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【摘 要】在裸玻碳电极的基底上，制备磷脂双层膜，以Fe（CN）63-/4-为探针分子， 使用循环伏安法和交流阻抗技术研究了钙离子与s-BLM 的相互作用，结果表明， 钙离子与磷脂双层膜（s-BLM）之间可以发生比较强烈的相互作用， 诱发s-BLM 上形成离子通道， 并且作用后的膜在10mmol/L 的EDTA溶液中可以复原，表明撤走钙离子则通道关闭。
【关键词】钙离子 循环伏安 交流阻抗 离子通道 模拟磷脂双层膜
生命体系中的许多吸收与代谢过程都在生物膜上进行，它在生命过程中的作用十分重要。由于膜的构成、功能独特复杂，实时与原位观测和研究是十分困难的。因此，人们广泛关注仿生膜的研究。从平板双层类脂膜被发现以来，此膜已被广泛而深入地应用作为模拟膜的模型[1]。但是平板双层类脂膜有寿命较短、稳定性差的缺点，在其他领域的应用有一些局限性[2]。近年来，稳定性好、长寿命的双层类脂膜制备方法的出现，广泛地应用于电化学生物传感器[3]和离子通道等行为的研究[4]。
钙离子是机体的必需元素，参与细胞的多种生理活动，具有极其重要的生理功能， 钙离子与模拟膜作用，出现离子通道，引起人们很多的兴趣，如Ca2+能激活一些细胞质膜上的钾离子（K+）通道[5] ，在支撑的卵磷脂双层膜上，钙离子能与磷脂极性头部作用，改变膜结构与磷脂的构象[6]。
本文在玻碳电极表面上制备磷脂双层膜，采用循环伏安（CV）和交流阻抗方法（EIS）研究钙离子与磷脂双层膜之间的作用，钙离子在膜上能诱导通道，并且作用后的膜，可以自我复原，即撤走钙离子则通道关闭。
1 实验部分
1.1 试剂及仪器
卵磷脂（PC），氯化钙，乙二胺四乙酸；去离子水；所有试剂都为分析纯。电化学工作站（CHI832，美国），电化学工作站（VMP2美国），超声清洗仪；二次纯水蒸馏器（1810B）。
1.2 磷脂双层膜的制备
实验中我们略做更改，主要模拟膜的制备方法已经有了描述[7]，配制卵磷脂氯仿溶液20μg/μL作为制备膜的贮备液，-4℃保存。玻碳电极用抛光粉Al2O3抛光，利用超声清洗，5分钟后，在0.1mol/L KOH溶液浸入预处理后的玻碳电极，1.5V的电压下，极化3分钟，取出电极，用N2吹干，将吹干的电极，再浸入成膜液中30秒，取出立即浸入0.1mol/L KCl，卵磷脂极性作用形成双层膜。
1.3 实验部分
在1.0mmol/L的K3Fe（CN）6中进行循环伏安和交流阻抗实验。振幅为10mv，式电势（+0.225），频率范围200KHz-0.1Hz。分别以裸玻碳电极，PC修饰电极，与氯化钙作用后的PC修饰电极为工作电极。
2 结果与讨论
2.1 电极的循环伏安响应
支撑磷脂双层膜的质量，我们通过循环伏安方法来判断。循环伏安实验1.0mmol/L的Fe（CN）63-/4-溶液中进行，扫描速度：50mV/s，裸玻碳电极的电化学响应见图（1-a）。膜修饰电极的电化学响应见图（1-b）。比较图（1-a）与图（1-b）的，Fe（CN）63-/4-的峰电流几乎消失在图（1-b）中可以看出，证明Fe（CN）63-/4-探针离子无法到达电极表面，发生电子转移反应，支撑磷脂膜制备是很成功的在玻碳电极表面。
2.2 膜修饰电极的交流阻抗响应
修饰电极表面性质的研究最有效的方法之一是交流阻抗，测定电极电容来判断磷脂双层膜的形成。图2是电极的阻抗图谱（Nyquist曲线）。裸玻碳电极的阻抗谱见图（2-a），几乎表现为一条直线，电子传递的物质在电极上几乎没有阻挡，在裸GC电极上Fe（CN）63-/4-的电子传递反应是受扩散控制的，反应较快，Fe（CN）63-/4-探针非常容易到达电极表面。
膜修饰电极见图（2-b），呈现一个半径较大的半圆。表明膜内部致密，无空隙，电极表面电荷传递电阻显著增大，Fe（CN）63-/4-探针不能通修饰膜，这一个过程几乎完全受动力学控制[8]。实验证实双层膜成功制备。
我们选择Randles等效电路[9]（如图2中插图）对测量结果进行拟合，进一步研究修饰磷脂膜的阻抗信息， 阻抗测量的结果，图中Rs为电解质电阻、Cm为磷脂膜电容、Rm为磷脂膜电阻、Cdl双层电容、Rct电荷传输电阻。拟合计算可得Cm值，磷脂的相对介电常数κ=2.05[9]， 真空介电常数ε0=8.85×10-14 F/cm， 由（1）式计算可得磷脂膜厚度d。
Cm=ε0κ/d （1）
计算得出膜厚度d为4.53nm，与文献中的厚度约为4nm-10nm吻合[10]，再次证明双层膜的构筑成功。
2.3 钙离子与双层膜的相互作用
4mmol/L的氯化钙溶液中，浸入修饰磷脂双层膜的电极，分别作用10min，40min，60min后，进行循环伏安测试，扫速：50mV/s.，见图3。随着作用作用时间的增加，氧化还原峰电流也升高，说明Fe（CN）63-/4-探针分子，达电极表面容易，快速的发生电子转移， 由此推断，钙离子与卵磷脂酸性头基作用，改变了卵磷脂分子自组装相位，钙离子促进离子通道的产生。
随后，我们将已形成双层膜电极放入到不同浓度的钙离子溶液中浸泡10min后，取出浸入1mmol/L Fe（CN）63-/ 4-中进行伏安实验，扫度：50mV/s。CaCl2的浓度浸泡顺序依次为：8×10-3mol/L，6×10-3mol/L，4×10-3mol/L；其循环伏安曲线如图4所示。我们可以看到随着与磷脂双层膜作用的CaCl2溶液的浓度增加，图中正负扫描的电流差值ΔI也不断增加，这说明在电极表面局部产生的离子通道与作用物钙离子浓度成正比，使Fe（CN）63-/ 4-探针能到达电极表面容易。说明与双层膜作用的CaCl2浓度越大， 双层膜产生离子通道或孔洞越多，Fe（CN）63-/ 4-到达电极表面越容易，相同的时间内，到达电极表面的数目越多。 2.4 膜与钙离子作用后的修复
10mmol/L EDTA溶液中，浸入与4mmol/L钙离子作用60min后的磷脂膜修饰电极，隔一定时间，取出再浸入1mmolLK3Fe（CN）6中进行循环伏安实验，扫速50mV/s，见图5，氧化还原峰降低明显，随着EDTA与钙离子作用时间增加，峰电流降低，最后几乎恢复到作用前。这说明相互作用产生的离子通道在EDTA溶液中是可以复原的，由于乙二胺四乙酸阴离子（EDTA）含有6个配位原子，它与金属离子能形成5个五元环，成为一类最稳定的配合物，它是一种很好的螯合剂，能与不易生成配合物的8e-外层的Ca2+离子形成稳定的螯合物，使钙离子脱离跟磷脂头部结合，磷脂膜恢复到原先的致密状态，探针 Fe（CN）63-/4-不能产生伏安响应。
结语
制备模拟膜， 通过循环伏安（CV）实验及交流阻抗（EIS）实验测定，证实成膜情况，测试了钙离子与膜的相互作用，发现在Ca2+ 的作用下双层膜的离子通道形成，增加Ca2+浓度及作用时间，Fe（CN）63-/4-的峰电流增大。作用后的膜在EDTA中能恢复初始状态，说明Ca2+与膜的作用可逆，即除去Ca2+通道关闭。
参考文献
[1]Tien H T， Ottova A L. From self-assembled bilayer lipid membranes （BLMs） to supported BLMs on metal and hydrogel substrateds to practical applications colloids and surfaces [J].Physicochemical and Engineering Aspects，1999，149（1-3）：217-233.
[2]GaoHong，LuoGuo-an，Fengjun，et al.Photoelectric conversion properties of bilayer lipid membranes selfassembled on an ITO substrate[J].Journal of Electroanalytical Chemistry，2001，496：158-161.
[3]H.T.Tien，S.H.Wurster，A.L. Ottova， Electrochemistry of supported bilayer lipid membranes：background and techniques for biosensor development， Bioelectrochem. Bioenerg.，1997，42：77-94.
[4]H.T.Tien， R.H.Barish， L.-Q.Gu， Ottova，A.L.，Supported bilayer lipid membranes as ion and molecular probes. Anal. Sci.，1998，14：3-18.
[5]Lars Kaestner， Ingolf Bernhardt. Ion channels in the human red blood cell membrane：their further investigation and physiological relevance[J].Bioelectrochemistry，2002，55：71-74.
[6]D. Jiang， P. Diao， R. Tong， D. Gu， B. Zhong， Ca2+ induced Fe（CN）63-/4-electron transfer at Pt supported BLM electrode， Bioelectrochem.Bioenerg.，1998，44：285-288.
[7]Z. Y. Wu，J. L.Tang， Z. L. Cheng， X. R. Yang， E. K. Wang， Ion channel behavior of supported bilayer lipid membranes on a glassy carbon electrode，Anal. Chem.，2000，72：6030-6033.
[8]D.Pan，J. Chen， W. Tao， S.Yao， Phosphopolyoxomolybdate absorbed on lipid membranes/carbon nanotube electrode，J.Electroanal. Chem.， 2005，579：77-82.
[9]R.Fettiplace， D.M. Andrews，D.A.Haydon，The thickness， composition and structure of some lipid bilayers and natural membranes，J. Membrane Biol.，1971，5：277-296.
[10]G.Favero， A.D. Annibale，L.Campanella， Membrane supported bilayer lipid membranes array： preparation，stability and ion-channel insertion，Anal. Chim. Acta.，2002，460：23-34.
【关键词】钙离子 循环伏安 交流阻抗 离子通道 模拟磷脂双层膜
生命体系中的许多吸收与代谢过程都在生物膜上进行，它在生命过程中的作用十分重要。由于膜的构成、功能独特复杂，实时与原位观测和研究是十分困难的。因此，人们广泛关注仿生膜的研究。从平板双层类脂膜被发现以来，此膜已被广泛而深入地应用作为模拟膜的模型[1]。但是平板双层类脂膜有寿命较短、稳定性差的缺点，在其他领域的应用有一些局限性[2]。近年来，稳定性好、长寿命的双层类脂膜制备方法的出现，广泛地应用于电化学生物传感器[3]和离子通道等行为的研究[4]。
钙离子是机体的必需元素，参与细胞的多种生理活动，具有极其重要的生理功能， 钙离子与模拟膜作用，出现离子通道，引起人们很多的兴趣，如Ca2+能激活一些细胞质膜上的钾离子（K+）通道[5] ，在支撑的卵磷脂双层膜上，钙离子能与磷脂极性头部作用，改变膜结构与磷脂的构象[6]。
本文在玻碳电极表面上制备磷脂双层膜，采用循环伏安（CV）和交流阻抗方法（EIS）研究钙离子与磷脂双层膜之间的作用，钙离子在膜上能诱导通道，并且作用后的膜，可以自我复原，即撤走钙离子则通道关闭。
1 实验部分
1.1 试剂及仪器
卵磷脂（PC），氯化钙，乙二胺四乙酸；去离子水；所有试剂都为分析纯。电化学工作站（CHI832，美国），电化学工作站（VMP2美国），超声清洗仪；二次纯水蒸馏器（1810B）。
1.2 磷脂双层膜的制备
实验中我们略做更改，主要模拟膜的制备方法已经有了描述[7]，配制卵磷脂氯仿溶液20μg/μL作为制备膜的贮备液，-4℃保存。玻碳电极用抛光粉Al2O3抛光，利用超声清洗，5分钟后，在0.1mol/L KOH溶液浸入预处理后的玻碳电极，1.5V的电压下，极化3分钟，取出电极，用N2吹干，将吹干的电极，再浸入成膜液中30秒，取出立即浸入0.1mol/L KCl，卵磷脂极性作用形成双层膜。
1.3 实验部分
在1.0mmol/L的K3Fe（CN）6中进行循环伏安和交流阻抗实验。振幅为10mv，式电势（+0.225），频率范围200KHz-0.1Hz。分别以裸玻碳电极，PC修饰电极，与氯化钙作用后的PC修饰电极为工作电极。
2 结果与讨论
2.1 电极的循环伏安响应
支撑磷脂双层膜的质量，我们通过循环伏安方法来判断。循环伏安实验1.0mmol/L的Fe（CN）63-/4-溶液中进行，扫描速度：50mV/s，裸玻碳电极的电化学响应见图（1-a）。膜修饰电极的电化学响应见图（1-b）。比较图（1-a）与图（1-b）的，Fe（CN）63-/4-的峰电流几乎消失在图（1-b）中可以看出，证明Fe（CN）63-/4-探针离子无法到达电极表面，发生电子转移反应，支撑磷脂膜制备是很成功的在玻碳电极表面。
2.2 膜修饰电极的交流阻抗响应
修饰电极表面性质的研究最有效的方法之一是交流阻抗，测定电极电容来判断磷脂双层膜的形成。图2是电极的阻抗图谱（Nyquist曲线）。裸玻碳电极的阻抗谱见图（2-a），几乎表现为一条直线，电子传递的物质在电极上几乎没有阻挡，在裸GC电极上Fe（CN）63-/4-的电子传递反应是受扩散控制的，反应较快，Fe（CN）63-/4-探针非常容易到达电极表面。
膜修饰电极见图（2-b），呈现一个半径较大的半圆。表明膜内部致密，无空隙，电极表面电荷传递电阻显著增大，Fe（CN）63-/4-探针不能通修饰膜，这一个过程几乎完全受动力学控制[8]。实验证实双层膜成功制备。
我们选择Randles等效电路[9]（如图2中插图）对测量结果进行拟合，进一步研究修饰磷脂膜的阻抗信息， 阻抗测量的结果，图中Rs为电解质电阻、Cm为磷脂膜电容、Rm为磷脂膜电阻、Cdl双层电容、Rct电荷传输电阻。拟合计算可得Cm值，磷脂的相对介电常数κ=2.05[9]， 真空介电常数ε0=8.85×10-14 F/cm， 由（1）式计算可得磷脂膜厚度d。
Cm=ε0κ/d （1）
计算得出膜厚度d为4.53nm，与文献中的厚度约为4nm-10nm吻合[10]，再次证明双层膜的构筑成功。
2.3 钙离子与双层膜的相互作用
4mmol/L的氯化钙溶液中，浸入修饰磷脂双层膜的电极，分别作用10min，40min，60min后，进行循环伏安测试，扫速：50mV/s.，见图3。随着作用作用时间的增加，氧化还原峰电流也升高，说明Fe（CN）63-/4-探针分子，达电极表面容易，快速的发生电子转移， 由此推断，钙离子与卵磷脂酸性头基作用，改变了卵磷脂分子自组装相位，钙离子促进离子通道的产生。
随后，我们将已形成双层膜电极放入到不同浓度的钙离子溶液中浸泡10min后，取出浸入1mmol/L Fe（CN）63-/ 4-中进行伏安实验，扫度：50mV/s。CaCl2的浓度浸泡顺序依次为：8×10-3mol/L，6×10-3mol/L，4×10-3mol/L；其循环伏安曲线如图4所示。我们可以看到随着与磷脂双层膜作用的CaCl2溶液的浓度增加，图中正负扫描的电流差值ΔI也不断增加，这说明在电极表面局部产生的离子通道与作用物钙离子浓度成正比，使Fe（CN）63-/ 4-探针能到达电极表面容易。说明与双层膜作用的CaCl2浓度越大， 双层膜产生离子通道或孔洞越多，Fe（CN）63-/ 4-到达电极表面越容易，相同的时间内，到达电极表面的数目越多。 2.4 膜与钙离子作用后的修复
10mmol/L EDTA溶液中，浸入与4mmol/L钙离子作用60min后的磷脂膜修饰电极，隔一定时间，取出再浸入1mmolLK3Fe（CN）6中进行循环伏安实验，扫速50mV/s，见图5，氧化还原峰降低明显，随着EDTA与钙离子作用时间增加，峰电流降低，最后几乎恢复到作用前。这说明相互作用产生的离子通道在EDTA溶液中是可以复原的，由于乙二胺四乙酸阴离子（EDTA）含有6个配位原子，它与金属离子能形成5个五元环，成为一类最稳定的配合物，它是一种很好的螯合剂，能与不易生成配合物的8e-外层的Ca2+离子形成稳定的螯合物，使钙离子脱离跟磷脂头部结合，磷脂膜恢复到原先的致密状态，探针 Fe（CN）63-/4-不能产生伏安响应。
结语
制备模拟膜， 通过循环伏安（CV）实验及交流阻抗（EIS）实验测定，证实成膜情况，测试了钙离子与膜的相互作用，发现在Ca2+ 的作用下双层膜的离子通道形成，增加Ca2+浓度及作用时间，Fe（CN）63-/4-的峰电流增大。作用后的膜在EDTA中能恢复初始状态，说明Ca2+与膜的作用可逆，即除去Ca2+通道关闭。
参考文献
[1]Tien H T， Ottova A L. From self-assembled bilayer lipid membranes （BLMs） to supported BLMs on metal and hydrogel substrateds to practical applications colloids and surfaces [J].Physicochemical and Engineering Aspects，1999，149（1-3）：217-233.
[2]GaoHong，LuoGuo-an，Fengjun，et al.Photoelectric conversion properties of bilayer lipid membranes selfassembled on an ITO substrate[J].Journal of Electroanalytical Chemistry，2001，496：158-161.
[3]H.T.Tien，S.H.Wurster，A.L. Ottova， Electrochemistry of supported bilayer lipid membranes：background and techniques for biosensor development， Bioelectrochem. Bioenerg.，1997，42：77-94.
[4]H.T.Tien， R.H.Barish， L.-Q.Gu， Ottova，A.L.，Supported bilayer lipid membranes as ion and molecular probes. Anal. Sci.，1998，14：3-18.
[5]Lars Kaestner， Ingolf Bernhardt. Ion channels in the human red blood cell membrane：their further investigation and physiological relevance[J].Bioelectrochemistry，2002，55：71-74.
[6]D. Jiang， P. Diao， R. Tong， D. Gu， B. Zhong， Ca2+ induced Fe（CN）63-/4-electron transfer at Pt supported BLM electrode， Bioelectrochem.Bioenerg.，1998，44：285-288.
[7]Z. Y. Wu，J. L.Tang， Z. L. Cheng， X. R. Yang， E. K. Wang， Ion channel behavior of supported bilayer lipid membranes on a glassy carbon electrode，Anal. Chem.，2000，72：6030-6033.
[8]D.Pan，J. Chen， W. Tao， S.Yao， Phosphopolyoxomolybdate absorbed on lipid membranes/carbon nanotube electrode，J.Electroanal. Chem.， 2005，579：77-82.
[9]R.Fettiplace， D.M. Andrews，D.A.Haydon，The thickness， composition and structure of some lipid bilayers and natural membranes，J. Membrane Biol.，1971，5：277-296.
[10]G.Favero， A.D. Annibale，L.Campanella， Membrane supported bilayer lipid membranes array： preparation，stability and ion-channel insertion，Anal. Chim. Acta.，2002，460：23-34.