.1 菌体制备 将水稻α-半乳糖苷酶基因工程菌按接种量5.0%接种于LB液体培养基（含氨苄青霉素50.0 μg/mL、卡那霉素15.0 μg/mL、四环素12.5
μg/mL）中，加入0.7%的IPTG，20 ℃下诱导表达48 h，然后在4 ℃下以5 000 r/min离心15min，获得菌体沉淀。
1.3.2 α-半乳糖苷酶基因工程菌细胞破碎条件 按所获得固体菌体质量的4倍体积加入HEPES缓冲液（pH=7.0），采用以下3种方法进行菌体破碎，然后在4 ℃下以10 000 r/min离心20 min，取上清液待测。破碎方法：1） 在超声波条件下破碎细胞。将超声波功率分别设置为100 W，200 W，300 W，400 W，处理时间30～180 s。2） 在反复冻融条件下破碎细胞。将加有缓冲液的菌体放入-80 ℃的冰箱里快速冻结，之后置于冰浴溶解，冻融的次数分别为1次、3次、5次、7次、9次。3） 在加溶菌酶条件下破碎细胞。将溶菌酶按浓度1，2，3，4，5 mg/mL加入重悬菌液中，于室温下处理1，2，3，4，5 h。
1.3.3 α-半乳糖苷酶活性的测定 测定方法参照文献[1]。
2 结果与分析
2.1 超声波对菌体细胞破碎的影响
4种超声波功率不同时间下菌体细胞破碎结果如图1所示。
由图1可见：200 W超声波破碎处理下酶的活性最强；随作用时间的延长菌液的酶活性增强，破碎时间在90 s之后酶活性的增长趋于缓慢。说明破碎功率过大或过小对α-半乳糖苷酶活性都会有负效应。
2.2 反复冻融对菌体细胞破碎的影响
反复冻融条件下菌体细胞破碎结果如图2所示。
由图2可见，随着冻融次数的增加酶活性释放显著增强，5次以后趋于平缓。
2.3 溶菌酶对菌体细胞破碎的影响
溶菌酶对菌体细胞壁的作用如图3和图4所示。
由图3和图4可见：当溶菌酶的作用时间达到3 h，浓度达到2 mg/mL之后，酶活性趋于稳定。但总体而言，对α-半糖苷酶酶活性影响有限。
2.4 不同破碎条件对菌体细胞破碎影响的比较
就酶活性而言，图5对比了5种不同破碎条件对α-半糖苷酶酶活性的影响。可见，超声波功率为200 W时破碎1 min时获得菌液的酶活性是最高的，而溶菌酶处理及菌体反复冻融均没有取得理想效果。
3 结论
超声波对大肠杆菌表达的α-半乳糖苷酶菌体细胞的破碎是最为有效的，当破碎时间为1 min、功率为200 W时，α-半乳糖苷酶基因工程菌菌液酶活性最高达到7.757 7 U/mL，且操作简单，处理时间短。反复冻融和溶菌酶处理虽然也是破碎菌体细胞壁的有效方法，但对酶活性的负效应较大。
参考文献
[1] 李苏红，朱旻鹏，李拖平.重组水稻α-半乳糖苷酶的分离纯化及酶学性质研究[J].食品科学，2010，31（21）：304-307.
[2] BOZENA C，ANNEKATRIN D，KARIN K.Regulation of alpha-galactosidase gene expression in primary foliage leaves of barley
（Hordeum vulgare L.） during dark-induced senescence[J].Planta，2004，218（5）：886-889.
[3] CHROST B，KRUPINSKA K.Gene with homologies to known α-galactosidase are expressed during senescence of barley leaves[J]. Physiol.Plant，2000（110）：111-119.
[4] BEUTLER E，KUHL W.Purification and properties of human α-galactosidase[J].Bio.Chem.，1972（247）：7 195-7 200.
[5] PUCHART V，VRSANSKA M，MAHAKINGESHWARA KB，etal.Purification and characterization of α-galactosidase from a
thermophilic fungus Themomyces lanuginosus[J].Biochem.Biophys.Acta，2000（1524）：27-37.
[6] 杨翠竹，李艳，阮南，等.酵母细胞破壁技术研究与应用进展[J].食品科技，2006（7）：138-142.
[7] 李兰，张明霞，袁金辉.不同破壁方法对细菌产SOD活性的影响[J].食品工业科技，2008，29（10）：108-111.
Abstract： The research studies the E.coli expressed rice. It studied cell disruption conditions of α-Galactosidase Gene Engineering. It used 3 methods for the examination： ultrasonic-break， lysozyme treatment， and thalli repeated freeze-thaw to disrupt cells， using liquid enzyme activity as indicator. The results showed that the optimal disruption is ultrasonic-breaking at power 200 W for 1 min and the α-galactosidase activity was yield at 7.757 7 U/mL； under the condition of thalli repeated freeze-thaw， the liquid enzyme activity increased with the number of freeze-thaw increasing， but the treatment time is too long； similarly， the α-galactosidase activity was enhanced by a rise of the lysozyme concentration and prolongation of treatment time， whereas， it was limited by longer treating time， higher lysozyme dosage and incomplete cell break.
Key words： α-galactosidase； ultrasonic-breaking； lysozyme； freeze-thawing
U/mL，细胞破碎效果最好；菌体反复冻融条件下测得的菌液酶活性随冻融次数的增加而增大，但样品处理时间过长；菌液酶活性随加入溶菌酶浓度增加而增加，但有处理时间长、用量大、细胞破碎不完全的缺点。
关键词：α-半乳糖苷酶；超声波破碎；溶菌酶；反复冻融
中图分类号：Q55 文献标识码：A 文章编号：1674-1161（2014）10-0037-03
α-半乳糖苷酶（α-Galactosidase， EC 3.2.1.22）属外切糖苷酶，其专一性地催化半乳聚糖中非还原末端α-半乳糖苷键的水解，并能作用于含有α-半乳糖苷的糖蛋白和糖脂质，广泛存在于植物、动物和微生物中，在食品、医药、饲料等诸多领域有广泛的应用。许多微生物来源的或用基因工程菌表达的α-半乳糖苷酶属胞内酶，需要破碎细胞壁以释放其活性。细胞壁的破碎方法很多，已有研究者用研磨、超声波、高压匀浆、酸洗玻璃珠漩涡振荡、反复冻融、酶解、煮沸等方法来破碎细胞壁提取胞内活性物质。
本研究以大肠杆菌表达的水稻α-半乳糖苷酶基因工程菌为对象，比较采用超声波破碎、溶菌酶降解及菌体反复冻融3种方法破碎菌体对酶活性释放的影响，筛选最适的破碎条件，为进一步实现酶的纯化奠定基础。
1 材料与方法
1.1 供试材料
水稻α-半乳糖苷酶基因工程菌（pET32-84411/Origami），由沈阳师范大学食品生物技术实验室提供；所用试剂购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。
1.2 仪器设备
洁净工作台，全温培养振荡器，恒温水浴槽，超声波细胞破碎机，冷冻离心机，制冰机，紫外可见分光光度计。
1.3 试验方法
1.3.1 菌体制备 将水稻α-半乳糖苷酶基因工程菌按接种量5.0%接种于LB液体培养基（含氨苄青霉素50.0 μg/mL、卡那霉素15.0 μg/mL、四环素12.5
μg/mL）中，加入0.7%的IPTG，20 ℃下诱导表达48 h，然后在4 ℃下以5 000 r/min离心15min，获得菌体沉淀。
1.3.2 α-半乳糖苷酶基因工程菌细胞破碎条件 按所获得固体菌体质量的4倍体积加入HEPES缓冲液（pH=7.0），采用以下3种方法进行菌体破碎，然后在4 ℃下以10 000 r/min离心20 min，取上清液待测。破碎方法：1） 在超声波条件下破碎细胞。将超声波功率分别设置为100 W，200 W，300 W，400 W，处理时间30～180 s。2） 在反复冻融条件下破碎细胞。将加有缓冲液的菌体放入-80 ℃的冰箱里快速冻结，之后置于冰浴溶解，冻融的次数分别为1次、3次、5次、7次、9次。3） 在加溶菌酶条件下破碎细胞。将溶菌酶按浓度1，2，3，4，5 mg/mL加入重悬菌液中，于室温下处理1，2，3，4，5 h。
1.3.3 α-半乳糖苷酶活性的测定 测定方法参照文献[1]。
2 结果与分析
2.1 超声波对菌体细胞破碎的影响
4种超声波功率不同时间下菌体细胞破碎结果如图1所示。
由图1可见：200 W超声波破碎处理下酶的活性最强；随作用时间的延长菌液的酶活性增强，破碎时间在90 s之后酶活性的增长趋于缓慢。说明破碎功率过大或过小对α-半乳糖苷酶活性都会有负效应。
2.2 反复冻融对菌体细胞破碎的影响
反复冻融条件下菌体细胞破碎结果如图2所示。
由图2可见，随着冻融次数的增加酶活性释放显著增强，5次以后趋于平缓。
2.3 溶菌酶对菌体细胞破碎的影响
溶菌酶对菌体细胞壁的作用如图3和图4所示。
由图3和图4可见：当溶菌酶的作用时间达到3 h，浓度达到2 mg/mL之后，酶活性趋于稳定。但总体而言，对α-半糖苷酶酶活性影响有限。
2.4 不同破碎条件对菌体细胞破碎影响的比较
就酶活性而言，图5对比了5种不同破碎条件对α-半糖苷酶酶活性的影响。可见，超声波功率为200 W时破碎1 min时获得菌液的酶活性是最高的，而溶菌酶处理及菌体反复冻融均没有取得理想效果。
3 结论
超声波对大肠杆菌表达的α-半乳糖苷酶菌体细胞的破碎是最为有效的，当破碎时间为1 min、功率为200 W时，α-半乳糖苷酶基因工程菌菌液酶活性最高达到7.757 7 U/mL，且操作简单，处理时间短。反复冻融和溶菌酶处理虽然也是破碎菌体细胞壁的有效方法，但对酶活性的负效应较大。
参考文献
[1] 李苏红，朱旻鹏，李拖平.重组水稻α-半乳糖苷酶的分离纯化及酶学性质研究[J].食品科学，2010，31（21）：304-307.
[2] BOZENA C，ANNEKATRIN D，KARIN K.Regulation of alpha-galactosidase gene expression in primary foliage leaves of barley
（Hordeum vulgare L.） during dark-induced senescence[J].Planta，2004，218（5）：886-889.
[3] CHROST B，KRUPINSKA K.Gene with homologies to known α-galactosidase are expressed during senescence of barley leaves[J]. Physiol.Plant，2000（110）：111-119.
[4] BEUTLER E，KUHL W.Purification and properties of human α-galactosidase[J].Bio.Chem.，1972（247）：7 195-7 200.
[5] PUCHART V，VRSANSKA M，MAHAKINGESHWARA KB，etal.Purification and characterization of α-galactosidase from a
thermophilic fungus Themomyces lanuginosus[J].Biochem.Biophys.Acta，2000（1524）：27-37.
[6] 杨翠竹，李艳，阮南，等.酵母细胞破壁技术研究与应用进展[J].食品科技，2006（7）：138-142.
[7] 李兰，张明霞，袁金辉.不同破壁方法对细菌产SOD活性的影响[J].食品工业科技，2008，29（10）：108-111.
Abstract： The research studies the E.coli expressed rice. It studied cell disruption conditions of α-Galactosidase Gene Engineering. It used 3 methods for the examination： ultrasonic-break， lysozyme treatment， and thalli repeated freeze-thaw to disrupt cells， using liquid enzyme activity as indicator. The results showed that the optimal disruption is ultrasonic-breaking at power 200 W for 1 min and the α-galactosidase activity was yield at 7.757 7 U/mL； under the condition of thalli repeated freeze-thaw， the liquid enzyme activity increased with the number of freeze-thaw increasing， but the treatment time is too long； similarly， the α-galactosidase activity was enhanced by a rise of the lysozyme concentration and prolongation of treatment time， whereas， it was limited by longer treating time， higher lysozyme dosage and incomplete cell break.
Key words： α-galactosidase； ultrasonic-breaking； lysozyme； freeze-thawing