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为了以国内地方分离株鄂A株为亲本构建伪狂犬病病毒双基因缺失株，采用外切酶Ⅲ和绿豆核酸酶酶切，构建了缺失主要毒力基因TK基因部分编码区的重组质粒pSTK1－4，进一步改造成为转移质粒pUCPB4。用HindⅢ将质粒pUCPB4线性化，然后与用EcoRI消化的伪狂犬病病毒鄂A株TK－／LacZ＋突变株基因组DNA共转染PK－15细胞，待完全病变后，收毒作空斑试验，PCR筛选TK缺失的重组病毒。重组病毒空斑纯化3次，随机挑取空斑进行PCR扩增，证实所获得的病毒为均一的无TK－／LacZ＋突变株污染的TK缺失的重