论文部分内容阅读
生产中常见仔猪(Sus scrofa)腹泻,造成严重经济损失.本研究建立了联合检测猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、猪轮状病毒A群(Porcine rotavirus A group,PRoV A)与猪δ冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)4种猪肠道病毒的寡核苷酸芯片并进行了临床应用.根据PEDV的纤突蛋白(spike,S)、囊膜蛋白(membrane,M)基因、TGEV的S、核衣壳蛋白(nucleocapsid,N)基因、PRoV A的外衣壳蛋白(outer capsid protein,VP7)、非结构蛋白(non-structural protein,NSP4)基因与PDCoV的囊膜蛋白M、N基因设计8对特异性引物,再根据每对引物扩增基因的保守区域设计寡核苷酸探针,并用Cy-3荧光直接标记下游引物5端进行多重PCR扩增标记样品.研究确定最佳制备和反应参数:100μmol/L探针原液与点样缓冲液比例为1:2,水合处理10 h,杂交温度为42℃,杂交时间为120 min,以信噪比值(Signal-to-noise ratio,SNR)≥2或信号值>1300判为阳性.该芯片灵敏性试验表明最低检测量为106 copies/μL;特异性实验表明对非目标病原无交叉反应,保存期试验表明制备的芯片置于4℃下可保存至少60 d.用该芯片检测209份临床腹泻样品,结果显示PEDV、TGEV、PoRVA、PDCoV的阳性率分别为68.42％、4.30％、0.95％和2.87％,检测结果与普通逆转录PCR(reverse transcription PCR)一致.本研究构建的寡核苷酸基因芯片为4种仔猪腹泻病原的高通量筛查提供了新技术.