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目的 建立高效的疟原虫种属特异性检测方法。方法 设计疟原虫种（核糖体18S rRNA,4对）和属（线粒体基因,1对）特异性引物,与通用引物（5′-CGAGTCCTGCGGTCTCAAATT-3′）连接后,形成5对嵌合特异性引物。常规PCR确定各对引物的最佳退火温度和引物浓度,多重PCR优化5对引物混合后的最佳反应条件,建立反应体系（命名为P5-mPCR方法）。用P5-mPCR检测不同原虫密度的间日疟原虫（Pv）、三日疟原虫（Pm）、卵形疟原虫（Po）、恶性疟原虫（Pf）感染者血样和模拟混合感染样品,确定P5-mPCR方法的检测灵敏度。用日本血吸虫、刚地弓形虫、杜氏利什曼原虫、猪囊尾蚴、卫氏并殖吸虫、隐孢子虫等其他寄生虫感染者血样或虫体DNA评价P5-mPCR方法的特异性。用212份疟疾送检血样,与巢式PCR方法比较评价其应用价值。结果 优化后的P5-mPCR反应体系各组分含量（体积比）为:DNA模板10%、引物Mix 5%、ddH2O35%,Taq酶预混液50%。反应体系的最佳循环条件为:95℃5 min;94℃15 s,,58℃20 s,72℃20 s,循环5次;94℃15 s,62℃20 s,72℃20 s,循环10次:94℃15 s,68℃20 s,72℃20 s,循环25次;72℃3min;10℃5min。扩增产物的长度分别为:Pv 778 bp,Pm 582 bp,Po 400 bp,pf 256 bp,疟原虫属334 bp。其检测灵敏度分别为4.49、5.45、6.39、4.07个虫/μl血（种特异性检测平均值为4.85个虫/μl血）和0.10～1.07个虫/μl血（属特异性检测的平均值为0.41个虫/μl血）。P5-mPCR检测含有50～200个虫/μl血的模拟混合样品,各特异性扩增条带均清晰可见;检测日本血吸虫、刚地弓形虫、杜氏利什曼原虫、猪囊尾蚴、卫氏并殖吸虫、隐孢子虫等其他寄生虫样品,结果均为阴性。巢式PCR和P5-mPCR检测212份疟疾送检血样,两种方法检测结果的一致性较高（Kappa=0.866,P<0.01）,检出的阳性率分别为75.0%（159/212）和79.7%（169/212）,差异具有统计学意义（x2=8.100,P<0.01）。从分型诊断来看,两者的差异主要来源于Pf（P<0.01）和Po（P<0.05）样品,对Pv、Pm和混合感染血样的检测结果,两种方法差异无统计学意义。结论 本研究建立的P5-mPCR方法具有敏感性高,特异性好,操作简便快速,检测结果易于判断,一次反应即可确定4种人体疟原虫。