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摘 要 为了确定抗稻瘟病基因Pi2、Pi5、Pi9、Pi-kh在重庆地区部分水稻亲本材料中的分布情况和筛选有效性，分别用Pi2、Pi5、Pi9、Pi-kh的功能分子标记对46份不同的水稻材料进行了分子标记检测分析。结果显示：Pi2、Pi5、Pi-kh三个抗性基因在所选材料中能扩出抗性基因的特异条带，其中含Pi2抗性材料5份，占比10.87%；含Pi5抗性材料14份，占比30.43%；含Pi-kh抗性材料12份，占比26.09%；无材料含Pi9基因。检测结果证实抗稻瘟病基因Pi2、Pi5、Pi-kh的功能标记对重庆地区水稻亲本材料的筛选是有效的，为利用这些功能标记筛选含抗性基因的材料提供了充实的依据。
关键词 水稻；亲本材料；抗稻瘟病；功能标记；基因检测
中图分类号：S511.5 文献标志码：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2017.34.005
知网出版网址：http：//kns.cnki.net/kcms/detail/50.1186.S.20171129.1622.001.html 网络出版时间：2017/11/29 16：22：02
稻瘟病是由子囊真菌引起的一类水稻病害，其病原属半知菌亚门真菌[1]。稻瘟病可发生在水稻秧苗期至抽穗期，苗期或者分蘖期发病严重时可使水稻植株死亡；穗期发病将导致白穗或半饱和穗，嚴重降低产量，甚至可造成水稻绝收，是我国主要水稻灾害之一[2]。掌握杂交水稻亲本的抗稻瘟病基因型，对杂交稻亲本抗性的改良及通过抗病基因的合理布局达到持续有效地控制稻瘟病起至关重要作用[3]。截至2015年3月，已至少报道了69个抗稻瘟病位点共84个主效基因，其中，24个基因已被成功克隆[4]，这些抗性基因的发现与克隆为开展稻瘟病分子辅助育种提供了可能。在已克隆的抗性基因中，Pi-2[5]、Pi-9[6]的抗谱较广，与Pi-kh[7]同被确定是西南稻区四川地区有效的抗稻瘟病基因[8]。而Pi5[9]被发现在东北稻区辽宁地区也有很宽的抗谱[10]。本文即是用已克隆的部分水稻稻瘟病抗性基因Pi2[5]、Pi5[9]、Pi9[6]、Pi-kh[7]的功能标记对近年来自选的高代水稻亲本材料及部分组合进行分子标记检测，以确定稻瘟病抗性基因在高代亲本中的分布情况和筛选的有效性，为重庆地区配制多抗或广谱抗稻瘟病杂交水稻新组合提供依据。
1 材料与方法
1.1 供试材料
供试材料一共46份，其中恢复系9份、保持系（不育系）32份、部分亲本组合5份，均由重庆市农业科学院水稻研究所提供。
1.2 水稻DNA的提取
每份材料取10粒左右种子于28 ℃恒温气候培养箱中进行纸床浸种催芽，发芽后1周，剪取幼嫩叶片，用改良的CTAB法[11]提取DNA作为PCR模板。
1.3 PCR扩增
PCR反应体系采取TAKANA公司提供的试剂和方法进行添加，每一个反应体系为10 μL。用于检测的稻瘟病抗性基因功能标记一共4个：Pi2、Pi5、Pi9、Pi-kh；相应引物名称、序列和多态性片段大小见表1。使用的PCR主要程序扩增步骤依次为：第1步，94 ℃ 5 min；第2步，94 ℃ 30 s；第3步，55 ℃ 30 s；第4步，72 ℃ 1 min；第5步，72 ℃ 10 min；第6步，25 ℃ 5 min，其中第2～4步35个循环。
1.4 PCR扩增产物电泳检测
在PCR扩增产物中加入2 μL溴酚兰指示剂，充分混匀后，用1.2%琼脂糖凝胶于0.5×TBE缓冲液中恒压150 V 电泳 20～30 min，取出后放入加有溴化乙锭的0.5×TBE缓冲液浸泡3～5 min，再用凝胶成像系统扫描记录电泳结果。
2 结果与分析
2.1 分子标记检测结果
抗稻瘟病基因Pi2、Pi5、Pi9、Pi-kh分子标记检测结果如表2所示，结果初步显示：Pi2、Pi5、Pi-kh三个抗性基因的分子标记检测在所选材料中均扩出了抗性基因的特异条带，材料中可能存在相应的抗性基因，而Pi9的检测结果显示全部为无特异条带，理论上这些材料不存在Pi9抗性基因。对各抗性基因检测结果具体分析如下。
1）Pi2的分子标记共检测出含Pi2抗性材料5份，占比10.87%。其中亲本恢复系材料R6037和R3925为Pi2基因纯合型抗性材料，以R3925为亲本的组合材料Q2A/R3925、81A/R3925、83A/R3925为含Pi2基因杂合型抗性材料，保持系材料中无此抗性。
2）Pi5的分子标记共检测出含Pi5抗性材料14份，占比30.43%。它们是亲本恢复系材料R3007、R3011、R3014、R3190，亲本保持系材料128B、183B、209B、511B、614B、680B、20031B，组合材料18A/R28、蓉18A/R28、83A/R3925，其中83A/R3925为Pi5基因杂合型抗性材料，余下13份材料均为Pi5基因纯合型抗性材料。
3）Pi-kh的分子标记共检测出含Pi-kh抗性材料12份，占比26.09%。它们是亲本恢复系材料R3007、R3135、R3190、R3925，亲本保持系材料476B、558B、567B，组合材料18A/R28、蓉18A/R28、Q2A/R3925、81A/R3925、83A/R3925，其中R3007、R3135、R3190、R3925及567B为Pi-kh基因纯合型抗性材料，余下7份材料均为Pi-kh基因杂合型抗性材料。
2.2 对重庆地区水稻亲本材料的筛选分析
表2的结果同时也表明，对所选46份材料，除未能检测出Pi9抗性基因特异条带外，其他检测出抗性基因特异条带的基因Pi2、Pi5、Pi-kh在亲本材料间的分布也是有明显差异的，亲本材料中的抗性基因之间重合也很少。进一步的分析表明，亲本恢复系材料R3925的Pi2、Pi-kh的基因型是纯合的，而其所配杂交组合Q2A/R3925、81A/R3925、83A/R3925均为杂合型，说明R3925的后代中抗性基因Pi2、Pi-kh发生了等位基因分离，重新进行了遗传重组，因此在杂交后代育种选择中仍有必要进行目标基因的分子标记检测筛选，否则目标抗性基因有可能因重组分离而丢失。而Pi5在83A/R3925表现为杂合型，也说明其跟Pi2、Pi-kh的遗传特性是一样的。这些结果表明，抗稻瘟病基因Pi2、Pi5、Pi-kh的功能标记对重庆地区水稻供试亲本材料的筛选是有效的，可应用于分子标记辅助选择育种。 3 讨论
功能性分子标记完全关联基因的功能性基序，直接反映目标性状表现，在应用上比传统的基因连锁分子标记更具有优越性[14]。本研究所用的稻瘟病抗性基因Pi2、Pi5、Pi9、Pi-kh的分子标记均为功能性分子标记，表现出共显性、差异大、特异性较强的特性，检测结果准确可靠，其中Pi2、Pi5、Pi9在水稻育种上已应用于亲本材料稻瘟病抗性基因的聚合[12]，应用前景广泛。
在本次研究中，抗稻瘟病基因Pi2、Pi5、Pi-kh在重庆地区的亲本材料检测中均表现出了很好的多态性，带型清晰，辨识度高，充分证实其筛选是有效的，为大规模利用这些功能标记检测筛选含抗性基因材料提供了充实的依据。同时也发现，含单个抗稻瘟病基因的材料占比均较小，尤其是在供试材料中没有发现含Pi9材料，故应加强收集或引进抗源材料。而Pi2在亲本材料中仅在恢复系R3925与R6037中发现，这两个亲本可作为含Pi2的重点材料进行选择应用。Pi5和Pi-kh在保持系和恢复系都有分布，可选择的材料相对较多，在配制组合时可更多地考虑其他优良农艺性状。但是，单个主效抗稻瘟病基因的抗谱都是有限的，在每个稻区稻瘟病抗性表现难以持久稳定，因此，将多个单个抗瘟基因进行聚合，在亲本中形成抗性互补，提高杂交组合的水平抗性乃是抗瘟育种的趋势所在。
参考文献：
[1] 范怀忠.植物病理学[M].北京：中国农业出版社，2003：71-78.
[2] 柏斌，吴俊，周波，等.稻瘟病抗性分子育种研究综述[J].杂交水稻，2012，27（3）：5-9.
[3] 冯慧，杨成明，吴孝波，等.四川省杂交稻亲本及32 份抗源抗稻瘟病基因的检测分析[J].西南农业学报，2013，26（3）：987-993.
[4] 国家水稻数据中心.稻瘟病主效抗性基因列表[DB/OL].2012-06-20[2015-3-30].http：// www.ricedata.cn/gene/gene_pi.htm.
[5] Zhou B， Qu S， Liu G， et al. The eight a mino-acid differences within three leucine-rich repeats between Pi2 and Piz-t resistance proteins deter mine the resistance specificity to Magnaporthe grisea[J]. Molecular Plant-microbe Interactions，2006，19 （11）：1216-1228.
[6] Qu S， Liu G， Zhou B， et al. The broad-spectrum blast resistance gene Pi9 encodes a nucleotide-binding site-leucine-rich repeat protein and is a member of a multigene family in rice[J].Genetics，2006，172（3）：1901-1914.
[7] Sharma T R， Madhav M S， Singh B K，et al. High-resolution mapping，cloning and molecular characterization of the Pi-kh gene of rice，which confers resistance to Magnaporthe grisea[J].Molecular Genetics and Genomics，2005，274（6）：569-578.
[8] 张雪梅.四川省主栽品种抗瘟性评价和内恢99-14 抗瘟性遗传分析[D].成都：四川农业大学，2011.
[9] Lee S K， Song M Y， Seo Y S， et al. Rice Pi5-mediated resistance to Magnaporthe oryzae requires the presence of two coiledcoil-nucleotide-binding-leucine-rich repeat genes[J]. Genetics，2009，181（4）：1627-1638.
[10] 郑文静，丛玲，王妍，等.抗稻瘟病基因Pi5检测标签的设计及验证[J].西南大学学报（自然科学版），2014，36（9）：15-22.
[11] Murray M G， Thompson W F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA[J]. Nucl Acid Res，1980，8（19）：4321-4325.
[12] 高利军，高汉亮，颜群，等.4个抗稻瘟病基因分子标记的建立及在水稻亲本中的分布[C]//中国科技部，中国农业部，湖南省人民政府.第1 届中国杂交水稻大會论文集.长沙：杂交水稻编辑部，2009：294-298.
[13] Ramkumar G， Srinivasarao K， Madhan Mohan K， et al. Development and validation of functional marker targeting an InDel in the major rice blast disease resistance gene Pi54 （Pikh）[J]. Molecular Breeding，2011，27（1）：129-135.
[14] 徐未未，王兴，黄永相，等.水稻抗稻瘟病基因的分子标记与标记辅助育种研究进展[J].江苏农业学报，2013，29（4）：898-906.
（责任编辑：丁志祥）
关键词 水稻；亲本材料；抗稻瘟病；功能标记；基因检测
中图分类号：S511.5 文献标志码：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2017.34.005
知网出版网址：http：//kns.cnki.net/kcms/detail/50.1186.S.20171129.1622.001.html 网络出版时间：2017/11/29 16：22：02
稻瘟病是由子囊真菌引起的一类水稻病害，其病原属半知菌亚门真菌[1]。稻瘟病可发生在水稻秧苗期至抽穗期，苗期或者分蘖期发病严重时可使水稻植株死亡；穗期发病将导致白穗或半饱和穗，嚴重降低产量，甚至可造成水稻绝收，是我国主要水稻灾害之一[2]。掌握杂交水稻亲本的抗稻瘟病基因型，对杂交稻亲本抗性的改良及通过抗病基因的合理布局达到持续有效地控制稻瘟病起至关重要作用[3]。截至2015年3月，已至少报道了69个抗稻瘟病位点共84个主效基因，其中，24个基因已被成功克隆[4]，这些抗性基因的发现与克隆为开展稻瘟病分子辅助育种提供了可能。在已克隆的抗性基因中，Pi-2[5]、Pi-9[6]的抗谱较广，与Pi-kh[7]同被确定是西南稻区四川地区有效的抗稻瘟病基因[8]。而Pi5[9]被发现在东北稻区辽宁地区也有很宽的抗谱[10]。本文即是用已克隆的部分水稻稻瘟病抗性基因Pi2[5]、Pi5[9]、Pi9[6]、Pi-kh[7]的功能标记对近年来自选的高代水稻亲本材料及部分组合进行分子标记检测，以确定稻瘟病抗性基因在高代亲本中的分布情况和筛选的有效性，为重庆地区配制多抗或广谱抗稻瘟病杂交水稻新组合提供依据。
1 材料与方法
1.1 供试材料
供试材料一共46份，其中恢复系9份、保持系（不育系）32份、部分亲本组合5份，均由重庆市农业科学院水稻研究所提供。
1.2 水稻DNA的提取
每份材料取10粒左右种子于28 ℃恒温气候培养箱中进行纸床浸种催芽，发芽后1周，剪取幼嫩叶片，用改良的CTAB法[11]提取DNA作为PCR模板。
1.3 PCR扩增
PCR反应体系采取TAKANA公司提供的试剂和方法进行添加，每一个反应体系为10 μL。用于检测的稻瘟病抗性基因功能标记一共4个：Pi2、Pi5、Pi9、Pi-kh；相应引物名称、序列和多态性片段大小见表1。使用的PCR主要程序扩增步骤依次为：第1步，94 ℃ 5 min；第2步，94 ℃ 30 s；第3步，55 ℃ 30 s；第4步，72 ℃ 1 min；第5步，72 ℃ 10 min；第6步，25 ℃ 5 min，其中第2～4步35个循环。
1.4 PCR扩增产物电泳检测
在PCR扩增产物中加入2 μL溴酚兰指示剂，充分混匀后，用1.2%琼脂糖凝胶于0.5×TBE缓冲液中恒压150 V 电泳 20～30 min，取出后放入加有溴化乙锭的0.5×TBE缓冲液浸泡3～5 min，再用凝胶成像系统扫描记录电泳结果。
2 结果与分析
2.1 分子标记检测结果
抗稻瘟病基因Pi2、Pi5、Pi9、Pi-kh分子标记检测结果如表2所示，结果初步显示：Pi2、Pi5、Pi-kh三个抗性基因的分子标记检测在所选材料中均扩出了抗性基因的特异条带，材料中可能存在相应的抗性基因，而Pi9的检测结果显示全部为无特异条带，理论上这些材料不存在Pi9抗性基因。对各抗性基因检测结果具体分析如下。
1）Pi2的分子标记共检测出含Pi2抗性材料5份，占比10.87%。其中亲本恢复系材料R6037和R3925为Pi2基因纯合型抗性材料，以R3925为亲本的组合材料Q2A/R3925、81A/R3925、83A/R3925为含Pi2基因杂合型抗性材料，保持系材料中无此抗性。
2）Pi5的分子标记共检测出含Pi5抗性材料14份，占比30.43%。它们是亲本恢复系材料R3007、R3011、R3014、R3190，亲本保持系材料128B、183B、209B、511B、614B、680B、20031B，组合材料18A/R28、蓉18A/R28、83A/R3925，其中83A/R3925为Pi5基因杂合型抗性材料，余下13份材料均为Pi5基因纯合型抗性材料。
3）Pi-kh的分子标记共检测出含Pi-kh抗性材料12份，占比26.09%。它们是亲本恢复系材料R3007、R3135、R3190、R3925，亲本保持系材料476B、558B、567B，组合材料18A/R28、蓉18A/R28、Q2A/R3925、81A/R3925、83A/R3925，其中R3007、R3135、R3190、R3925及567B为Pi-kh基因纯合型抗性材料，余下7份材料均为Pi-kh基因杂合型抗性材料。
2.2 对重庆地区水稻亲本材料的筛选分析
表2的结果同时也表明，对所选46份材料，除未能检测出Pi9抗性基因特异条带外，其他检测出抗性基因特异条带的基因Pi2、Pi5、Pi-kh在亲本材料间的分布也是有明显差异的，亲本材料中的抗性基因之间重合也很少。进一步的分析表明，亲本恢复系材料R3925的Pi2、Pi-kh的基因型是纯合的，而其所配杂交组合Q2A/R3925、81A/R3925、83A/R3925均为杂合型，说明R3925的后代中抗性基因Pi2、Pi-kh发生了等位基因分离，重新进行了遗传重组，因此在杂交后代育种选择中仍有必要进行目标基因的分子标记检测筛选，否则目标抗性基因有可能因重组分离而丢失。而Pi5在83A/R3925表现为杂合型，也说明其跟Pi2、Pi-kh的遗传特性是一样的。这些结果表明，抗稻瘟病基因Pi2、Pi5、Pi-kh的功能标记对重庆地区水稻供试亲本材料的筛选是有效的，可应用于分子标记辅助选择育种。 3 讨论
功能性分子标记完全关联基因的功能性基序，直接反映目标性状表现，在应用上比传统的基因连锁分子标记更具有优越性[14]。本研究所用的稻瘟病抗性基因Pi2、Pi5、Pi9、Pi-kh的分子标记均为功能性分子标记，表现出共显性、差异大、特异性较强的特性，检测结果准确可靠，其中Pi2、Pi5、Pi9在水稻育种上已应用于亲本材料稻瘟病抗性基因的聚合[12]，应用前景广泛。
在本次研究中，抗稻瘟病基因Pi2、Pi5、Pi-kh在重庆地区的亲本材料检测中均表现出了很好的多态性，带型清晰，辨识度高，充分证实其筛选是有效的，为大规模利用这些功能标记检测筛选含抗性基因材料提供了充实的依据。同时也发现，含单个抗稻瘟病基因的材料占比均较小，尤其是在供试材料中没有发现含Pi9材料，故应加强收集或引进抗源材料。而Pi2在亲本材料中仅在恢复系R3925与R6037中发现，这两个亲本可作为含Pi2的重点材料进行选择应用。Pi5和Pi-kh在保持系和恢复系都有分布，可选择的材料相对较多，在配制组合时可更多地考虑其他优良农艺性状。但是，单个主效抗稻瘟病基因的抗谱都是有限的，在每个稻区稻瘟病抗性表现难以持久稳定，因此，将多个单个抗瘟基因进行聚合，在亲本中形成抗性互补，提高杂交组合的水平抗性乃是抗瘟育种的趋势所在。
参考文献：
[1] 范怀忠.植物病理学[M].北京：中国农业出版社，2003：71-78.
[2] 柏斌，吴俊，周波，等.稻瘟病抗性分子育种研究综述[J].杂交水稻，2012，27（3）：5-9.
[3] 冯慧，杨成明，吴孝波，等.四川省杂交稻亲本及32 份抗源抗稻瘟病基因的检测分析[J].西南农业学报，2013，26（3）：987-993.
[4] 国家水稻数据中心.稻瘟病主效抗性基因列表[DB/OL].2012-06-20[2015-3-30].http：// www.ricedata.cn/gene/gene_pi.htm.
[5] Zhou B， Qu S， Liu G， et al. The eight a mino-acid differences within three leucine-rich repeats between Pi2 and Piz-t resistance proteins deter mine the resistance specificity to Magnaporthe grisea[J]. Molecular Plant-microbe Interactions，2006，19 （11）：1216-1228.
[6] Qu S， Liu G， Zhou B， et al. The broad-spectrum blast resistance gene Pi9 encodes a nucleotide-binding site-leucine-rich repeat protein and is a member of a multigene family in rice[J].Genetics，2006，172（3）：1901-1914.
[7] Sharma T R， Madhav M S， Singh B K，et al. High-resolution mapping，cloning and molecular characterization of the Pi-kh gene of rice，which confers resistance to Magnaporthe grisea[J].Molecular Genetics and Genomics，2005，274（6）：569-578.
[8] 张雪梅.四川省主栽品种抗瘟性评价和内恢99-14 抗瘟性遗传分析[D].成都：四川农业大学，2011.
[9] Lee S K， Song M Y， Seo Y S， et al. Rice Pi5-mediated resistance to Magnaporthe oryzae requires the presence of two coiledcoil-nucleotide-binding-leucine-rich repeat genes[J]. Genetics，2009，181（4）：1627-1638.
[10] 郑文静，丛玲，王妍，等.抗稻瘟病基因Pi5检测标签的设计及验证[J].西南大学学报（自然科学版），2014，36（9）：15-22.
[11] Murray M G， Thompson W F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA[J]. Nucl Acid Res，1980，8（19）：4321-4325.
[12] 高利军，高汉亮，颜群，等.4个抗稻瘟病基因分子标记的建立及在水稻亲本中的分布[C]//中国科技部，中国农业部，湖南省人民政府.第1 届中国杂交水稻大會论文集.长沙：杂交水稻编辑部，2009：294-298.
[13] Ramkumar G， Srinivasarao K， Madhan Mohan K， et al. Development and validation of functional marker targeting an InDel in the major rice blast disease resistance gene Pi54 （Pikh）[J]. Molecular Breeding，2011，27（1）：129-135.
[14] 徐未未，王兴，黄永相，等.水稻抗稻瘟病基因的分子标记与标记辅助育种研究进展[J].江苏农业学报，2013，29（4）：898-906.
（责任编辑：丁志祥）