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摘 要 采用高效液相色谱法测定乙肝解毒胶囊中大黄素和大黄酚的含量。色谱柱：Shim-Pack C18（4.6mm×250mm,5μm）；流动相：甲醇-0.1%磷酸溶液（80∶20）；流速：1.0ml/分；检测波长：254nm；柱温40℃；进样量10μl。大黄素在0.435～34.816μg/ml浓度范围内,峰面积积分值与浓度呈良好的线性关系（r=0.9999）；大黄酚在0.963～77.056μg/ml浓度范围内,峰面积积分值与浓度呈良好的线性关系（r=0.9999），平均回收率为98.8%，RSD=0.8%(n=6)。本方法简便、准确、重现性好。
关键词 乙肝解毒胶囊 大黄素 大黄酚 高效液相色谱法
仪器与试药
仪器：日本岛津2010AHT高效液相色谱仪，Class-vp工作站，日本岛津UV－260紫外分光光度计，北京赛多利斯天平有限公司BP211D电子分析天平，济宁市中区鲁超仪器厂LC-250超声清洗机（250W 50kHZ ）。
试药：大黄素对照品（批号：0756-200110 供含量测定用）、大黄酚对照品（批号：110796-200310 供含量测定用）均由中国药品生物制品检定所提供，甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为重蒸馏水，乙肝解毒胶囊及阴性样品由吉林省吉特药业有限公司提供（样品批号：050101，050102，050103）。
方法与结果
色谱条件：色谱柱：Shim-Pack C18（250mm×4.6 mm, 5μm）；流动相：甲醇-0.1%磷酸溶液（80∶20）；流速：1.0ml/分；检测波长：254nm；柱温40℃；进样量10μl。在此色谱条件下，大黄素的保留时间为12.44分钟，大黄酚的保留时间16.43分钟。大黄素的理论板数为11 265，大黄酚的理论板数为12 286。
对照品溶液的制备：分别精密称取大黄素和大黄酚对照品适量，加甲醇制成每1ml含大黄素4μg、大黄酚8μg的混合溶液即得。
供试品溶液的制备：取本品内容物约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，冷却，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25ml，置圆底蒸馏瓶中，蒸干，残渣加水20ml，加盐酸2ml，加氯仿20ml，加热回流30分钟，放冷，分取氯仿层，水层用氯仿振摇提取3次，每次10ml，合并氯仿液，蒸干，残渣加甲醇使溶解，转移至25ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。
阴性对照溶液的制备：取缺大黄的阴性样品适量，按供试品溶液的制备方法制备阴性对照溶液。
干扰试验：取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液按上述色谱条件测定。样品色谱图中与对照品溶液有相同保留时间的色谱峰，而阴性对照溶液在此保留时间无此峰，说明乙肝解毒胶囊的其他成分对大黄素和大黄酚的测定无干扰。证明本法可行。
线性关系考察：分别精密吸取大黄素对照品储备液（每1ml含40μg）各0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5ml和大黄酚对照品储备液（每1ml含80μg）各0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5ml分别置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，按上述色谱条件进行测定，以峰面积A对对照品浓度C作线性回归。得大黄素回归方程为：A=39 832C+4229.6，r=0.9999；大黄酚回归方程为：A=53 988C-352.27，r=0.9999。结果表明，大黄素在0.40～10.00μg/ml范围内呈良好的线性关系。大黄酚在0.80～20.00μg/ml范围内呈良好的线性关系。
精密度试验：称取样品1份，按供试品溶液的制备项下方法制备，按上述色谱条件测定，连续重复进样6次，测得大黄素峰面积RSD值为1.2%（n=6）；大黄酚峰面积RSD值为0.5%（n=6）。
重复性试验：称取同一样品6份，按照供试品溶液制备项下方法制备，按上述色谱条件测定，并计算含量，结果大黄素和大黄酚的平均含量为0.035mg/粒，RSD=1.5%（n=6）。
稳定性试验：称取样品1份，按照供试品溶液制备项下方法制备，按上述色谱条件测定，每隔2小时进样1次，测得峰面积并计算，结果大黄素24小时内的RSD为1.4%（n=12），大黄酚24小时内的RSD为0.9%（n=12），结果表明样品溶液在24小时内测定结果稳定。
回收率试验：精密称取已知含量的乙肝解毒胶囊内容物粉末6份，分别精密加入大黄素对照品溶液（0.01068mg/ml）6ml和大黄酚对照品溶液（0.0252mg/ml）7ml。按上述色谱条件测定，计算回收率。取3个批号的样品，依照供试品溶液制备项下方法制备，按上述色谱条件测定。
大黄素在0.435～34.816μg/ml浓度范围内峰面积积分值与浓度呈良好的线性关（r=0.9999）；大黄酚在0.963～77.056μg/ml浓度范围内峰面积积分值与浓度呈良好的线性关系（r=0.9999），平均回收率为98.8%，RSD=0.8%(n=6)。
讨 论
乙肝解毒胶囊是由关黄柏、重楼、黄芩、大黄、胡黄连、土茯苓、黑矾、绵马贯众8味中药组成。清热解毒，疏肝利胆，用于乙型肝炎辨证属于肝胆湿热内蕴者。其中大黄是该制剂的主要成分之一，大黄中主要成分为大黄素、大黄酚等。该制剂收载于卫生部药品标准[1]无含量测定方法。
检测波长的选择：分别取大黄素、大黄酚对照品的甲醇溶液，经岛津UV-260型可见-紫外分光光度计，在220～470nm波长范围内扫描，大黄素、大黄酚的最大吸收波长分别为253.8nm、255.2nm。根据大黄药材含量的测定方法和对样品实际测定情况，我们选择测定波长为254nm。
流动相及柱温的选择：参考文献用于分离大黄素、大黄酚的流动相主要有以下几种，甲醇-0.1%磷酸溶液（85∶15），甲醇-0.1%磷酸溶液（70∶30），甲醇-0.1%磷酸溶液（80∶20）。对以上的系统，采用柱温40℃，流速1.0ml/分，逐一进行试验，结果甲醇-0.1%磷酸溶液（80∶20）为流动相对本方中大黄素和大黄酚及相邻峰分离良好，分离度大于1.5。故选择柱温40℃，流速1.0ml/分，甲醇-0.1%磷酸溶液（80∶20）为流动相。
提取方法的选择：我们曾分别采用了以甲醇、乙醇为溶剂进行了提取溶剂的比较选择，实验结果证明，以甲醇为提取溶剂效果最佳。
在提取方法我们采用了超声提取与加热回流提取方法的比较。超声仪为250W，50kHZ，超声采用了超声15、30、45分钟提取，3个时间段的比较，结果超声30分钟提取效果好于超声15分钟，超声45分钟与超声30分钟无明显差异。加热回流采用了60分钟提取，结果证明，超声30分钟效果好于加热回流提取60分钟。故文中采用以甲醇超声30分钟的提取方法。
本法具有样品处理简单，回收率好，重现性好，稳定性好，处方中其他成分对测定没有干扰等优点，可以有效地控制该制剂的质量。
参考文献
1 中华人民共和国卫生部药品标准中药成方制剂.第1册，2.
中国药典.一部.2005年版，18-19.
关键词 乙肝解毒胶囊 大黄素 大黄酚 高效液相色谱法
仪器与试药
仪器：日本岛津2010AHT高效液相色谱仪，Class-vp工作站，日本岛津UV－260紫外分光光度计，北京赛多利斯天平有限公司BP211D电子分析天平，济宁市中区鲁超仪器厂LC-250超声清洗机（250W 50kHZ ）。
试药：大黄素对照品（批号：0756-200110 供含量测定用）、大黄酚对照品（批号：110796-200310 供含量测定用）均由中国药品生物制品检定所提供，甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为重蒸馏水，乙肝解毒胶囊及阴性样品由吉林省吉特药业有限公司提供（样品批号：050101，050102，050103）。
方法与结果
色谱条件：色谱柱：Shim-Pack C18（250mm×4.6 mm, 5μm）；流动相：甲醇-0.1%磷酸溶液（80∶20）；流速：1.0ml/分；检测波长：254nm；柱温40℃；进样量10μl。在此色谱条件下，大黄素的保留时间为12.44分钟，大黄酚的保留时间16.43分钟。大黄素的理论板数为11 265，大黄酚的理论板数为12 286。
对照品溶液的制备：分别精密称取大黄素和大黄酚对照品适量，加甲醇制成每1ml含大黄素4μg、大黄酚8μg的混合溶液即得。
供试品溶液的制备：取本品内容物约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，冷却，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25ml，置圆底蒸馏瓶中，蒸干，残渣加水20ml，加盐酸2ml，加氯仿20ml，加热回流30分钟，放冷，分取氯仿层，水层用氯仿振摇提取3次，每次10ml，合并氯仿液，蒸干，残渣加甲醇使溶解，转移至25ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。
阴性对照溶液的制备：取缺大黄的阴性样品适量，按供试品溶液的制备方法制备阴性对照溶液。
干扰试验：取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液按上述色谱条件测定。样品色谱图中与对照品溶液有相同保留时间的色谱峰，而阴性对照溶液在此保留时间无此峰，说明乙肝解毒胶囊的其他成分对大黄素和大黄酚的测定无干扰。证明本法可行。
线性关系考察：分别精密吸取大黄素对照品储备液（每1ml含40μg）各0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5ml和大黄酚对照品储备液（每1ml含80μg）各0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5ml分别置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，按上述色谱条件进行测定，以峰面积A对对照品浓度C作线性回归。得大黄素回归方程为：A=39 832C+4229.6，r=0.9999；大黄酚回归方程为：A=53 988C-352.27，r=0.9999。结果表明，大黄素在0.40～10.00μg/ml范围内呈良好的线性关系。大黄酚在0.80～20.00μg/ml范围内呈良好的线性关系。
精密度试验：称取样品1份，按供试品溶液的制备项下方法制备，按上述色谱条件测定，连续重复进样6次，测得大黄素峰面积RSD值为1.2%（n=6）；大黄酚峰面积RSD值为0.5%（n=6）。
重复性试验：称取同一样品6份，按照供试品溶液制备项下方法制备，按上述色谱条件测定，并计算含量，结果大黄素和大黄酚的平均含量为0.035mg/粒，RSD=1.5%（n=6）。
稳定性试验：称取样品1份，按照供试品溶液制备项下方法制备，按上述色谱条件测定，每隔2小时进样1次，测得峰面积并计算，结果大黄素24小时内的RSD为1.4%（n=12），大黄酚24小时内的RSD为0.9%（n=12），结果表明样品溶液在24小时内测定结果稳定。
回收率试验：精密称取已知含量的乙肝解毒胶囊内容物粉末6份，分别精密加入大黄素对照品溶液（0.01068mg/ml）6ml和大黄酚对照品溶液（0.0252mg/ml）7ml。按上述色谱条件测定，计算回收率。取3个批号的样品，依照供试品溶液制备项下方法制备，按上述色谱条件测定。
大黄素在0.435～34.816μg/ml浓度范围内峰面积积分值与浓度呈良好的线性关（r=0.9999）；大黄酚在0.963～77.056μg/ml浓度范围内峰面积积分值与浓度呈良好的线性关系（r=0.9999），平均回收率为98.8%，RSD=0.8%(n=6)。
讨 论
乙肝解毒胶囊是由关黄柏、重楼、黄芩、大黄、胡黄连、土茯苓、黑矾、绵马贯众8味中药组成。清热解毒，疏肝利胆，用于乙型肝炎辨证属于肝胆湿热内蕴者。其中大黄是该制剂的主要成分之一，大黄中主要成分为大黄素、大黄酚等。该制剂收载于卫生部药品标准[1]无含量测定方法。
检测波长的选择：分别取大黄素、大黄酚对照品的甲醇溶液，经岛津UV-260型可见-紫外分光光度计，在220～470nm波长范围内扫描，大黄素、大黄酚的最大吸收波长分别为253.8nm、255.2nm。根据大黄药材含量的测定方法和对样品实际测定情况，我们选择测定波长为254nm。
流动相及柱温的选择：参考文献用于分离大黄素、大黄酚的流动相主要有以下几种，甲醇-0.1%磷酸溶液（85∶15），甲醇-0.1%磷酸溶液（70∶30），甲醇-0.1%磷酸溶液（80∶20）。对以上的系统，采用柱温40℃，流速1.0ml/分，逐一进行试验，结果甲醇-0.1%磷酸溶液（80∶20）为流动相对本方中大黄素和大黄酚及相邻峰分离良好，分离度大于1.5。故选择柱温40℃，流速1.0ml/分，甲醇-0.1%磷酸溶液（80∶20）为流动相。
提取方法的选择：我们曾分别采用了以甲醇、乙醇为溶剂进行了提取溶剂的比较选择，实验结果证明，以甲醇为提取溶剂效果最佳。
在提取方法我们采用了超声提取与加热回流提取方法的比较。超声仪为250W，50kHZ，超声采用了超声15、30、45分钟提取，3个时间段的比较，结果超声30分钟提取效果好于超声15分钟，超声45分钟与超声30分钟无明显差异。加热回流采用了60分钟提取，结果证明，超声30分钟效果好于加热回流提取60分钟。故文中采用以甲醇超声30分钟的提取方法。
本法具有样品处理简单，回收率好，重现性好，稳定性好，处方中其他成分对测定没有干扰等优点，可以有效地控制该制剂的质量。
参考文献
1 中华人民共和国卫生部药品标准中药成方制剂.第1册，2.
中国药典.一部.2005年版，18-19.