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摘要[目的]研究从杜仲翅果中提取亚麻酸之后的籽粑中制备桃叶珊瑚苷及其苷元的工艺方法。[方法]采用硅胶柱层析法从杜仲粕中分离纯化桃叶珊瑚苷，优化柱层析分离、纯化条件，利用酶解技术选择最佳酶解条件，运用高效液相色谱法（HPLC）对产品进行检测分析。[结果]最佳上样量为2%，使用V（甲醇）∶V（石油醚）∶V（乙酸乙酯）为4∶0.5∶9的混合溶剂进行洗脱，通过收集、重结晶可获纯度为97%的桃叶珊瑚苷产品，利用酶解技术在30 min时桃叶珊瑚苷能达到最佳的酶解效果。[结论]该研究为高效制备桃叶珊瑚苷及其苷元的工业生产提供依据。
关键词 桃叶珊瑚苷；桃叶珊瑚苷元；柱层析；纯化
中图分类号S567文献标识码A文章编号0517-6611（2014）22-07404-02
桃叶珊瑚苷（aucubin，AU）又名珊瑚木苷，是一种环烯醚萜苷化合物。现代药理学研究表明，桃叶珊瑚苷具有良好的生物活性物质，护肝解毒、抗氧化延缓衰老、抗骨质疏松和神经营养等药理作用，能促进干细胞再生， 明显抑制乙型肝炎病毒DNA 的复制，其苷元及有效多聚体是一种强活性的抗菌素[1-4]。因此桃叶珊瑚苷在医药、日用化工和饲料等行业已得到了广泛的开发和应用。研究开发桃叶珊瑚苷及其苷元的绿色环保、快速高效的制备方法，具有一定的理论和应用价值。该研究应用超声波提取法从杜仲粕中提取桃叶珊瑚苷，采用柱色谱及重结晶法分离纯化取桃叶珊瑚苷和β葡萄糖苷酶催化水解桃叶珊瑚苷法制备苷元，为工业化制备桃叶珊瑚苷及其苷元提供科学、合理的试验依据。
1材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 仪器。LC10ATVP二元泵（岛津公司），ClassVP液相色谱工作站（岛津公司），Rheodyne7725进样器（美国），SPDM10AVP二极管阵列检测器（岛津公司），MilliQ超纯水装置，AT130柱温箱（天津），AB104N电子天平（Mettlertoledo公司），2200B超声波仪。
1.1.2 试剂。甲醇（色谱纯，山东禹王试剂公司），乙醇、二甲氨基苯甲醛、冰醋酸、磷酸等试剂均为分析纯（分析纯，天津市百世化工公司化学试剂厂），水为重蒸水并经0.45 μm滤膜过滤；硅胶G（青岛海洋化工厂），桃叶珊瑚苷（中国食品药品检定研究院，纯度≥98%，批号111761-200601）、桃叶珊瑚苷元对照品（成都曼思特生物科技有限公司，纯度≥98%，批号MUST-20110526）。
1.1.3 药材。杜仲粕原料为湘西和益生物科技有限公司在2011年3月从杜仲翅果中提取亚麻酸之后的粕。
1.2 试验方法
1.2.1 HPLC检验方法。采用文献报道的HPLC方法[5]进行检测。色谱条件为USA UL TRASPHERS ODS dp柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈-水（3∶97），检测波长206 nm，流速1.0 ml/min，柱温25 ℃，进样量20 μl。
1.2.2 桃叶珊瑚苷提取方法。通过预试验确定最佳提取方法，即杜仲粕适量，加8倍量的80%乙醇，用保鲜膜密封并放置冰箱中12 h，取出放至室温，超声提取3次，每次30 min（保持水温35 ℃左右），合并提取液，于55 ℃以下减压浓缩并回收乙醇，浓缩液放置冰箱中保存，备有。
1.2.3 硅胶吸附量的研究方法。 称取处理好的硅胶1 g，共7份，分别置于100 ml具塞三角瓶中，精密加入0.03、0.10 、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60 ml的浓缩液并加入少量水，使瓶中水溶液的量均为0.60 ml，然后分别精密加入甲醇～石油醚～乙酸乙酯液（4∶0.5∶9 ）20 ml，置于25 ℃的恒温水浴中振摇15 min，取出，备用。
1.2.4 平衡常数的研究方法。 称取处理好的硅胶1 g，共7份，置于100 ml具塞三角瓶中，分别加入0.01 ml的浓缩液（桃叶珊瑚苷的量为0.429 mg），按照“1.2.3”的方法进行测定吸附平衡常数试验。
1.2.5 硅胶柱色谱的分离纯化。 称取10 g处理好的硅胶，加入甲醇∶石油醚∶乙酸乙酯（4∶2∶9）液湿法装柱（45×1.5 cm），测得柱中死体积约为95 ml，量取“1.2.2”的浓缩液4.7 ml依次加入5 g处理好硅胶拌匀后，干法上样，依次采用甲醇∶石油醚∶乙酸乙酯（4∶2∶9）、（4∶1∶9）、（4∶0.5∶9）不同比例进行洗脱，每个梯度洗脱10倍柱体积，收集浓缩，测定。
1.2.6 桃叶珊瑚苷最佳水解时间的研究。 精密称取β葡萄糖苷酶10 mg，加入50 ℃的水2 ml，在磁力搅拌下活化10 min，然后加入桃叶珊瑚苷30 mg进行酶解，在酶解过程中溶液的颜色由浅黄色变为深黄色，最后溶液显绿色。分别在0、30、40、50、60 min用移液枪取20 μl酶解液，并以未加酶的桃叶珊瑚苷水溶液在相同的试验条件下做空白，分别点于同一硅胶板上，以甲醇～石油醚～乙酸乙酯（2∶2∶5）为展开剂，以10%硫酸乙醇溶液为显色剂，于105 ℃下加热3～5 min至斑点显色清晰。
关键词 桃叶珊瑚苷；桃叶珊瑚苷元；柱层析；纯化
中图分类号S567文献标识码A文章编号0517-6611（2014）22-07404-02
桃叶珊瑚苷（aucubin，AU）又名珊瑚木苷，是一种环烯醚萜苷化合物。现代药理学研究表明，桃叶珊瑚苷具有良好的生物活性物质，护肝解毒、抗氧化延缓衰老、抗骨质疏松和神经营养等药理作用，能促进干细胞再生， 明显抑制乙型肝炎病毒DNA 的复制，其苷元及有效多聚体是一种强活性的抗菌素[1-4]。因此桃叶珊瑚苷在医药、日用化工和饲料等行业已得到了广泛的开发和应用。研究开发桃叶珊瑚苷及其苷元的绿色环保、快速高效的制备方法，具有一定的理论和应用价值。该研究应用超声波提取法从杜仲粕中提取桃叶珊瑚苷，采用柱色谱及重结晶法分离纯化取桃叶珊瑚苷和β葡萄糖苷酶催化水解桃叶珊瑚苷法制备苷元，为工业化制备桃叶珊瑚苷及其苷元提供科学、合理的试验依据。
1材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 仪器。LC10ATVP二元泵（岛津公司），ClassVP液相色谱工作站（岛津公司），Rheodyne7725进样器（美国），SPDM10AVP二极管阵列检测器（岛津公司），MilliQ超纯水装置，AT130柱温箱（天津），AB104N电子天平（Mettlertoledo公司），2200B超声波仪。
1.1.2 试剂。甲醇（色谱纯，山东禹王试剂公司），乙醇、二甲氨基苯甲醛、冰醋酸、磷酸等试剂均为分析纯（分析纯，天津市百世化工公司化学试剂厂），水为重蒸水并经0.45 μm滤膜过滤；硅胶G（青岛海洋化工厂），桃叶珊瑚苷（中国食品药品检定研究院，纯度≥98%，批号111761-200601）、桃叶珊瑚苷元对照品（成都曼思特生物科技有限公司，纯度≥98%，批号MUST-20110526）。
1.1.3 药材。杜仲粕原料为湘西和益生物科技有限公司在2011年3月从杜仲翅果中提取亚麻酸之后的粕。
1.2 试验方法
1.2.1 HPLC检验方法。采用文献报道的HPLC方法[5]进行检测。色谱条件为USA UL TRASPHERS ODS dp柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈-水（3∶97），检测波长206 nm，流速1.0 ml/min，柱温25 ℃，进样量20 μl。
1.2.2 桃叶珊瑚苷提取方法。通过预试验确定最佳提取方法，即杜仲粕适量，加8倍量的80%乙醇，用保鲜膜密封并放置冰箱中12 h，取出放至室温，超声提取3次，每次30 min（保持水温35 ℃左右），合并提取液，于55 ℃以下减压浓缩并回收乙醇，浓缩液放置冰箱中保存，备有。
1.2.3 硅胶吸附量的研究方法。 称取处理好的硅胶1 g，共7份，分别置于100 ml具塞三角瓶中，精密加入0.03、0.10 、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60 ml的浓缩液并加入少量水，使瓶中水溶液的量均为0.60 ml，然后分别精密加入甲醇～石油醚～乙酸乙酯液（4∶0.5∶9 ）20 ml，置于25 ℃的恒温水浴中振摇15 min，取出，备用。
1.2.4 平衡常数的研究方法。 称取处理好的硅胶1 g，共7份，置于100 ml具塞三角瓶中，分别加入0.01 ml的浓缩液（桃叶珊瑚苷的量为0.429 mg），按照“1.2.3”的方法进行测定吸附平衡常数试验。
1.2.5 硅胶柱色谱的分离纯化。 称取10 g处理好的硅胶，加入甲醇∶石油醚∶乙酸乙酯（4∶2∶9）液湿法装柱（45×1.5 cm），测得柱中死体积约为95 ml，量取“1.2.2”的浓缩液4.7 ml依次加入5 g处理好硅胶拌匀后，干法上样，依次采用甲醇∶石油醚∶乙酸乙酯（4∶2∶9）、（4∶1∶9）、（4∶0.5∶9）不同比例进行洗脱，每个梯度洗脱10倍柱体积，收集浓缩，测定。
1.2.6 桃叶珊瑚苷最佳水解时间的研究。 精密称取β葡萄糖苷酶10 mg，加入50 ℃的水2 ml，在磁力搅拌下活化10 min，然后加入桃叶珊瑚苷30 mg进行酶解，在酶解过程中溶液的颜色由浅黄色变为深黄色，最后溶液显绿色。分别在0、30、40、50、60 min用移液枪取20 μl酶解液，并以未加酶的桃叶珊瑚苷水溶液在相同的试验条件下做空白，分别点于同一硅胶板上，以甲醇～石油醚～乙酸乙酯（2∶2∶5）为展开剂，以10%硫酸乙醇溶液为显色剂，于105 ℃下加热3～5 min至斑点显色清晰。