【摘 要】
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目的 构建插头/翼状螺旋转录因子C2 (homo sapiens forkhead box C2,Foxc2)基因慢病毒载体并转染兔BMSCs,检测其在BMSCs中的表达,为进一步应用携带Foxc2基因的BMSCs移植治疗
【机 构】
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西安交通大学医学院第二附属医院骨一科,西安,710004
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目的 构建插头/翼状螺旋转录因子C2 (homo sapiens forkhead box C2,Foxc2)基因慢病毒载体并转染兔BMSCs,检测其在BMSCs中的表达,为进一步应用携带Foxc2基因的BMSCs移植治疗股骨头缺血性坏死奠定实验基础. 方法 通过RT-PCR法获得人Foxc2基因片段,将该片段克隆至包含绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的慢病毒载体LV-GFP中,重组获得Foxc2慢病毒质粒,将其与pGC-LV载体、pHelper1.0载体、pHelper2.0载体共转染293T细胞,获得Foxc2基因慢病毒载体；检测病毒滴度.分离、培养兔BMSCs,以Foxc2基因慢病毒载体转染第3代BMSCs,通过荧光表达法判定最佳感染复数(multiplicity of infection,MOI),并以最佳MOI进行转染,倒置荧光显微镜观察、Western blot法检测转染1、3、7 d BMSCs中Foxc2的表达；对转染后BMSCs行成骨诱导,茜素红染色法观察矿化物结节形成情况. 结果 成功构建Foxc2基因慢病毒载体,经酶切及测序鉴定完全正确,能转染293T细胞并表达GFP,病毒滴度为2×108 TU/mL.Foxc2基因慢病毒转染BMSCs的最佳MOI为200,转染BMSCs 3 d后经免疫荧光检测84.5％±4.8％的BMSCs可表达Foxc2.Western blot结果显示Foxc2在BMSCs中高表达,且在7d内表达水平逐渐升高.成骨诱导培养2周后,茜素红染色示细胞质中有大量红色的钙化基质沉积. 结论 成功构建并包装获得较高滴度的Foxc2基因慢病毒载体,慢病毒可高效并稳定转染BMSCs,Foxc2表达增加,为基因治疗股骨头缺血性坏死奠定了基础.
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