本研究旨在分析不同乳脂率奶牛瘤胃微生物及其代谢物的差异。本试验基于江苏省某奶牛场2020年的中国荷斯坦奶牛生产性能测定（DHI）数据，选取胎次、泌乳天数及产奶量相近的高乳脂率奶牛（H组）及低乳脂率奶牛（L组）各5头，收集瘤胃液及奶样，测定常规乳成分指标、瘤胃液挥发性脂肪酸浓度与消化酶活性；通过16S rDNA测序和非靶向液相色谱-质谱（LC-MS）代谢组学技术分析瘤胃微生物组成及其代谢物。结果显示：相同饲粮条件下，H组和L组的乳脂率分别为5.82%和3.60%，二者差异极显著（P<0.01）。H组瘤胃液乙酸/丙酸比值显著高于L组（P <0.05）。16S rDNA测序结果表明瘤胃内厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）和变形菌门（Proteobacteria）为优势菌门，且H组Kiritimatiellaeota的丰度显著低于L组（P<0.05）。在属水平上，普雷沃氏菌属1（Prevotella＿1）、解琥珀酸弧菌属（Succiniclasticum）和琥珀酸弧菌科UCG-001（Succinivibrionaceae＿UCG-001）为优势菌属。2组间奶牛瘤胃菌群的丰富度与多样性无显著差异（P>0.05），但菌群组成结构存在较大差异。H组奶牛瘤胃内嗜木聚糖真杆菌群（Eubacterium＿xylanophilum＿group）的相对丰度显著高于L组（P<0.05），而克里斯滕森菌科R-7群（Christensenellaceae＿R-7＿group）、产粪甾醇真杆菌群（Eubacterium＿coprostanoligenes＿group）、瘤胃球菌科UCG-010 （Ruminococcaceae＿UCG-010）、丁酸弧菌属2 （Butyrivibrio＿2）、产甲烷短杆菌属（Methanobrevibacter）、p-1088-a5＿gut＿group、聚乙酸菌属（Acetitomaculum）、毛螺梭菌属10 （Lachnoclostridium＿10）、毛螺旋菌科ND3007群（Lachnospiraceae＿ND3007＿group）的相对丰度显著低于L组（P<0.05）。H组瘤胃内木聚糖酶活性显著高于L组（P<0.05），但脂肪酶活性极显著低于L组（P<0.01）。代谢组学分析共发现了4种差异代谢物[差异倍数（FC）≥1.5且P<0.05]，能够有效区分L组和H组。与L组相比，H组内显著上调的差异代谢物有月桂酸、琥珀酸、月桂酸乙酯及12,13-二羟基十八碳烯酸（P<0.05），这些代谢物富集在脂肪酸生物合成及氨基酸代谢等通路。此外，瘤胃微生物与代谢组数据关联分析显示，月桂酸、月桂酸乙酯、二羟基十八烯酸均与粪球菌属2 （Coprococcus＿2）呈显著正相关（P <0.05），琥珀酸与琥珀酸弧菌科UCG-002（Succinivibrionaceae＿UCG-002）和普雷沃氏菌科Ga6A1群（Prevotellaceae＿Ga6A1＿group）呈显著正相关（P<0.05）。综上所述，相同饲粮条件下，乳脂率不同的奶牛，其瘤胃发酵模式、微生物组成及其代谢物均有不同，这些微生物的变化可引起瘤胃内脂肪酸生物合成、氨基酸代谢等通路的改变，最终影响乳脂率。