论文部分内容阅读
摘要:采用PCR-RPLC法对样本基因组进行扩增与酶切,用UNPASED3.0对GCLM基因位点基因型和等位基因进行卡方检验,结果显示GCLM基因位点的等位基因和基因型均与迟发性运动障碍的病症无明显相关性。
关键词:GCLM基因;迟发性运动障碍;等位基因频率
中图分类号:R741 文献标识码:A 文章编号:1674-0432(2010)-06-0052-2
迟发性运动障碍(tardive dyskinesia,TD)是精神科临床较为常见的一种由抗精神病药物所诱发的运动系统副作用,这种药物副反应虽不是致命的,但是具有明显的致残性,发生率高,而且随患者年龄的增大而增加。目前尚未找到有效的治疗手段,因此对迟发性运动障碍方面的进一步研究日益迫切。
GSH是体内重要保护因子,在保护生物膜及生物大分子免受自由基损伤方面起着重要作用。GSH—PX是催化过氧化氢分解的重要酶,能特异地催化GSH对过氧化氢的还原反应,起到保护细胞膜结构和功能完整性的作用。谷氨酸-半胱氨酸连接酶(glutamate-cysteine ligase,GCL)是谷胱甘肽(GSH)合成过程中的限速酶,后者在调节细胞氧化还原状态、避免氧化损伤过程中发挥主要作用。GCL由催化亚基(GCL catalytic subunit,GCLC)和修饰亚基(GCL modifier subunit,GCLM)组成,前者具有全部催化活性,而后者具有重要调节功能。
1 实验材料与方法
1.1实验样本
1.1.1 样本来源 TD病人血液样本采自北京回龙观医院的患有迟发性运动障碍的病人,共226例;正常对照血样均来自医院体检正常健康人,共192人。以上研究对象均为中国汉族人。
1.1.2 样本处理 对所有血样抗凝管进行离心,4000r/min,分离出血浆,红细胞,剩余血样提取DNA,均置于-20℃保存待用。
1.2 主要仪器与试剂
PCR仪(山特电子深圳有限公司)电子天平(郑州南北仪器设备有限公司)电热恒温培养箱(上海一恒科技有限公司)离心机(美国Sigma公司)ND-1000紫外分光光度计(美国Gene company limited 公司)凝胶成像系统(美国BIO-RAD公司)漩涡震荡仪(北京北方同正生物技术发展公司)电泳仪(北京六一仪器厂)水平琼脂糖电泳槽(北京六一仪器厂)琼脂糖(美国Promega公司)Primers(北京奥科生物)Taq DNA聚合酶(美国Promega公司)限制性内切酶Eco81 I(美国Promega公司)溴化乙锭(大连宝生物工程有限公司),溴酚蓝(大连宝生物工程有限公司)DNA标准Marker(大连宝生物工程有限公司)
1.3 实验方法
1.3.1 引物设计 应用Primer3(http://www.sagb.co.uk),结合PCR引物设计原则,来设计PCR扩增的引物。本实验所用引物见表1。
表1 中国籍样本PCR所用引物序列
Gene SNP primer sequence
GCLM
rs718875 F: 5-GAAGGAGCAGAACCAACT-3
R: 5-AGAGAGCGGAGAACAAAC-3
1.3.2 PCR反应循环条件与酶切体系 PCR反应循环条件:(1)95℃,5min;(2)95℃,30s→59℃,30s→72℃,30s 循环30-35次;(3)72℃,5min;(4)4℃保存。
酶切反应体系为:
DNA(扩增产物) 10μL
限制性内切酶(10U/μL) 0.3μL
1×Buffer 0.3μL
DdH2O 2.4μL
SNP所需限制性内切酶及其反应条件;PCR产物酶切后片段长度及其基因型见表2。
表2 各基因型和限制性内切酶信息
Gene RE Fragent length Cut Homo Cut heter Utcut Homo T(℃)
GCLM Eco81 I 110/290/400 CC CT TT 37
2 实验结果
2.1 基因型与等位基因频率
对所有样本的GCLM基因型进行PCR鉴定,该位点也是一个C/T二态SNP,扩增后长度为400bp,酶切后产生110bp和290bp两条片段,在群体中组成C/C、C/T和T/T三种基因型。用UNPHASED3.0计算出病人组与正常组基因型与等位基因频率,括号内数值为各基因类型所占百分比。结果见表3和图1。
表3 GCLM基因的基因型和等位基因频率
Group Genotopic numbers(%) Allelic numbers(%)
C/C C/T T/T C T
Controls 2(1.5) 39(28.7) 95(69.9) 43(15.8) 229(84.2)
Patients 4(1.8) 48(21.7) 169(76.5) 56(12.7) 386(87.3)
Marker C/TT/TT/TT/TT/TT/TC/C
图1 GCLM基因酶切后的电泳结果
2.2 Hardy-Weinberg平衡检验结果
采用SPSS13.0对病例组和正常对照组的SNP基因型进行X2检验,结果表明他们的基因频率分布都没有偏离H-W平衡,表示样本均来自随机婚配的自然群体,见表4。
表4 卡方检验H-W平衡结果
Gene Case Contorl
X2 P X2 P
GCLM 0.076 >0.05 0.812 >0.05
2.3 等位基因和基因型与TD病症的相关性分析
2.3.1 等位基因与TD的相关性 通过Case-Control比较,采用UNPHASED3.0软件SNP位点进行相关性分析,得到的P值均大于0.05,发现该位点与TD无关联(见表5)。
表5 SNP等位基因与TD关系
Gene Allele Case Control X2 P
GCLM C 56 43 0.223 0.773
T 386 229
2.3.2 基因型与TD的相关性 应用UNPHASED3.0软件采用Case –Control比较方式,对SNP位点的基因型与TD进行相关性分析,分析结果表明该位点基因型也与TD无关联(P>0.05),见表6。
表6 SNP基因型与TD关系
Gene Genotype Case Control Total X2 P
GCLM CC 4 2 6 1.226 0.542
CT 48 39 87
TT 169 95 264
Total 221 137 357
3 讨论
3.1 基因型频率及等位基因频率
计算过基因型频率及等位基因频率可知,该位点T/T比例较多,而C/C极少,这显示出了一定的基因稳定性,与西方人群相比,中国人种的比例与其有着明显差别,在此两个位点上突变率也较低。
3.2 H-W平衡的检验
通过H-W平衡的检验得出实验所用样本符合一般自然规律,具有随机性,代表性,为实验的准确性奠定了基础。
3.3 相关性分析
通过UNPASED3.0遗传软件的分析,无论是基因型还是等位基因与TD病症都没有显著的相关性,可能正是由于其遗传的变异性小,并不是疾病产生的决定因素。而这点与西方人群中的结果不同,这也说明了病症与人的基因有着重要的关系,有待我们进一步的研究。
参考文献
[1]谢帆,江开达.迟发性运动障碍研究进展[J].临床精神医学杂志,2000,10(6):363.
[2]陈琳,赵冰.不同运动处方对老年人丙二醛、超氧化物歧化酶、还原性谷胱甘肽和谷胱甘肽过氧化物酶的影响[J].新乡医学院学报,2007,24(3):237-239.
[3]RahmanI.Regulation of glutathione in inflammation and chroniclung diseases[J].Mutat Res,2005,579(1-2):58-80.
[4]Rana SV,Allen T,Singh R.Inevitable glutathione,then and now[J]. Indian J Exp Biol,2002,40(6):706-716.
[5]Wild AC,Mulcahy RT.Regulation of gamma-glutamylcysteine synthetase subunit gene expression: insights into transeriptional control of antioxidant defenses[J].Free Radic Res,2000,32(4):281-301.
作者介绍:党玉凤(1985-),女,吉林农业大学中药材学院在读硕士研究生,研究方向:天然产物化学与新药开发。
通讯作者:郑友兰(1956-),女,湖北武汉人,教授,研究方向:天然产物化学成分及功能食品开发研究。
关键词:GCLM基因;迟发性运动障碍;等位基因频率
中图分类号:R741 文献标识码:A 文章编号:1674-0432(2010)-06-0052-2
迟发性运动障碍(tardive dyskinesia,TD)是精神科临床较为常见的一种由抗精神病药物所诱发的运动系统副作用,这种药物副反应虽不是致命的,但是具有明显的致残性,发生率高,而且随患者年龄的增大而增加。目前尚未找到有效的治疗手段,因此对迟发性运动障碍方面的进一步研究日益迫切。
GSH是体内重要保护因子,在保护生物膜及生物大分子免受自由基损伤方面起着重要作用。GSH—PX是催化过氧化氢分解的重要酶,能特异地催化GSH对过氧化氢的还原反应,起到保护细胞膜结构和功能完整性的作用。谷氨酸-半胱氨酸连接酶(glutamate-cysteine ligase,GCL)是谷胱甘肽(GSH)合成过程中的限速酶,后者在调节细胞氧化还原状态、避免氧化损伤过程中发挥主要作用。GCL由催化亚基(GCL catalytic subunit,GCLC)和修饰亚基(GCL modifier subunit,GCLM)组成,前者具有全部催化活性,而后者具有重要调节功能。
1 实验材料与方法
1.1实验样本
1.1.1 样本来源 TD病人血液样本采自北京回龙观医院的患有迟发性运动障碍的病人,共226例;正常对照血样均来自医院体检正常健康人,共192人。以上研究对象均为中国汉族人。
1.1.2 样本处理 对所有血样抗凝管进行离心,4000r/min,分离出血浆,红细胞,剩余血样提取DNA,均置于-20℃保存待用。
1.2 主要仪器与试剂
PCR仪(山特电子深圳有限公司)电子天平(郑州南北仪器设备有限公司)电热恒温培养箱(上海一恒科技有限公司)离心机(美国Sigma公司)ND-1000紫外分光光度计(美国Gene company limited 公司)凝胶成像系统(美国BIO-RAD公司)漩涡震荡仪(北京北方同正生物技术发展公司)电泳仪(北京六一仪器厂)水平琼脂糖电泳槽(北京六一仪器厂)琼脂糖(美国Promega公司)Primers(北京奥科生物)Taq DNA聚合酶(美国Promega公司)限制性内切酶Eco81 I(美国Promega公司)溴化乙锭(大连宝生物工程有限公司),溴酚蓝(大连宝生物工程有限公司)DNA标准Marker(大连宝生物工程有限公司)
1.3 实验方法
1.3.1 引物设计 应用Primer3(http://www.sagb.co.uk),结合PCR引物设计原则,来设计PCR扩增的引物。本实验所用引物见表1。
表1 中国籍样本PCR所用引物序列
Gene SNP primer sequence
GCLM
rs718875 F: 5-GAAGGAGCAGAACCAACT-3
R: 5-AGAGAGCGGAGAACAAAC-3
1.3.2 PCR反应循环条件与酶切体系 PCR反应循环条件:(1)95℃,5min;(2)95℃,30s→59℃,30s→72℃,30s 循环30-35次;(3)72℃,5min;(4)4℃保存。
酶切反应体系为:
DNA(扩增产物) 10μL
限制性内切酶(10U/μL) 0.3μL
1×Buffer 0.3μL
DdH2O 2.4μL
SNP所需限制性内切酶及其反应条件;PCR产物酶切后片段长度及其基因型见表2。
表2 各基因型和限制性内切酶信息
Gene RE Fragent length Cut Homo Cut heter Utcut Homo T(℃)
GCLM Eco81 I 110/290/400 CC CT TT 37
2 实验结果
2.1 基因型与等位基因频率
对所有样本的GCLM基因型进行PCR鉴定,该位点也是一个C/T二态SNP,扩增后长度为400bp,酶切后产生110bp和290bp两条片段,在群体中组成C/C、C/T和T/T三种基因型。用UNPHASED3.0计算出病人组与正常组基因型与等位基因频率,括号内数值为各基因类型所占百分比。结果见表3和图1。
表3 GCLM基因的基因型和等位基因频率
Group Genotopic numbers(%) Allelic numbers(%)
C/C C/T T/T C T
Controls 2(1.5) 39(28.7) 95(69.9) 43(15.8) 229(84.2)
Patients 4(1.8) 48(21.7) 169(76.5) 56(12.7) 386(87.3)
Marker C/TT/TT/TT/TT/TT/TC/C
图1 GCLM基因酶切后的电泳结果
2.2 Hardy-Weinberg平衡检验结果
采用SPSS13.0对病例组和正常对照组的SNP基因型进行X2检验,结果表明他们的基因频率分布都没有偏离H-W平衡,表示样本均来自随机婚配的自然群体,见表4。
表4 卡方检验H-W平衡结果
Gene Case Contorl
X2 P X2 P
GCLM 0.076 >0.05 0.812 >0.05
2.3 等位基因和基因型与TD病症的相关性分析
2.3.1 等位基因与TD的相关性 通过Case-Control比较,采用UNPHASED3.0软件SNP位点进行相关性分析,得到的P值均大于0.05,发现该位点与TD无关联(见表5)。
表5 SNP等位基因与TD关系
Gene Allele Case Control X2 P
GCLM C 56 43 0.223 0.773
T 386 229
2.3.2 基因型与TD的相关性 应用UNPHASED3.0软件采用Case –Control比较方式,对SNP位点的基因型与TD进行相关性分析,分析结果表明该位点基因型也与TD无关联(P>0.05),见表6。
表6 SNP基因型与TD关系
Gene Genotype Case Control Total X2 P
GCLM CC 4 2 6 1.226 0.542
CT 48 39 87
TT 169 95 264
Total 221 137 357
3 讨论
3.1 基因型频率及等位基因频率
计算过基因型频率及等位基因频率可知,该位点T/T比例较多,而C/C极少,这显示出了一定的基因稳定性,与西方人群相比,中国人种的比例与其有着明显差别,在此两个位点上突变率也较低。
3.2 H-W平衡的检验
通过H-W平衡的检验得出实验所用样本符合一般自然规律,具有随机性,代表性,为实验的准确性奠定了基础。
3.3 相关性分析
通过UNPASED3.0遗传软件的分析,无论是基因型还是等位基因与TD病症都没有显著的相关性,可能正是由于其遗传的变异性小,并不是疾病产生的决定因素。而这点与西方人群中的结果不同,这也说明了病症与人的基因有着重要的关系,有待我们进一步的研究。
参考文献
[1]谢帆,江开达.迟发性运动障碍研究进展[J].临床精神医学杂志,2000,10(6):363.
[2]陈琳,赵冰.不同运动处方对老年人丙二醛、超氧化物歧化酶、还原性谷胱甘肽和谷胱甘肽过氧化物酶的影响[J].新乡医学院学报,2007,24(3):237-239.
[3]RahmanI.Regulation of glutathione in inflammation and chroniclung diseases[J].Mutat Res,2005,579(1-2):58-80.
[4]Rana SV,Allen T,Singh R.Inevitable glutathione,then and now[J]. Indian J Exp Biol,2002,40(6):706-716.
[5]Wild AC,Mulcahy RT.Regulation of gamma-glutamylcysteine synthetase subunit gene expression: insights into transeriptional control of antioxidant defenses[J].Free Radic Res,2000,32(4):281-301.
作者介绍:党玉凤(1985-),女,吉林农业大学中药材学院在读硕士研究生,研究方向:天然产物化学与新药开发。
通讯作者:郑友兰(1956-),女,湖北武汉人,教授,研究方向:天然产物化学成分及功能食品开发研究。