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摘要：【目的】分析預测葡萄霜霉菌糖基水解酶（Glycoside hydrolases，GHs）基因家族，为深入研究GHs基因在葡萄霜霉菌致病过程中的作用机理提供理论依据。【方法】利用SignalP 5.0 Server、Cluster W、MEGA 6.0和MEME等生物信息学相关软件对已发表的葡萄霜霉菌全基因组60个GHs基因的基本特征、基因组分布特点及其编码蛋白保守基序、结构域和亚细胞定位等进行生物信息学分析。【结果】葡萄霜霉菌60个GHs基因编码的蛋白长度在128～774 aa，且大部分集中在200～500 aa，其中53个蛋白具有信号肽，蛋白质分子量在14.90～85.45 kD，理论等电点（pI）在3.85～10.39;这些基因在基因组中分布不均匀，其中有27个GHs基因存在串联重复和成簇聚集分布现象，数目最多的3个GHs家族（GH131、GH17和GH6）集中分布在7个scaffold中;序列比对和系统发育进化树分析发现，串联重复和成簇聚集分布的GHs基因处于同一个分支中;motif富集分析发现3个不同的motif，且motif2在葡萄霜霉菌GH6、GH17和GH131等3个家族基因中保守，结构域分析推测大部分GHs家族基因均参与细胞壁的生物过程;亚细胞定位预测结果表明，有53个GHs蛋白定位于细胞外，3个定位在细胞质内，4个定位于线粒体上。【结论】葡萄霜霉菌在侵染寄主的过程中可能会分泌多种GHs酶类来破坏细胞壁的结构，以帮助其在寄主植物中成功定殖。
关键词： 葡萄霜霉菌;糖基水解酶;分泌蛋白;生物信息学
中图分类号： S432.1;S436.631.1 文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2021）05-1229-09
Abstract：【Objective】Analyzed and predicted the glycoside hydrolases （GHs） gene family of Plasmopara viticola， and conducted bioinformatics analysis to provide theoretical basis for in-depth study of the molecular mechanism of GHs gene in pathogenicity of downy mildew.【Method】This study used SignalP 5.0 Server， Cluster W， MEGA6.0， MEME and other bioinformatics-related softwares to analyze the basic characteristics and the encoded proteins， genome distribution characteristics， conserved motifs， structural domains and subcellular location of the 60 GHs genes of the published whole genome of P. viticola.【Result】The protein sizes encoded by 60 GHs genes of P. viticola were between 128 and 774 aa， and most of them were concentrated between 200 and 500 aa. Among them， 53 proteins had signal peptides， and the molecular mass of the protein was between 14.90 and 85.45 kD. The theoretical isoelectric points（pI） was between 3.85 and 10.39. These genes were unevenly distributed in the genome. Twenty-seven of them had tandem repeats and clustering distribution， and the 3 GHs families（GH131， GH17 and GH6） with the largest number were concentrated in 7 scaffolds. Moreover， sequence alignment and phylogenetic tree analysis found that these tandem repeats and clusters of GHs genes were in the same phylogenetic tree branch. The motif enrichment analysis found 3 different motifs， and motif2 was conserved in GH6， GH17 and GH131 family genes of P. viticola. The domain analysis speculated that most GHs family genes were involved in the biological process of the cell wall. The subcellular localization prediction results showed that there were 53 GHs proteins located extracellular， 3 localized in the cytoplasm， and 4 localized on the mitochondria. 【Conclusion】The results of bioinformatics analysis show that during the process of infecting the host， P. viticola may secrete a variety of GHs enzymes to destroy the structure of the cell wall and help it successfully colonize the host plant. This will cla-rify the function of the GHs family genes encoded by P. viticola and the molecular mechanism of pathogenicity. Key words： Plasmopara viticola; glycoside hydrolase; secreted protein; bioinformatics
Foundation item： National Natural Science Foundation of China（31860493）; Bagui Young Scholars’ Special Fund of Guangxi（2019）; Basic Research Project of Guangxi Academy of Agricultural Sciences（Guinongke 2019M06，2020YM 129）
0 引言
【研究意义】葡萄霜霉病是危害葡萄生长的第一大卵菌病害，该病传播快、发病重、毁灭性强，可通过侵染叶片、嫩茎、卷须及花序等绿色组织而严重影响葡萄的产量和品质（Gessler et al.，2011;闫思远等，2020）。葡萄霜霉菌（Plasmopara viticola）是该病的致病菌，属于专性寄生活体营养型卵菌（Fr?bel and Zyprian，2019）。在侵染寄主植物的过程中，病原菌通过分泌碳水化合物活性酶（Carbohydrateactive enzymes，CAZymes）用于降解植物的细胞壁，以利于自身的入侵、定殖和营养供给（Ronald and Visser，2001），这些酶包括果胶酶（Pectinase）、多聚半乳糖醛酸酶（Polygalacturonase，PG）、糖基水解酶（Glycoside hydrolases，GHs）、纤维素酶（Cellulase）和葡聚糖酶（Dextranase）。已有研究表明，植物病原菌在侵染寄主的过程中会分泌多种GHs酶类来破坏细胞壁的结构，而且GHs酶谱与病原菌寄生類型密切相关（陈相永等，2014）。因此，深入分析葡萄霜霉菌全基因组GHs基因家族的特征，可为后期研究GHs基因在霜霉菌致病过程中的作用提供理论依据。【前人研究进展】2002年，Brunner等从马铃薯晚疫病菌（Phytophthora infestans）中分离纯化出85 kD的β-葡萄糖苷酶/木糖苷酶（BGX1），这是第一个在公共数据库中存放的来源于卵菌的糖基水解酶，属于糖苷水解酶家族30（GH30），之后对植物卵菌糖基水解酶的研究进展较缓慢。近10年来，随着多种植物致病卵菌基因组测序的完成，大量的GHs基因通过生物信息学手段被预测出来，但对其具体功能的研究尚处于起步阶段，远少于细菌和真菌中对此类酶类的研究（Tyler et al.，2006;Haas et al.，2009;Baxter et al.，2010;Lévesque et al.，2010;Sharma et al.，2015）。水稻纹枯病菌（Rhizoctonia solani）的内切葡聚糖酶（EG1）可作为一种激发子，大豆疫霉（P. sojae）分泌的GH12蛋白XEG1以及黄萎病菌（Verticillium dahliae）产生的2个GH12蛋白VdEG1和VdEG3均可作为病原相关分子模式（Pathogen associated molecular patterns，PAMPs）来触发寄主的免疫反应（Ma et al.，2015a;Ma et al.，2015b，2017;Gui et al.，2017）。此外，病原菌对宿主的毒力也需要GHs的参与，灰霉菌（Botrytis cinerea）xyn11A基因的敲除会导致灰霉菌毒力下降（Brito et al.，2006），寄生疫霉（P. parasitica）GH10家族的2种木聚糖酶ppxyn1和ppxyn2沉默可降低病原体对烟草和番茄的毒力（Lai and Liou，2018），禾谷丝禾菌（R. cerealis）木聚糖酶RcXYN1是禾谷丝禾菌感染小麦的主要致病因素之一（Lu et al.，2020），这些GHs在病原体感染过程中均发挥着至关重要的作用。【本研究切入点】前期本团队完成了葡萄霜霉菌的全基因组测序，并预测出60个GHs基因，但未对这些GHs基因进行系统分析。【拟解决的关键问题】根据前期鉴定的GHs基因结果，利用生物信息学软件分析这些GHs基因的基本特征、基因组分布特点及其编码蛋白保守基序、结构域和亚细胞定位等，以期为深入研究GHs基因在葡萄霜霉菌致病过程中的作用机理提供理论依据。
1 材料与方法
1. 1 基因组来源
葡萄霜霉菌GHs家族基因编码的蛋白氨基酸序列来自于本课题组2017年发布的葡萄霜霉菌基因组分析得到的60个GHs（Yin et al.，2017）。
1. 2 理化特性分析和蛋白信号肽预测
利用BioXM 2.6预测GHs家族60个GHs基因编码的蛋白分子量和理论等电点（pI）。利用SignalP 5.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）在线分析软件对蛋白氨基酸序列进行信号肽预测。
1. 3 基因组分布分析
根据基因组注释的gff文件，提取GHs家族基因的注释信息，统计其在基因组中的位置信息及scaffold分布情况，分析其串联重复及基因组集中成簇分布的情况。
1. 4 蛋白氨基酸序列比对和系统发育进化树构建
先使用Cluster W对蛋白氨基酸序列进行联配，再利用MEGA 6.0中的Neighbor-joining法构建系统发育进化树，bootstrap值为1000。
1. 5 保守基序和结构域分析
保守基序和保守结构域分析是挖掘蛋白功能结构的主要方式之一。利用MEME（http：//meme-suite.org）分析蛋白的保守基序，motif设置为3，motifs宽度设置为6～50。使用NCBI CD-Search工具鉴定蛋白的保守结构域或功能单位。 1. 6 亚细胞定位分析
先根据信号肽分析结果去除蛋白序列的信号肽部分，然后利用在线WoLF PSORT软件（https：//wolfpsort.hgc.jp/）对剩余的序列进行亚细胞定位分析。
2 结果与分析
2. 1 葡萄霜霉菌GHs家族60个GHs基因的基本情况
对GHs家族60个GHs基因编码的蛋白理化性质分析发现，60个GHs基因编码蛋白长度为128～774 aa，且大部分（45个）集中在200～500 aa，蛋白分子量在14.90～85.45 kD，pI在3.85～10.39（表1和表2）。
利用SignalP 5.0 Server在线软件对60个GHs基因进行信号肽预测，结果（表1）显示，只有来自GH19、GH23、GH102和GH109等4个家族的蛋白不具有信號肽，其他家族的53个蛋白均具有信号肽序列，长度在16～27 aa。
2. 2 基因组分布分析结果
分析了60个GHs基因在基因组上的分布情况，结果（表3）发现60个基因在基因组中的分布并不均匀，有45%（27个）的基因存在串联重复和成簇聚集分布现象，集中分布在基因组的11个scaffold中。特别是数目最多的3个家族GH131、GH17和GH6，分别有8、6和7个基因集中分布在7个scaffold中。表3中标注黄色高亮的基因是与通过Orthomcl基因家族聚类结果一致的相关基因，而Orthomcl中同一个家族的基因是通过基因的多拷贝而形成。
2. 3 序列比对和系统发育进化树分析结果
从序列比对和系统发育进化树分析中可发现，在基因组中串联重复和成簇聚集分布的GHs基因均处于同一个分支中（图1）。可能说明以串联重复和成簇分布为特点的基因多拷贝对GHs家族的基因数目增多和GHs家族基因进化起到关键作用。
2. 4 蛋白保守基序和结构域分析结果
motif富集分析发现3个不同的motif，其中具有信号肽的GH6、GH17和GH131家族蛋白均存在motif2（YRTNLKKAIAFLNKNAWAEJYLDLGYWEI）（图2），而其他GHs家族蛋白中并无特征性motif，说明motif2在葡萄霜霉菌GH6、GH17和GH131等3个家族蛋白中保守。
保守结构域分析结果（表4）发现，最大的3个GHs家族GH6、GH17和GH131中，GH6家族蛋白有6个结构域，分别为Glyco_hydro_6 super family、DedD super family、gliding_GltJ super family、Herpes_BLLF1 super family、PRK13042 super family和rad23 super family，研究表明卵菌腐霉菌（Pythium）GH6家族蛋白具有作用于卵菌细胞壁的相关功能，因其均具有与细胞壁相关的结构域（Lévesque et al.，2010），真菌稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）GH6家族的纤维素酶对病菌的毒力有一定贡献（Van Vu et al.，2012），而葡萄霜霉菌GH6家族的3个蛋白均具有信号肽，其中有10个定位于细胞外，推测葡萄霜霉菌GH6家族蛋白可能分泌到细胞外靶向作用于植物的细胞壁;GH17家族蛋白有3个结构域，其中结构域Glyco_hydro super family也存在于GH72家族，番茄叶霉病病原褐孢霉（Cladosporium fulvum）GH17家族中的CfGH17-1蛋白具有1，3-β-葡聚糖酶活性，其可靶向宿主细胞壁以去除糖分子从而帮助真菌在宿主中的生长和繁殖（Kmen et al.，2019），葡萄霜霉菌GH17家族中9个蛋白均具有信号肽，并且均定位于细胞外，其中可能有靶向细胞壁从而在卵菌中发挥重要作用的基因;GH131家族蛋白有1个结构域，为GH131_N super family，其是在灰盖鬼伞菌（Coprinopsis cinerea）糖基水解酶家族131蛋白（GH131A）中发现的N末端结构域，对β-葡聚糖具有双功能外切-β-1，3-/-1，6和内切-β-1，4活性（Jiang et al.，2013），且有研究表明，真菌可分泌GH131家族蛋白从而破坏植物细胞壁结构，帮助真菌定殖在植物组织中（Anasontzis et al.，2019），推测葡萄霜霉菌GH131家族GH蛋白也可能具有该功能。除了最大的3个家族外，其他的一些GHs家族也有相关报道，其中，产紫青霉菌（Penicillium purpurogenum）分泌的GH30家族木聚糖酶对阿拉伯木聚糖和葡萄糖醛酸木聚糖均有活性（Espinoza and Eyzaguirre，2018），GH28家族蛋白的结构域参与细胞壁或膜的生物过程（Yadav and Yadav，2012），在细胞壁代谢过程中发挥重要作用，并且具有信号肽;GH19家族蛋白的结构域为chitinase_GH19和Lyz-like super family，其可编码几丁质酶，第1个在真菌和微孢子虫中报道的GH19家族的几丁质酶是NbchiA，推测其可能参与极管穿过孢子壁的过程（Han et al.，2016）。据此推测葡萄霜霉菌在侵染寄主的过程中可能会通过分泌多种GHs酶类来破坏细胞壁的结构，以帮助其在寄主植物中成功定殖。
2. 5 亚细胞定位分析结果
利用WoLF PSORT对GHs蛋白进行亚细胞定位分析，结果（表4）发现，有53个GHs蛋白分泌到细胞外（Extracellular），其中有3个来自GH102家族和GH19家族的蛋白虽无信号肽序列（表1），但也定位到细胞外，可能通过其他的分泌途径分泌到胞外;其余7个GHs蛋白中有3个定位在细胞质（Cytoplasmic）内，4个定位于线粒体（Mitochondrial）上。 3 讨论
在自然界中，植物与病原菌一直进行着动态竞赛，植物通过物理屏障、先天性免疫或生理生化机制等多层次的防御来抵抗病原菌的侵袭;而病原菌则可通过多种多样的致病因子进入植物体内，帮助其抑制植物的免疫反应，从而达到致病的目的。植物细胞壁是病原菌入侵植物的第一道屏障，为了穿透植物细胞壁而实现在宿主体内定殖，病原菌会分泌多种细胞壁降解酶类来分解植物细胞壁，其中，糖基水解酶是较重要的一种。根据预测结构和序列的相似性，CAZy数据库将GHs基因分为167个家族（Turbe-Doan et al.，2019），其中GH5、 GH6、GH12和GH45是最常见的4个家族。已有研究表明，GHs基因数量与病原菌的生活方式密切相关（陈相永等，2014）。本研究葡萄霜霉菌基因组测序数据中，预测出60个GHs基因，属于15个GHs家族，其中数量较多的是GH6、GH17和GH131家族。在啤酒花霜霉菌（Pseudoperonospora humuli）中有61种CAZymes，黄瓜霜霉病菌（P. cubensis）中有39种CAZymes（Purayannur et al.，2020），爬山虎霜霉菌（Plasmopara muralis）中有115个GHs基因（Dussert et al.，2019），拟南芥霜霉菌（Hyaloperonospora arabidopsidis）中有100个GHs基因（Baxter et al.，2010）。在半活体营养型疫霉基因组中含有166～216个GHs基因，其中GH1、GH3和GH5是最大的家族（Adhikari et al.，2013）。由此可见，活体营养的霜霉菌分泌的CAZymes及GHs基因数量与半活体的疫霉菌相比极大减少，这可能有利于病原菌在抑制植物免疫的同时，可最大程度地汲取寄主植物体内的营养，更有利于其存活。
病原菌在侵染寄主植物的过程中分泌多种类型的GHs酶来应对细胞壁的不同多糖组分。除GH6、GH17和GH131家族外，葡萄霜霉菌中还存在GH3、GH5、GH7、GH19、GH23、GH28、GH30、GH32、GH43、GH72、GH102和GH109家族。GH7家族蛋白主要存在于真菌中，在細菌或古细菌中尚未被发现（Payne et al.，2015）。GH7家族蛋白广泛存在于植物病原卵菌和真菌中，大豆疫霉分泌的PsGH7a广泛存在于植物病原卵菌和真菌中，其缺失造成大豆疫霉毒力显著下降（Tan et al.，2020）。GH3和GH5是疫霉基因组中最大的家族，可能参与纤维素降解（Brouwer et al.，2014）。GH12和GH31家族蛋白与木葡聚糖降解有关（Zerillo et al.，2013），但葡萄霜霉菌基因组与终极腐霉（Pythium ultimum）基因组一样均缺失了GH12家族（Lévesque et al.，2010）。虽然目前对于卵菌GHs蛋白在致病过程中的功能研究尚少，但根据已有的研究推测，葡萄霜霉菌GHs家族蛋白可能在侵染寄主的过程中参与降解寄主细胞壁，进而帮助其侵入定殖，发挥毒力。因此，后续将对3个较大的GHs家族蛋白在葡萄霜霉菌致病过程中的生物学功能进行研究。
4 结论
通过生物信息学分析葡萄霜霉菌全基因组60个GHs基因的基本特征、基因组分布特点及其编码保守基序、结构域和亚细胞定位的结果，推测葡萄霜霉菌在侵染寄主的过程中可能会分泌多种GHs酶类来破坏细胞壁的结构，帮助其在寄主植物中成功定殖，这将为阐明葡萄霜霉菌编码的GHs家族基因功能和致病分子机制等提供理论依据。
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（責任编辑 麻小燕）
关键词： 葡萄霜霉菌;糖基水解酶;分泌蛋白;生物信息学
中图分类号： S432.1;S436.631.1 文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2021）05-1229-09
Abstract：【Objective】Analyzed and predicted the glycoside hydrolases （GHs） gene family of Plasmopara viticola， and conducted bioinformatics analysis to provide theoretical basis for in-depth study of the molecular mechanism of GHs gene in pathogenicity of downy mildew.【Method】This study used SignalP 5.0 Server， Cluster W， MEGA6.0， MEME and other bioinformatics-related softwares to analyze the basic characteristics and the encoded proteins， genome distribution characteristics， conserved motifs， structural domains and subcellular location of the 60 GHs genes of the published whole genome of P. viticola.【Result】The protein sizes encoded by 60 GHs genes of P. viticola were between 128 and 774 aa， and most of them were concentrated between 200 and 500 aa. Among them， 53 proteins had signal peptides， and the molecular mass of the protein was between 14.90 and 85.45 kD. The theoretical isoelectric points（pI） was between 3.85 and 10.39. These genes were unevenly distributed in the genome. Twenty-seven of them had tandem repeats and clustering distribution， and the 3 GHs families（GH131， GH17 and GH6） with the largest number were concentrated in 7 scaffolds. Moreover， sequence alignment and phylogenetic tree analysis found that these tandem repeats and clusters of GHs genes were in the same phylogenetic tree branch. The motif enrichment analysis found 3 different motifs， and motif2 was conserved in GH6， GH17 and GH131 family genes of P. viticola. The domain analysis speculated that most GHs family genes were involved in the biological process of the cell wall. The subcellular localization prediction results showed that there were 53 GHs proteins located extracellular， 3 localized in the cytoplasm， and 4 localized on the mitochondria. 【Conclusion】The results of bioinformatics analysis show that during the process of infecting the host， P. viticola may secrete a variety of GHs enzymes to destroy the structure of the cell wall and help it successfully colonize the host plant. This will cla-rify the function of the GHs family genes encoded by P. viticola and the molecular mechanism of pathogenicity. Key words： Plasmopara viticola; glycoside hydrolase; secreted protein; bioinformatics
Foundation item： National Natural Science Foundation of China（31860493）; Bagui Young Scholars’ Special Fund of Guangxi（2019）; Basic Research Project of Guangxi Academy of Agricultural Sciences（Guinongke 2019M06，2020YM 129）
0 引言
【研究意义】葡萄霜霉病是危害葡萄生长的第一大卵菌病害，该病传播快、发病重、毁灭性强，可通过侵染叶片、嫩茎、卷须及花序等绿色组织而严重影响葡萄的产量和品质（Gessler et al.，2011;闫思远等，2020）。葡萄霜霉菌（Plasmopara viticola）是该病的致病菌，属于专性寄生活体营养型卵菌（Fr?bel and Zyprian，2019）。在侵染寄主植物的过程中，病原菌通过分泌碳水化合物活性酶（Carbohydrateactive enzymes，CAZymes）用于降解植物的细胞壁，以利于自身的入侵、定殖和营养供给（Ronald and Visser，2001），这些酶包括果胶酶（Pectinase）、多聚半乳糖醛酸酶（Polygalacturonase，PG）、糖基水解酶（Glycoside hydrolases，GHs）、纤维素酶（Cellulase）和葡聚糖酶（Dextranase）。已有研究表明，植物病原菌在侵染寄主的过程中会分泌多种GHs酶类来破坏细胞壁的结构，而且GHs酶谱与病原菌寄生類型密切相关（陈相永等，2014）。因此，深入分析葡萄霜霉菌全基因组GHs基因家族的特征，可为后期研究GHs基因在霜霉菌致病过程中的作用提供理论依据。【前人研究进展】2002年，Brunner等从马铃薯晚疫病菌（Phytophthora infestans）中分离纯化出85 kD的β-葡萄糖苷酶/木糖苷酶（BGX1），这是第一个在公共数据库中存放的来源于卵菌的糖基水解酶，属于糖苷水解酶家族30（GH30），之后对植物卵菌糖基水解酶的研究进展较缓慢。近10年来，随着多种植物致病卵菌基因组测序的完成，大量的GHs基因通过生物信息学手段被预测出来，但对其具体功能的研究尚处于起步阶段，远少于细菌和真菌中对此类酶类的研究（Tyler et al.，2006;Haas et al.，2009;Baxter et al.，2010;Lévesque et al.，2010;Sharma et al.，2015）。水稻纹枯病菌（Rhizoctonia solani）的内切葡聚糖酶（EG1）可作为一种激发子，大豆疫霉（P. sojae）分泌的GH12蛋白XEG1以及黄萎病菌（Verticillium dahliae）产生的2个GH12蛋白VdEG1和VdEG3均可作为病原相关分子模式（Pathogen associated molecular patterns，PAMPs）来触发寄主的免疫反应（Ma et al.，2015a;Ma et al.，2015b，2017;Gui et al.，2017）。此外，病原菌对宿主的毒力也需要GHs的参与，灰霉菌（Botrytis cinerea）xyn11A基因的敲除会导致灰霉菌毒力下降（Brito et al.，2006），寄生疫霉（P. parasitica）GH10家族的2种木聚糖酶ppxyn1和ppxyn2沉默可降低病原体对烟草和番茄的毒力（Lai and Liou，2018），禾谷丝禾菌（R. cerealis）木聚糖酶RcXYN1是禾谷丝禾菌感染小麦的主要致病因素之一（Lu et al.，2020），这些GHs在病原体感染过程中均发挥着至关重要的作用。【本研究切入点】前期本团队完成了葡萄霜霉菌的全基因组测序，并预测出60个GHs基因，但未对这些GHs基因进行系统分析。【拟解决的关键问题】根据前期鉴定的GHs基因结果，利用生物信息学软件分析这些GHs基因的基本特征、基因组分布特点及其编码蛋白保守基序、结构域和亚细胞定位等，以期为深入研究GHs基因在葡萄霜霉菌致病过程中的作用机理提供理论依据。
1 材料与方法
1. 1 基因组来源
葡萄霜霉菌GHs家族基因编码的蛋白氨基酸序列来自于本课题组2017年发布的葡萄霜霉菌基因组分析得到的60个GHs（Yin et al.，2017）。
1. 2 理化特性分析和蛋白信号肽预测
利用BioXM 2.6预测GHs家族60个GHs基因编码的蛋白分子量和理论等电点（pI）。利用SignalP 5.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）在线分析软件对蛋白氨基酸序列进行信号肽预测。
1. 3 基因组分布分析
根据基因组注释的gff文件，提取GHs家族基因的注释信息，统计其在基因组中的位置信息及scaffold分布情况，分析其串联重复及基因组集中成簇分布的情况。
1. 4 蛋白氨基酸序列比对和系统发育进化树构建
先使用Cluster W对蛋白氨基酸序列进行联配，再利用MEGA 6.0中的Neighbor-joining法构建系统发育进化树，bootstrap值为1000。
1. 5 保守基序和结构域分析
保守基序和保守结构域分析是挖掘蛋白功能结构的主要方式之一。利用MEME（http：//meme-suite.org）分析蛋白的保守基序，motif设置为3，motifs宽度设置为6～50。使用NCBI CD-Search工具鉴定蛋白的保守结构域或功能单位。 1. 6 亚细胞定位分析
先根据信号肽分析结果去除蛋白序列的信号肽部分，然后利用在线WoLF PSORT软件（https：//wolfpsort.hgc.jp/）对剩余的序列进行亚细胞定位分析。
2 结果与分析
2. 1 葡萄霜霉菌GHs家族60个GHs基因的基本情况
对GHs家族60个GHs基因编码的蛋白理化性质分析发现，60个GHs基因编码蛋白长度为128～774 aa，且大部分（45个）集中在200～500 aa，蛋白分子量在14.90～85.45 kD，pI在3.85～10.39（表1和表2）。
利用SignalP 5.0 Server在线软件对60个GHs基因进行信号肽预测，结果（表1）显示，只有来自GH19、GH23、GH102和GH109等4个家族的蛋白不具有信號肽，其他家族的53个蛋白均具有信号肽序列，长度在16～27 aa。
2. 2 基因组分布分析结果
分析了60个GHs基因在基因组上的分布情况，结果（表3）发现60个基因在基因组中的分布并不均匀，有45%（27个）的基因存在串联重复和成簇聚集分布现象，集中分布在基因组的11个scaffold中。特别是数目最多的3个家族GH131、GH17和GH6，分别有8、6和7个基因集中分布在7个scaffold中。表3中标注黄色高亮的基因是与通过Orthomcl基因家族聚类结果一致的相关基因，而Orthomcl中同一个家族的基因是通过基因的多拷贝而形成。
2. 3 序列比对和系统发育进化树分析结果
从序列比对和系统发育进化树分析中可发现，在基因组中串联重复和成簇聚集分布的GHs基因均处于同一个分支中（图1）。可能说明以串联重复和成簇分布为特点的基因多拷贝对GHs家族的基因数目增多和GHs家族基因进化起到关键作用。
2. 4 蛋白保守基序和结构域分析结果
motif富集分析发现3个不同的motif，其中具有信号肽的GH6、GH17和GH131家族蛋白均存在motif2（YRTNLKKAIAFLNKNAWAEJYLDLGYWEI）（图2），而其他GHs家族蛋白中并无特征性motif，说明motif2在葡萄霜霉菌GH6、GH17和GH131等3个家族蛋白中保守。
保守结构域分析结果（表4）发现，最大的3个GHs家族GH6、GH17和GH131中，GH6家族蛋白有6个结构域，分别为Glyco_hydro_6 super family、DedD super family、gliding_GltJ super family、Herpes_BLLF1 super family、PRK13042 super family和rad23 super family，研究表明卵菌腐霉菌（Pythium）GH6家族蛋白具有作用于卵菌细胞壁的相关功能，因其均具有与细胞壁相关的结构域（Lévesque et al.，2010），真菌稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）GH6家族的纤维素酶对病菌的毒力有一定贡献（Van Vu et al.，2012），而葡萄霜霉菌GH6家族的3个蛋白均具有信号肽，其中有10个定位于细胞外，推测葡萄霜霉菌GH6家族蛋白可能分泌到细胞外靶向作用于植物的细胞壁;GH17家族蛋白有3个结构域，其中结构域Glyco_hydro super family也存在于GH72家族，番茄叶霉病病原褐孢霉（Cladosporium fulvum）GH17家族中的CfGH17-1蛋白具有1，3-β-葡聚糖酶活性，其可靶向宿主细胞壁以去除糖分子从而帮助真菌在宿主中的生长和繁殖（Kmen et al.，2019），葡萄霜霉菌GH17家族中9个蛋白均具有信号肽，并且均定位于细胞外，其中可能有靶向细胞壁从而在卵菌中发挥重要作用的基因;GH131家族蛋白有1个结构域，为GH131_N super family，其是在灰盖鬼伞菌（Coprinopsis cinerea）糖基水解酶家族131蛋白（GH131A）中发现的N末端结构域，对β-葡聚糖具有双功能外切-β-1，3-/-1，6和内切-β-1，4活性（Jiang et al.，2013），且有研究表明，真菌可分泌GH131家族蛋白从而破坏植物细胞壁结构，帮助真菌定殖在植物组织中（Anasontzis et al.，2019），推测葡萄霜霉菌GH131家族GH蛋白也可能具有该功能。除了最大的3个家族外，其他的一些GHs家族也有相关报道，其中，产紫青霉菌（Penicillium purpurogenum）分泌的GH30家族木聚糖酶对阿拉伯木聚糖和葡萄糖醛酸木聚糖均有活性（Espinoza and Eyzaguirre，2018），GH28家族蛋白的结构域参与细胞壁或膜的生物过程（Yadav and Yadav，2012），在细胞壁代谢过程中发挥重要作用，并且具有信号肽;GH19家族蛋白的结构域为chitinase_GH19和Lyz-like super family，其可编码几丁质酶，第1个在真菌和微孢子虫中报道的GH19家族的几丁质酶是NbchiA，推测其可能参与极管穿过孢子壁的过程（Han et al.，2016）。据此推测葡萄霜霉菌在侵染寄主的过程中可能会通过分泌多种GHs酶类来破坏细胞壁的结构，以帮助其在寄主植物中成功定殖。
2. 5 亚细胞定位分析结果
利用WoLF PSORT对GHs蛋白进行亚细胞定位分析，结果（表4）发现，有53个GHs蛋白分泌到细胞外（Extracellular），其中有3个来自GH102家族和GH19家族的蛋白虽无信号肽序列（表1），但也定位到细胞外，可能通过其他的分泌途径分泌到胞外;其余7个GHs蛋白中有3个定位在细胞质（Cytoplasmic）内，4个定位于线粒体（Mitochondrial）上。 3 讨论
在自然界中，植物与病原菌一直进行着动态竞赛，植物通过物理屏障、先天性免疫或生理生化机制等多层次的防御来抵抗病原菌的侵袭;而病原菌则可通过多种多样的致病因子进入植物体内，帮助其抑制植物的免疫反应，从而达到致病的目的。植物细胞壁是病原菌入侵植物的第一道屏障，为了穿透植物细胞壁而实现在宿主体内定殖，病原菌会分泌多种细胞壁降解酶类来分解植物细胞壁，其中，糖基水解酶是较重要的一种。根据预测结构和序列的相似性，CAZy数据库将GHs基因分为167个家族（Turbe-Doan et al.，2019），其中GH5、 GH6、GH12和GH45是最常见的4个家族。已有研究表明，GHs基因数量与病原菌的生活方式密切相关（陈相永等，2014）。本研究葡萄霜霉菌基因组测序数据中，预测出60个GHs基因，属于15个GHs家族，其中数量较多的是GH6、GH17和GH131家族。在啤酒花霜霉菌（Pseudoperonospora humuli）中有61种CAZymes，黄瓜霜霉病菌（P. cubensis）中有39种CAZymes（Purayannur et al.，2020），爬山虎霜霉菌（Plasmopara muralis）中有115个GHs基因（Dussert et al.，2019），拟南芥霜霉菌（Hyaloperonospora arabidopsidis）中有100个GHs基因（Baxter et al.，2010）。在半活体营养型疫霉基因组中含有166～216个GHs基因，其中GH1、GH3和GH5是最大的家族（Adhikari et al.，2013）。由此可见，活体营养的霜霉菌分泌的CAZymes及GHs基因数量与半活体的疫霉菌相比极大减少，这可能有利于病原菌在抑制植物免疫的同时，可最大程度地汲取寄主植物体内的营养，更有利于其存活。
病原菌在侵染寄主植物的过程中分泌多种类型的GHs酶来应对细胞壁的不同多糖组分。除GH6、GH17和GH131家族外，葡萄霜霉菌中还存在GH3、GH5、GH7、GH19、GH23、GH28、GH30、GH32、GH43、GH72、GH102和GH109家族。GH7家族蛋白主要存在于真菌中，在細菌或古细菌中尚未被发现（Payne et al.，2015）。GH7家族蛋白广泛存在于植物病原卵菌和真菌中，大豆疫霉分泌的PsGH7a广泛存在于植物病原卵菌和真菌中，其缺失造成大豆疫霉毒力显著下降（Tan et al.，2020）。GH3和GH5是疫霉基因组中最大的家族，可能参与纤维素降解（Brouwer et al.，2014）。GH12和GH31家族蛋白与木葡聚糖降解有关（Zerillo et al.，2013），但葡萄霜霉菌基因组与终极腐霉（Pythium ultimum）基因组一样均缺失了GH12家族（Lévesque et al.，2010）。虽然目前对于卵菌GHs蛋白在致病过程中的功能研究尚少，但根据已有的研究推测，葡萄霜霉菌GHs家族蛋白可能在侵染寄主的过程中参与降解寄主细胞壁，进而帮助其侵入定殖，发挥毒力。因此，后续将对3个较大的GHs家族蛋白在葡萄霜霉菌致病过程中的生物学功能进行研究。
4 结论
通过生物信息学分析葡萄霜霉菌全基因组60个GHs基因的基本特征、基因组分布特点及其编码保守基序、结构域和亚细胞定位的结果，推测葡萄霜霉菌在侵染寄主的过程中可能会分泌多种GHs酶类来破坏细胞壁的结构，帮助其在寄主植物中成功定殖，这将为阐明葡萄霜霉菌编码的GHs家族基因功能和致病分子机制等提供理论依据。
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（責任编辑 麻小燕）