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摘 要:以大蒜素对土壤细菌、真菌的敏感性测定为例,研究了采用一次性无菌塑料吸管代替牛津杯测定抗生素生物活性的可行性,结果表明:吸管法可以测定抗生素的抑菌谱、最小抑菌浓度、生物效价,克服了牛津杯在反复使用中由于难于清洗造成的抗生素残留与交叉污染问题,方法相对简便、准确,试材来源广泛、价格低廉,可供大中学校师生进行相关生物学教学实验、科学研究时选用。
关键词:吸管法管碟法抗生素生物测定方法改良
中图分类号:Q939.9 文献标识码:A 文章编号:1674-098X(2011)07(a)-0001-01
抗生素生物测定是衡量抗生素生物活性的科学活动,国际通用的试验方法是管碟法,它利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用,比较标准品与供试品对接种菌产生抑菌圈的大小,以测定供试品效价或含量［1］。管碟法被我国历版药典收载,如2005年新版《中国药典》(二部)应用管碟法进行含量测定的有氨基糖苷类、大环内酯类、青霉素类等78个药品(包括原料及其制剂)［2］,是抗生素乃至化学杀菌剂进行微生物检定的经典方法。
管碟法的实验结果受多种因素的影响和制约,如抗生素供试样品的制备来源、管碟的清洁灭菌、试验菌种、培养条件等［3］。其中牛津杯(小钢管)经过多次使用后,容易吸附抗生素或化学杀菌剂的残留物,如果通过洗涤与高压消毒灭菌都不能彻底破坏和消除,势必影响下次抗生素生物测定的准确性［4］,难以克服人们对试验结果的疑虑。因此,本试验采用一次性无菌塑料吸管代替牛津杯对抗生素生物测定中的管碟法进行了改良研究。
1 材料和方法
1.1 供试土壤微生物来源
从我校食堂附近采集土样,制作土壤稀释悬液涂布平板,用平板划线分离法纯化培养单菌落,通过染色、镜检、形态特征鉴定,获得细菌、真菌纯培养菌株,供本研究抗生素生物测定的敏感菌株使用。
1.2 水浸提法制备大蒜素
大蒜头去皮、洗净、捣碎,加蒸馏水于25℃、35℃、43℃浸提40min,纱布过滤,3000r/min离心10min,上清液经滤纸过滤后再用0.2μm微孔滤膜过滤,得到2g/mL无菌大蒜素原液。用无菌蒸馏水稀释到1g/mL、0.5g/mL备用。
1.3 吸管法测定土壤细菌、真菌对大蒜素的敏感性
取聚丙烯塑料吸管截成高10mm,内径5mm的圆管,高压蒸汽灭菌后代替牛津杯,以改良管碟法测定土壤细菌、真菌对大蒜素的敏感性。将0.1mL菌悬液涂布平板,其中细菌使用牛肉膏蛋白胨培养基(牛肉膏3g,蛋白胨10g,NaCl5g,琼脂15-20g,水1000mL,pH7.0-7.2),真菌使用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(马铃薯200g,葡萄糖20g,琼脂15-20g,水1000mL,pH自然)。把吸管无菌操作垂直插入培养基约1mm,用微量进样器向吸管内注入l00μL大蒜提取液,置于28℃、37℃恒温培养箱中培养1-5天,用游标卡尺测量抑菌圈大小。大蒜提取液2g/mL、1g/mL、0.5g/mL等3个浓度各做3组平行试验,无菌蒸馏水作为空白对照。
2 结果与分析
试验采用一次性无菌塑料吸管代替牛津杯测定土壤细菌、真菌对大蒜素的敏感性,呈现特定的抗菌谱,观测到形态圆整、清晰的抑菌圈,部分结果如图1所示。图中吸管(1)与(7)是以无菌蒸馏水作为空白对照;吸管(2)(3)(4)都是0.5g/mL大蒜素,但产生的抑菌圈直径差异较大,可能源于大蒜素制备不同引起,吸管(2)中样品来自43℃浸提,而吸管(3)(4)中样品来自35℃浸提,这说明制备方法对大蒜素活性成分的有效浓度存在影响,大蒜素的活性成分与浸提温度有关,浸提温度升高,大蒜素的活性成分有逐渐破坏的趋势,与前人研究结果一致[5]。吸管(8)2g/mL大蒜素与(5)(6)1g/mL大蒜素相比,产生的抑菌圈直径明显较大。试验采用的改良管碟法清晰揭示出抑菌圈的大小与大蒜素的浓度呈正相关,制备广泛的浓度梯度范围,即可确定大蒜素对特定敏感菌株的最小抑菌浓度(MIC)。同理,制备抗生素的标准曲线,可以测定供试样品的效价或含量。
3 讨论
作者提出并验证了采用一次性无菌塑料吸管代替牛津杯对抗生素生物测定中的管碟法进行改良的可行性。以大蒜素对土壤细菌、真菌的敏感性测定为例进行了试验研究,结果表明:吸管法可以测定抗生素的抑菌谱、最小抑菌浓度、生物效价,方法相对简便。
“管碟法”是国际药典普遍采用的经典检定方法,本文虽以吸管代替牛津杯,但生物测定的原理仍属“管碟法”的范畴,论文并没有否定“管碟法”,而是试图为发展“管碟法”提出的一种新思路。本文的创新之处是以塑料吸管代替牛津杯测定抗生素的生物活性,克服了牛津杯在反复使用中由于难于清洗造成的抗生素残留与交叉污染问题［4］,从此角度来看就有提高生物测定准确性的可能性。
本文对“吸管法”作了初步探索,其方法论有待进一步研究、发展与完善。该法所需器材来源广泛价廉,有利于较大规模的演示实验降低成本并提高效率,因而适合大中学校进行相关生物学教学实验采用,也可以初步筛选抗菌类药品,其结果供进一步科学研究与质量检定参考。
参考文献
[1] 中国药品生物制品检定所.中国药品检验标准操作规范[S].北京:中国医药科技出版社,2000:377-380.
[2] 中国药典,2005年版[S].二部,2005:730.
[3] 付长春.杯碟法影响抗生素效价测定的因素分析[J].西北药学杂志,2008,23(5):310-311.
[4] 田胜利.管碟法测定抗生素效价中的注意事项[J].黑龙江医药,2008,21(3):64.
[5] 曾哲灵,熊伟,熊涛.大蒜素的提取工艺研究[J].食品与发酵工业,2006,32(2):121-123.
关键词:吸管法管碟法抗生素生物测定方法改良
中图分类号:Q939.9 文献标识码:A 文章编号:1674-098X(2011)07(a)-0001-01
抗生素生物测定是衡量抗生素生物活性的科学活动,国际通用的试验方法是管碟法,它利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用,比较标准品与供试品对接种菌产生抑菌圈的大小,以测定供试品效价或含量［1］。管碟法被我国历版药典收载,如2005年新版《中国药典》(二部)应用管碟法进行含量测定的有氨基糖苷类、大环内酯类、青霉素类等78个药品(包括原料及其制剂)［2］,是抗生素乃至化学杀菌剂进行微生物检定的经典方法。
管碟法的实验结果受多种因素的影响和制约,如抗生素供试样品的制备来源、管碟的清洁灭菌、试验菌种、培养条件等［3］。其中牛津杯(小钢管)经过多次使用后,容易吸附抗生素或化学杀菌剂的残留物,如果通过洗涤与高压消毒灭菌都不能彻底破坏和消除,势必影响下次抗生素生物测定的准确性［4］,难以克服人们对试验结果的疑虑。因此,本试验采用一次性无菌塑料吸管代替牛津杯对抗生素生物测定中的管碟法进行了改良研究。
1 材料和方法
1.1 供试土壤微生物来源
从我校食堂附近采集土样,制作土壤稀释悬液涂布平板,用平板划线分离法纯化培养单菌落,通过染色、镜检、形态特征鉴定,获得细菌、真菌纯培养菌株,供本研究抗生素生物测定的敏感菌株使用。
1.2 水浸提法制备大蒜素
大蒜头去皮、洗净、捣碎,加蒸馏水于25℃、35℃、43℃浸提40min,纱布过滤,3000r/min离心10min,上清液经滤纸过滤后再用0.2μm微孔滤膜过滤,得到2g/mL无菌大蒜素原液。用无菌蒸馏水稀释到1g/mL、0.5g/mL备用。
1.3 吸管法测定土壤细菌、真菌对大蒜素的敏感性
取聚丙烯塑料吸管截成高10mm,内径5mm的圆管,高压蒸汽灭菌后代替牛津杯,以改良管碟法测定土壤细菌、真菌对大蒜素的敏感性。将0.1mL菌悬液涂布平板,其中细菌使用牛肉膏蛋白胨培养基(牛肉膏3g,蛋白胨10g,NaCl5g,琼脂15-20g,水1000mL,pH7.0-7.2),真菌使用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(马铃薯200g,葡萄糖20g,琼脂15-20g,水1000mL,pH自然)。把吸管无菌操作垂直插入培养基约1mm,用微量进样器向吸管内注入l00μL大蒜提取液,置于28℃、37℃恒温培养箱中培养1-5天,用游标卡尺测量抑菌圈大小。大蒜提取液2g/mL、1g/mL、0.5g/mL等3个浓度各做3组平行试验,无菌蒸馏水作为空白对照。
2 结果与分析
试验采用一次性无菌塑料吸管代替牛津杯测定土壤细菌、真菌对大蒜素的敏感性,呈现特定的抗菌谱,观测到形态圆整、清晰的抑菌圈,部分结果如图1所示。图中吸管(1)与(7)是以无菌蒸馏水作为空白对照;吸管(2)(3)(4)都是0.5g/mL大蒜素,但产生的抑菌圈直径差异较大,可能源于大蒜素制备不同引起,吸管(2)中样品来自43℃浸提,而吸管(3)(4)中样品来自35℃浸提,这说明制备方法对大蒜素活性成分的有效浓度存在影响,大蒜素的活性成分与浸提温度有关,浸提温度升高,大蒜素的活性成分有逐渐破坏的趋势,与前人研究结果一致[5]。吸管(8)2g/mL大蒜素与(5)(6)1g/mL大蒜素相比,产生的抑菌圈直径明显较大。试验采用的改良管碟法清晰揭示出抑菌圈的大小与大蒜素的浓度呈正相关,制备广泛的浓度梯度范围,即可确定大蒜素对特定敏感菌株的最小抑菌浓度(MIC)。同理,制备抗生素的标准曲线,可以测定供试样品的效价或含量。
3 讨论
作者提出并验证了采用一次性无菌塑料吸管代替牛津杯对抗生素生物测定中的管碟法进行改良的可行性。以大蒜素对土壤细菌、真菌的敏感性测定为例进行了试验研究,结果表明:吸管法可以测定抗生素的抑菌谱、最小抑菌浓度、生物效价,方法相对简便。
“管碟法”是国际药典普遍采用的经典检定方法,本文虽以吸管代替牛津杯,但生物测定的原理仍属“管碟法”的范畴,论文并没有否定“管碟法”,而是试图为发展“管碟法”提出的一种新思路。本文的创新之处是以塑料吸管代替牛津杯测定抗生素的生物活性,克服了牛津杯在反复使用中由于难于清洗造成的抗生素残留与交叉污染问题［4］,从此角度来看就有提高生物测定准确性的可能性。
本文对“吸管法”作了初步探索,其方法论有待进一步研究、发展与完善。该法所需器材来源广泛价廉,有利于较大规模的演示实验降低成本并提高效率,因而适合大中学校进行相关生物学教学实验采用,也可以初步筛选抗菌类药品,其结果供进一步科学研究与质量检定参考。
参考文献
[1] 中国药品生物制品检定所.中国药品检验标准操作规范[S].北京:中国医药科技出版社,2000:377-380.
[2] 中国药典,2005年版[S].二部,2005:730.
[3] 付长春.杯碟法影响抗生素效价测定的因素分析[J].西北药学杂志,2008,23(5):310-311.
[4] 田胜利.管碟法测定抗生素效价中的注意事项[J].黑龙江医药,2008,21(3):64.
[5] 曾哲灵,熊伟,熊涛.大蒜素的提取工艺研究[J].食品与发酵工业,2006,32(2):121-123.