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摘要 荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens CZ能分泌包括碱性磷酸酶在内的抗病毒蛋白抑制烟草花叶病毒Tobacco mosaic virus（TMV）侵染。本文利用抗生素利福平逐级诱导获得抗药性标记菌株CZ-rif，生测试验显示：野生型和抗药型菌株的发酵上清和粗蛋白液对TMV的体外钝化效果均大于90%，无显著差异。灭菌和非灭菌的根际土拌CZ-rif菌液后盆栽烟苗，取根际土在含抗生素的平板上检测定殖菌量，结果显示，CZ-rif能够在烟株根际土壤中有效定殖，第31天在灭菌土中的定殖菌量为4.3×104 cfu/g，显著大于在非灭菌土中的定殖菌量6×103 cfu/g，在叶面上的定殖菌量显著低于根际土壤。叶面喷施CZ-rif菌液后24 h接种病毒，对TMV-GFP的预防效果为4585%。田间试验中喷淋菌株发酵稀释液，对烟草花叶病毒病的防效为42.02%。此外，水培试验显示生防菌发酵液对烟草幼苗具有促生作用。总之，荧光假单胞菌CZ能在烟草根际定殖和促进植株生长，叶面喷施能钝化TMV并抑制其初侵染，可以研发防治病毒病害的生物制剂。
關键词 植物根际促生细菌; 荧光假单胞菌; 定殖; 促生
中图分类号： S 435.72
文献标识码： A
DOI： 10.16688/j.zwbh.2019501
Abstract Pseudomonas fluorescens CZ can secrete antiviral proteins including alkaline phosphatase to inhibit the infection of Tobacco mosaic virus （TMV）. The resistant strain named CZ-rif was obtained by inducible screening and culture with antibiotic rifampicin. Both wild type and resistant strain could produce antiviral proteins to remarkably inactivate TMV in vitro with an efficiency of above 90%， showing no significant difference. In colonization experiments by planting tobacco in sterilized or unsterilized soil mixed with CZ-rif bacteria， the population of colonizing bacteria in rhizosphere soil was checked by using the colony-counting method on plates with antibiotics. The results showed that CZ-rif could colonize the tobacco-planted soil. The population in unsterilized soil was 4.3×104 cfu/g， higher than that in sterilized soil （6×103 cfu/g） at 31 d. The population on the tobacco phylloplane was lower than that in the soil. Spraying bacteria could suppress TMV-GFP infection by 45.85% at 24 h. In field experiments by showering with bacteria fermentation， CZ had an inhibition effect of 42.02% against plant viruses. Furthermore， in water planting experiments， CZ fermentation broth could promote tobacco plant growth. In conclusion， P.fluorescens CZ could colonize the tobacco rhizosphere to promote plant growth， and inactivate TMV to suppress virus initial infection， showing the potential as a biological agent.
Key words plant growth-promoting rhizobacteria （PGPR）; Pseudomonas fluorescens; colonization; growth-promoting
1989年-1991年第一次烟草侵染性病害调查指出，我国烟草上发生的病毒病害有16种[1]，2010年-2014年第二次侵染性病害调查时，病毒病种类上升至25种[2]。病毒病已成为烟草上的毁灭性病害，常年高频发生，造成严重的经济损失。目前登记在烟草上的抗病毒剂有盐酸吗啉胍、混合脂肪酸、氯溴异氰尿酸、甾烯醇、宁南霉素、嘧肽霉素、氨基寡糖素、香菇多糖、壳寡糖、超敏蛋白、寡糖·链蛋白。近年来，α-氨基膦酸酯化合物毒氟磷以及噻二唑类杂环化合物甲噻诱胺获得农药登记，用于防治植物病毒病[3]。
抗病毒剂的作用机制主要有三种：1）通过钝化病毒和封闭侵染位点来抑制病毒的初侵染;2）通过干扰病毒蛋白的合成和病毒粒子装配来抑制病毒增殖和扩散;3）通过提高寄主防御酶活性和激活抗性相关基因的表达来诱导植物产生系统抗性[4]。但是，由于植物没有完整的免疫系统，且病毒对植物细胞具有绝对寄生性，病毒一旦在植物体内完成侵染，就会迅速扩展，无药根除。对来自真菌、细菌和植物的天然抗病毒活性物质进行鉴定和分离，创制基于天然产物结构的新型抗病毒剂成为研究热点之一[3]。随着环境安全问题日益突显，生物农药及生物防治越来越受重视。 荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens能抑制多种土传病原真菌、卵菌和线虫;还能改善植物营养促进生长，因而广泛应用于生物防治[5-11]。荧光假单胞菌的作用方式有两种：1）定殖于植物根际，在幼根表面形成保护层，降低病原菌侵染机会[12]，同时产生水杨酸、脂多糖、嗜铁素等物质，诱导植物产生系统抗性[13-15];2）产生抗生素、嗜铁素、细胞壁降解酶等拮抗物质，直接抑制根际病原菌的生长[16-19]。
模式菌株CHA0、Pf5、Cab57全基因组测序表明，荧光假单胞菌含有编码典型抗生素的4个基因簇：2，4-二乙酰基藤黄酚（2，4-diacetyl phloroglutinol， Phl）、硝吡咯菌素（pyrrolnitrin， Prn）、藤黄绿脓菌素（pyoluteorin， Plt）、氢化氰（hydrogen cyanide， Hcn）[20-22]。荧光假单胞菌M18菌株中含有1-羧基吩嗪（phenazine-1-carboxylic acid， PCA）和藤黄绿脓菌素两种抗生素合成基因[23-24]。2P24菌株含有抗生素2，4-二乙酰藤黃酚合成基因[25]。FD6菌株中含有硝吡咯菌素、2，4-二乙酰藤黄酚、藤黄绿脓菌素、嗜铁素、氢氰酸和蛋白酶等抗菌物质的合成基因[26-27]。全基因组为有益基因的克隆、功能鉴定提供了依据[28]。
前期研究中，发现荧光假单胞菌CZ菌株能分泌包括碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）在内的抗病毒蛋白抑制烟草花叶病毒Tobacco mosaic virus（TMV）初侵染[29-31]。在大肠杆菌中诱导表达并纯化获得AKP蛋白，生物测定显示该抗病毒蛋白稳定性强，对TMV的LD90为0.285 0 mg/mL。作用机制主要为体外钝化病毒和封闭初侵染点[32]。应用中，是以抗病毒蛋白钝化病毒抑制初侵染，还是以活菌定殖促生防病为宜，尚需验证。
本文通过抗生素利福平诱导筛选培养，获得抗性标记菌株CZ-rif，确认其抗病毒活性后，检测其在烟草叶面和根际土壤中的定殖能力和促生防病效果，以期为种子包衣和菌剂应用提供依据。
1 材料与方法
1.1 供试生防细菌、病毒、烟草品种及侵染性克隆
荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens CZ菌株，烟草花叶病毒Tobacco mosaic virus（TMV），三生NN烟Nicotiana tobacum ‘Samsun NN’、本氏烟N.benthamiana、普通烟‘NC89’ N.tobacum ‘NC89’，TMV-GFP（清华大学刘玉乐教授馈赠）。
1.2 菌株抗药性标记
采用利福平（Rif）进行抗药性标记。将CZ菌株在LA固体培养基上划线活化，挑取单菌落转入含利福平5 μg/mL的LB液体培养基中，于28℃、200 r/min培养16～24 h后，在含利福平5 μg/mL的LA上划线培养，挑取单菌落转入下一个浓度梯度中，依次经过含利福平10、20、40、80、120、160、200 μg/mL的LB中诱导，直至筛选到稳定生长的抗利福平200 μg/mL的突变菌株[33]。与野生型比较，记录突变菌株CZ-rif的培养性状。
1.3 抗病毒物质的提取
将在LB中30℃、150 r/min培养48 h的CZ和CZ-rif菌液，10 000 r/min离心10 min去菌体，为发酵上清。发酵上清于95℃水浴10 min灭活蛋白，为蛋白失活液。4℃条件下，向100 mL发酵上清中缓慢加入硫酸铵（56.1 g）至最终浓度为80%，轻轻搅拌溶解后4℃静置过夜，10 000 r/min离心20 min，得上清与沉淀。上清用截留分子量为500 Da的透析袋透析，冷冻干燥后用10 mL PBS溶解，为去蛋白上清。沉淀用10 mL PBS缓冲液（0.01 mol/L，pH 7.0）溶解后，放入透析袋中透析过夜除去硫酸铵，冷冻干燥后用10 mL PBS溶解，为粗蛋白液[34]。
1.4 抗病毒物质对TMV的抑制效果
取TMV感染的烟草病叶1 g，于液氮中充分研磨，加入40 mL PBS后滤去残渣，为病毒接种液。
将发酵上清、蛋白失活液、去蛋白上清、粗蛋白液分别与等体积病毒接种液混合;以等体积的LB与接种液混合作为发酵上清和蛋白失活液的对照，以等体积的PBS与接种液混合作为去蛋白上清和粗蛋白液的对照。静置15～20 min后，采用半叶法在三生NN烟叶片的左侧摩擦接种抗病毒物质与病毒的混合液，右侧接种相应的对照。每株接种3～4片展开叶，每处理4株重复。接种后喷清水去除石英砂，26℃培养4 d后调查枯斑数，按以下公式计算抑制效果[32]。
抑制率=对照单叶平均枯斑数-处理单叶平均枯斑数对照单叶平均枯斑数×100%。
1.5 抗药性标记菌株在根际土壤和叶面的定殖及对TMV-GFP的防效
取烟田根际土样，进行灭菌和非灭菌处理后，将CZ-rif菌液按1%的比例分别添加到土样中，混匀后装入8 cm小花盆中，植入5叶期烟苗，每处理4盆，置于温室中，隔日浇水。于0、3、10、17、24、31、38、45、52、59 d，称取1 g根际土于20 mL灭菌生理盐水中振荡漂洗30 min，取20～100 μL涂抹于含利福平200 μg/mL的LA平板上，28℃培养16 h后，在菌落计数仪上测定目标菌量，以cfu/g土样表示[35-37]。
将菌液喷洒于盆栽的7叶期本氏烟上（每株10 mL），置于28℃、相对湿度60%～80%的温室中培养，隔日浇水。一部分植株于0、3、8、13、18、23、30 d，剪取5 g叶片于20 mL灭菌生理盐水中振荡漂洗，取100 μL涂抹于含利福平200 μg/mL的LA平板上，28℃培养16 h，以cfu/g鲜叶计数目标菌量。另取部分植株于喷洒菌液后1 d，摩擦接种TMV-GFP病汁液，以喷洒培养基为对照，每处理4株重复，接种后4 d调查侵染斑数目，计算对病毒的预防效果。 1.6 CZ菌液对病毒病的田间预防效果
将CZ菌液用水稀释15倍，菌量為106～108 cfu/g（现配现用），采用喷淋法进行病毒病预防试验。普通烟‘NC89’移栽时第一次施药，间隔7～10 d，再连续喷淋2次。每处理设置4次重复，每重复25株，每株50 mL。以喷施0.5%香菇多糖水剂400倍液、20%盐酸吗啉胍可湿性粉剂600倍液为药剂对照。于末次施药后10、20 d各调查1次病情，每小区调查全部烟株[38]。按下式计算预防效果，对各处理防治效果采用DPS 7.05数据处理系统软件，邓肯氏新复极差法进行方差分析。
病情指数=∑（各级病株数×相应级数）调查总株数×9×100;防治效果=空白对照区病情指数-处理区病情指数处理区病情指数×100%。
1.7 CZ菌株对烟草的促生效果测定
平皿滤纸法萌芽试验：向9 cm的平皿中加入0.3 mL CZ发酵上清和3 mL去离子水，以0.3 mL LB培养基和3 mL去离子水为空白培养基对照，以3.3 mL去离子水为清水对照。混匀后铺一层滤纸，每皿点种100粒，4皿重复，用封口膜封口后，26℃培养9 d，统计发芽率并称量百芽鲜重。CZ发酵上清稀释15倍后浸种48 h，种子包衣时再包裹菌体粉末制备包衣剂，采用平皿滤纸点播法测试发芽率。
水培法促生试验：向盛有550 mL霍格兰氏营养液的培养盒中加入20 mL CZ发酵液，以550 mL霍格兰氏营养液和20 mL LB培养液为LB培养液对照，以570 mL霍格兰培养液为空白对照。取长势一致的四叶期烟草幼苗，洗去根土插入培养孔中，每组8株，3次重复。每日添加去离子水10 mL，26℃培养14 d，观察幼苗根冠生长并称量植株鲜重[39]。
2 结果与分析
2.1 抗药性标记菌株CZ-rif的性状及对TMV的抑制活性
野生型菌株经Rif抗性诱导后，获得稳定的抗性标记菌株CZ-rif，其在平板和斜面上的生长性状与野生型无显著差异。提取发酵产物，利用半叶法测定对TMV的抑制效果，如表1所示，CZ的发酵上清、去蛋白上清、粗蛋白液、蛋白失活液对TMV的抑制率分别为96.13%、0%、91.76%、28.96%。CZ-rif的抑制效果分别为96.91%、0%、10000%、66.67%，显示二者的发酵上清、粗蛋白液均有良好的钝化作用，利福平抗性筛选不影响菌株的抗TMV活性。此外，菌株的蛋白失活液仍有一定的抑制效果，说明起抗病毒作用的除了大分子蛋白类，还包括非蛋白类物质。试验效果如图1所示。
2.2 CZ-rif菌株在烟草根际土壤和叶面中的定殖及对TMV-GFP的防效
由图2结果可知，CZ-rif在非灭菌土中0～3 d内由4.72×106 cfu/g急剧下降至1.916×106 cfu/g，降幅达59.41%，这可能与非灭菌土中微生物种群复杂且互相制约有关。第31天之后种群趋于稳定，定殖菌量为6×103 cfu/g土样。而在灭菌土中，0～3 d内由9.04×106 cfu/g上升至2.76×107 cfu/g，升幅达205.31%，可能是没有土著微生物竞争，种群有一个上升的过程。但随后菌量下降，第17天下降至1.952×106 cfu/g，第31天有一个小高峰;之后种群趋于稳定，定殖菌量为4.3×104 cfu/g，菌量水平明显高于非灭菌土中的菌量。
由图3结果可知，喷施菌液后0～30 d，菌株在烟草叶片上种群动态呈下降趋势。0 d的菌量为3.025×107 cfu/g，第3天急剧下降至3.225×106 cfu/g，降幅达89.34%，第13天下降至3.48×105 cfu/g，随后趋于平稳，第30天的定殖数量为2×103 cfu/g鲜叶。前期菌量急剧下降可能与淋溶浇水有关，也说明菌株在叶面不易定殖。
2.3 生防菌培养液对烟草病毒病的田间预防效果
普通烟NC89自移栽时采用CZ培养稀释液喷淋预防病毒病，以喷施0.5%香菇多糖水剂400倍液和20%盐酸吗啉胍可湿性粉剂600倍液为对照，结果见表2。末次药后7 d调查结果显示：CZ处理的发病率16.00%、病情指数2.89，显著低于清水对照的发病率31.33%和病情指数7.76，防治效果为62.76%，高于对照药剂。末次药后21 d调查结果显示：各处理发病率均明显上升，CZ处理的发病率8682%、病情指数27.68，显著低于清水对照的发病率98.00%和病情指数47.74，防治效果为4202%，与对照药剂处理的防效相当。上述试验结果说明：喷淋生防菌培养液对烟草病毒病有较好的预防效果。
2.4 菌株对烟草幼苗生长的促进作用
由平皿滤纸法萌芽试验看出，LB培养基、清水对照和CZ发酵上清3种处理的种子发芽率均为100%，但CZ处理（发酵上清与清水1∶10混合）中种子萌芽更健壮;第9天时，CZ处理百芽鲜重为0.15 g，略高于LB培养基对照（0.09 g）和清水对照处理（0.10 g）（图5），显示CZ对幼苗生长有一定的促进作用。
试验中还观察到CZ发酵上清或LB培养基与清水1∶1混合处理时，种子不萌发;1∶5混合处理时，种子发芽率100%，发芽势与对照相比无显著差异，这说明高浓度的发酵上清对种子萌芽有抑制作用，适当浓度才会促进种子萌发。在种子包衣中，进行生防菌发酵上清浸种及包裹菌体粉末处理，其发芽率与常规包衣种子无显著差异。
烟草幼苗在添加CZ发酵液的培养液中培养14 d时，幼苗的茎叶生长和根系发育均优于LB培养基和空白对照处理（图6）。CZ处理的幼苗其根系发育粗短健壮、侧根较多，单株平均鲜重（2.12 g）明显高于LB培养基（1.13 g）和清水对照处理（0.85 g），说明CZ有促进幼苗生长的作用。
3 结论与讨论 荧光假单胞菌是一类对多种病、虫、草害具广谱性抑制作用的有益微生物，广泛应用于生物防治。目前，荧光假单胞菌活芽孢制剂（PD20151707， PD20090002， PD20140874）已登记用于防治作物青枯病或小麦全蚀病。源自M18菌株的申嗪霉素原药已登记用于防治烟草黑胫病Phytophthora parasitica var. nicotianae [40]。美国西北农产品公司的荧光假单胞菌D7菌株能抑制雀麦草Bromus japonicus Thunb. ex Murr.、节节麦Aegilops tauschii Coss.等杂草，可用于大田或草坪种子生产中。生防菌的有效成分为活体，加工比化学药剂更为复杂。研究表明，加工成微生物松脂基植物油悬浮剂，较粉剂更稳定，生防效果更持久[41]。
荧光假单胞菌对植物病毒的抑制作用主要是促生防病，其在植物根部定殖，产生植物保护素、木质素和糖蛋白，诱导与抗性相关的水解酶和氧化酶类，促进作物生长并提高抗性[42-44]。此外，其还能利用难溶性磷酸盐，通过解磷作用，提高肥料利用效率，增加植株体磷含量，促进植物根系发育，从而抑制根际土壤病原菌[45-46]。磷的主要作用是提高作物的抗旱和抗寒能力，促进根系生长发育，增强植物抗性。土壤碱性磷酸酶可催化有机磷化合物水解为无机磷，是土壤内源无机磷的主要来源和磷素循环的重要环节。
本研究的荧光假单胞菌CZ菌株能产生活性代谢物碱性磷酸酶（AKP）钝化病毒和提高植株抗性[31]。CRISPR/Cas是一种高效、简便的基因编辑技术[47]，利用这一系统构建基因敲除载体，在电转后未能筛选到AKP基因突变菌株，尚不能确认AKP在菌株抗病毒活性中的分量。开发应用中，考虑使用活菌制剂。
荧光假单胞菌除了分泌胞外蛋白抑制植物病毒外，还能促进烟株生长和提高抗性。菌株在作物根际或叶表面的定殖能力是其发挥拮抗促生作用的关键，构建绿色荧光标记菌株或筛选抗生素抗性标记菌株是研究根际促生菌定殖规律的有效途径。张亮等构建绿色荧光蛋白的表达质粒，通过电转法获得带GFP标记的荧光假单胞菌PEF-5#18，制成生防菌泥炭后施入番茄根际，观察到菌株能在根表、根内及茎内定殖，有效控制尖孢镰刀菌引起的番茄枯萎病并增加植株鲜、干重[9]。本文通过抗生素逐级诱导法筛选到能在含利福平培养基上生长的标记型菌株。在温室盆栽试验中，标记型与野生型菌株的發酵上清和粗蛋白液均能有效抑制TMV初侵染（图1、表1），且菌株能在烟草根际有效定殖并促进植株生长。叶面中的定殖菌量明显少于根际土壤中，说明根际环境更利于菌株的定殖。与喷施培养基对照相比，叶面喷施菌液后1 d，对TMV的预防效果为45.85%（图4），之后定殖菌量较低，失去对TMV的预防效果。推测CZ抑制TMV的主要机制是形成生物膜，阻碍病毒侵染。形成生物膜是细菌定殖的一个重要策略，在作物根表形成的微菌落是生物膜形成的一种形式。例如非黏液型野生型P.fluorescens CHA0只有少许菌落可以黏附到根表，而突变的黏液型菌株CHA211和CHA213M在植物根表能形成密集的菌落层，在土壤中的生存能力也增强[48-49]。
田间试验采用菌株发酵稀释液（106～108 cfu/g）喷淋处理烟株，末次药后7 d对病毒病的防效为62.76%，高于对照药剂;药后21 d的防效为42.02%，与对照药剂相当（表2）。说明在发病前或初期，喷淋生防菌能有效抑制病毒的初侵染，可以开发为防治病毒病的生物制剂。适当浓度的CZ发酵上清能促进种子萌芽和幼苗生长，浸种包衣处理不影响萌芽（图5、图6）。
综上所述，根际促生细菌P.fluorescens CZ能在烟草根际有效定殖，促进作物生长和预防病毒侵染，可进行菌剂工艺研究。
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（责任编辑：田 喆）
關键词 植物根际促生细菌; 荧光假单胞菌; 定殖; 促生
中图分类号： S 435.72
文献标识码： A
DOI： 10.16688/j.zwbh.2019501
Abstract Pseudomonas fluorescens CZ can secrete antiviral proteins including alkaline phosphatase to inhibit the infection of Tobacco mosaic virus （TMV）. The resistant strain named CZ-rif was obtained by inducible screening and culture with antibiotic rifampicin. Both wild type and resistant strain could produce antiviral proteins to remarkably inactivate TMV in vitro with an efficiency of above 90%， showing no significant difference. In colonization experiments by planting tobacco in sterilized or unsterilized soil mixed with CZ-rif bacteria， the population of colonizing bacteria in rhizosphere soil was checked by using the colony-counting method on plates with antibiotics. The results showed that CZ-rif could colonize the tobacco-planted soil. The population in unsterilized soil was 4.3×104 cfu/g， higher than that in sterilized soil （6×103 cfu/g） at 31 d. The population on the tobacco phylloplane was lower than that in the soil. Spraying bacteria could suppress TMV-GFP infection by 45.85% at 24 h. In field experiments by showering with bacteria fermentation， CZ had an inhibition effect of 42.02% against plant viruses. Furthermore， in water planting experiments， CZ fermentation broth could promote tobacco plant growth. In conclusion， P.fluorescens CZ could colonize the tobacco rhizosphere to promote plant growth， and inactivate TMV to suppress virus initial infection， showing the potential as a biological agent.
Key words plant growth-promoting rhizobacteria （PGPR）; Pseudomonas fluorescens; colonization; growth-promoting
1989年-1991年第一次烟草侵染性病害调查指出，我国烟草上发生的病毒病害有16种[1]，2010年-2014年第二次侵染性病害调查时，病毒病种类上升至25种[2]。病毒病已成为烟草上的毁灭性病害，常年高频发生，造成严重的经济损失。目前登记在烟草上的抗病毒剂有盐酸吗啉胍、混合脂肪酸、氯溴异氰尿酸、甾烯醇、宁南霉素、嘧肽霉素、氨基寡糖素、香菇多糖、壳寡糖、超敏蛋白、寡糖·链蛋白。近年来，α-氨基膦酸酯化合物毒氟磷以及噻二唑类杂环化合物甲噻诱胺获得农药登记，用于防治植物病毒病[3]。
抗病毒剂的作用机制主要有三种：1）通过钝化病毒和封闭侵染位点来抑制病毒的初侵染;2）通过干扰病毒蛋白的合成和病毒粒子装配来抑制病毒增殖和扩散;3）通过提高寄主防御酶活性和激活抗性相关基因的表达来诱导植物产生系统抗性[4]。但是，由于植物没有完整的免疫系统，且病毒对植物细胞具有绝对寄生性，病毒一旦在植物体内完成侵染，就会迅速扩展，无药根除。对来自真菌、细菌和植物的天然抗病毒活性物质进行鉴定和分离，创制基于天然产物结构的新型抗病毒剂成为研究热点之一[3]。随着环境安全问题日益突显，生物农药及生物防治越来越受重视。 荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens能抑制多种土传病原真菌、卵菌和线虫;还能改善植物营养促进生长，因而广泛应用于生物防治[5-11]。荧光假单胞菌的作用方式有两种：1）定殖于植物根际，在幼根表面形成保护层，降低病原菌侵染机会[12]，同时产生水杨酸、脂多糖、嗜铁素等物质，诱导植物产生系统抗性[13-15];2）产生抗生素、嗜铁素、细胞壁降解酶等拮抗物质，直接抑制根际病原菌的生长[16-19]。
模式菌株CHA0、Pf5、Cab57全基因组测序表明，荧光假单胞菌含有编码典型抗生素的4个基因簇：2，4-二乙酰基藤黄酚（2，4-diacetyl phloroglutinol， Phl）、硝吡咯菌素（pyrrolnitrin， Prn）、藤黄绿脓菌素（pyoluteorin， Plt）、氢化氰（hydrogen cyanide， Hcn）[20-22]。荧光假单胞菌M18菌株中含有1-羧基吩嗪（phenazine-1-carboxylic acid， PCA）和藤黄绿脓菌素两种抗生素合成基因[23-24]。2P24菌株含有抗生素2，4-二乙酰藤黃酚合成基因[25]。FD6菌株中含有硝吡咯菌素、2，4-二乙酰藤黄酚、藤黄绿脓菌素、嗜铁素、氢氰酸和蛋白酶等抗菌物质的合成基因[26-27]。全基因组为有益基因的克隆、功能鉴定提供了依据[28]。
前期研究中，发现荧光假单胞菌CZ菌株能分泌包括碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）在内的抗病毒蛋白抑制烟草花叶病毒Tobacco mosaic virus（TMV）初侵染[29-31]。在大肠杆菌中诱导表达并纯化获得AKP蛋白，生物测定显示该抗病毒蛋白稳定性强，对TMV的LD90为0.285 0 mg/mL。作用机制主要为体外钝化病毒和封闭初侵染点[32]。应用中，是以抗病毒蛋白钝化病毒抑制初侵染，还是以活菌定殖促生防病为宜，尚需验证。
本文通过抗生素利福平诱导筛选培养，获得抗性标记菌株CZ-rif，确认其抗病毒活性后，检测其在烟草叶面和根际土壤中的定殖能力和促生防病效果，以期为种子包衣和菌剂应用提供依据。
1 材料与方法
1.1 供试生防细菌、病毒、烟草品种及侵染性克隆
荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens CZ菌株，烟草花叶病毒Tobacco mosaic virus（TMV），三生NN烟Nicotiana tobacum ‘Samsun NN’、本氏烟N.benthamiana、普通烟‘NC89’ N.tobacum ‘NC89’，TMV-GFP（清华大学刘玉乐教授馈赠）。
1.2 菌株抗药性标记
采用利福平（Rif）进行抗药性标记。将CZ菌株在LA固体培养基上划线活化，挑取单菌落转入含利福平5 μg/mL的LB液体培养基中，于28℃、200 r/min培养16～24 h后，在含利福平5 μg/mL的LA上划线培养，挑取单菌落转入下一个浓度梯度中，依次经过含利福平10、20、40、80、120、160、200 μg/mL的LB中诱导，直至筛选到稳定生长的抗利福平200 μg/mL的突变菌株[33]。与野生型比较，记录突变菌株CZ-rif的培养性状。
1.3 抗病毒物质的提取
将在LB中30℃、150 r/min培养48 h的CZ和CZ-rif菌液，10 000 r/min离心10 min去菌体，为发酵上清。发酵上清于95℃水浴10 min灭活蛋白，为蛋白失活液。4℃条件下，向100 mL发酵上清中缓慢加入硫酸铵（56.1 g）至最终浓度为80%，轻轻搅拌溶解后4℃静置过夜，10 000 r/min离心20 min，得上清与沉淀。上清用截留分子量为500 Da的透析袋透析，冷冻干燥后用10 mL PBS溶解，为去蛋白上清。沉淀用10 mL PBS缓冲液（0.01 mol/L，pH 7.0）溶解后，放入透析袋中透析过夜除去硫酸铵，冷冻干燥后用10 mL PBS溶解，为粗蛋白液[34]。
1.4 抗病毒物质对TMV的抑制效果
取TMV感染的烟草病叶1 g，于液氮中充分研磨，加入40 mL PBS后滤去残渣，为病毒接种液。
将发酵上清、蛋白失活液、去蛋白上清、粗蛋白液分别与等体积病毒接种液混合;以等体积的LB与接种液混合作为发酵上清和蛋白失活液的对照，以等体积的PBS与接种液混合作为去蛋白上清和粗蛋白液的对照。静置15～20 min后，采用半叶法在三生NN烟叶片的左侧摩擦接种抗病毒物质与病毒的混合液，右侧接种相应的对照。每株接种3～4片展开叶，每处理4株重复。接种后喷清水去除石英砂，26℃培养4 d后调查枯斑数，按以下公式计算抑制效果[32]。
抑制率=对照单叶平均枯斑数-处理单叶平均枯斑数对照单叶平均枯斑数×100%。
1.5 抗药性标记菌株在根际土壤和叶面的定殖及对TMV-GFP的防效
取烟田根际土样，进行灭菌和非灭菌处理后，将CZ-rif菌液按1%的比例分别添加到土样中，混匀后装入8 cm小花盆中，植入5叶期烟苗，每处理4盆，置于温室中，隔日浇水。于0、3、10、17、24、31、38、45、52、59 d，称取1 g根际土于20 mL灭菌生理盐水中振荡漂洗30 min，取20～100 μL涂抹于含利福平200 μg/mL的LA平板上，28℃培养16 h后，在菌落计数仪上测定目标菌量，以cfu/g土样表示[35-37]。
将菌液喷洒于盆栽的7叶期本氏烟上（每株10 mL），置于28℃、相对湿度60%～80%的温室中培养，隔日浇水。一部分植株于0、3、8、13、18、23、30 d，剪取5 g叶片于20 mL灭菌生理盐水中振荡漂洗，取100 μL涂抹于含利福平200 μg/mL的LA平板上，28℃培养16 h，以cfu/g鲜叶计数目标菌量。另取部分植株于喷洒菌液后1 d，摩擦接种TMV-GFP病汁液，以喷洒培养基为对照，每处理4株重复，接种后4 d调查侵染斑数目，计算对病毒的预防效果。 1.6 CZ菌液对病毒病的田间预防效果
将CZ菌液用水稀释15倍，菌量為106～108 cfu/g（现配现用），采用喷淋法进行病毒病预防试验。普通烟‘NC89’移栽时第一次施药，间隔7～10 d，再连续喷淋2次。每处理设置4次重复，每重复25株，每株50 mL。以喷施0.5%香菇多糖水剂400倍液、20%盐酸吗啉胍可湿性粉剂600倍液为药剂对照。于末次施药后10、20 d各调查1次病情，每小区调查全部烟株[38]。按下式计算预防效果，对各处理防治效果采用DPS 7.05数据处理系统软件，邓肯氏新复极差法进行方差分析。
病情指数=∑（各级病株数×相应级数）调查总株数×9×100;防治效果=空白对照区病情指数-处理区病情指数处理区病情指数×100%。
1.7 CZ菌株对烟草的促生效果测定
平皿滤纸法萌芽试验：向9 cm的平皿中加入0.3 mL CZ发酵上清和3 mL去离子水，以0.3 mL LB培养基和3 mL去离子水为空白培养基对照，以3.3 mL去离子水为清水对照。混匀后铺一层滤纸，每皿点种100粒，4皿重复，用封口膜封口后，26℃培养9 d，统计发芽率并称量百芽鲜重。CZ发酵上清稀释15倍后浸种48 h，种子包衣时再包裹菌体粉末制备包衣剂，采用平皿滤纸点播法测试发芽率。
水培法促生试验：向盛有550 mL霍格兰氏营养液的培养盒中加入20 mL CZ发酵液，以550 mL霍格兰氏营养液和20 mL LB培养液为LB培养液对照，以570 mL霍格兰培养液为空白对照。取长势一致的四叶期烟草幼苗，洗去根土插入培养孔中，每组8株，3次重复。每日添加去离子水10 mL，26℃培养14 d，观察幼苗根冠生长并称量植株鲜重[39]。
2 结果与分析
2.1 抗药性标记菌株CZ-rif的性状及对TMV的抑制活性
野生型菌株经Rif抗性诱导后，获得稳定的抗性标记菌株CZ-rif，其在平板和斜面上的生长性状与野生型无显著差异。提取发酵产物，利用半叶法测定对TMV的抑制效果，如表1所示，CZ的发酵上清、去蛋白上清、粗蛋白液、蛋白失活液对TMV的抑制率分别为96.13%、0%、91.76%、28.96%。CZ-rif的抑制效果分别为96.91%、0%、10000%、66.67%，显示二者的发酵上清、粗蛋白液均有良好的钝化作用，利福平抗性筛选不影响菌株的抗TMV活性。此外，菌株的蛋白失活液仍有一定的抑制效果，说明起抗病毒作用的除了大分子蛋白类，还包括非蛋白类物质。试验效果如图1所示。
2.2 CZ-rif菌株在烟草根际土壤和叶面中的定殖及对TMV-GFP的防效
由图2结果可知，CZ-rif在非灭菌土中0～3 d内由4.72×106 cfu/g急剧下降至1.916×106 cfu/g，降幅达59.41%，这可能与非灭菌土中微生物种群复杂且互相制约有关。第31天之后种群趋于稳定，定殖菌量为6×103 cfu/g土样。而在灭菌土中，0～3 d内由9.04×106 cfu/g上升至2.76×107 cfu/g，升幅达205.31%，可能是没有土著微生物竞争，种群有一个上升的过程。但随后菌量下降，第17天下降至1.952×106 cfu/g，第31天有一个小高峰;之后种群趋于稳定，定殖菌量为4.3×104 cfu/g，菌量水平明显高于非灭菌土中的菌量。
由图3结果可知，喷施菌液后0～30 d，菌株在烟草叶片上种群动态呈下降趋势。0 d的菌量为3.025×107 cfu/g，第3天急剧下降至3.225×106 cfu/g，降幅达89.34%，第13天下降至3.48×105 cfu/g，随后趋于平稳，第30天的定殖数量为2×103 cfu/g鲜叶。前期菌量急剧下降可能与淋溶浇水有关，也说明菌株在叶面不易定殖。
2.3 生防菌培养液对烟草病毒病的田间预防效果
普通烟NC89自移栽时采用CZ培养稀释液喷淋预防病毒病，以喷施0.5%香菇多糖水剂400倍液和20%盐酸吗啉胍可湿性粉剂600倍液为对照，结果见表2。末次药后7 d调查结果显示：CZ处理的发病率16.00%、病情指数2.89，显著低于清水对照的发病率31.33%和病情指数7.76，防治效果为62.76%，高于对照药剂。末次药后21 d调查结果显示：各处理发病率均明显上升，CZ处理的发病率8682%、病情指数27.68，显著低于清水对照的发病率98.00%和病情指数47.74，防治效果为4202%，与对照药剂处理的防效相当。上述试验结果说明：喷淋生防菌培养液对烟草病毒病有较好的预防效果。
2.4 菌株对烟草幼苗生长的促进作用
由平皿滤纸法萌芽试验看出，LB培养基、清水对照和CZ发酵上清3种处理的种子发芽率均为100%，但CZ处理（发酵上清与清水1∶10混合）中种子萌芽更健壮;第9天时，CZ处理百芽鲜重为0.15 g，略高于LB培养基对照（0.09 g）和清水对照处理（0.10 g）（图5），显示CZ对幼苗生长有一定的促进作用。
试验中还观察到CZ发酵上清或LB培养基与清水1∶1混合处理时，种子不萌发;1∶5混合处理时，种子发芽率100%，发芽势与对照相比无显著差异，这说明高浓度的发酵上清对种子萌芽有抑制作用，适当浓度才会促进种子萌发。在种子包衣中，进行生防菌发酵上清浸种及包裹菌体粉末处理，其发芽率与常规包衣种子无显著差异。
烟草幼苗在添加CZ发酵液的培养液中培养14 d时，幼苗的茎叶生长和根系发育均优于LB培养基和空白对照处理（图6）。CZ处理的幼苗其根系发育粗短健壮、侧根较多，单株平均鲜重（2.12 g）明显高于LB培养基（1.13 g）和清水对照处理（0.85 g），说明CZ有促进幼苗生长的作用。
3 结论与讨论 荧光假单胞菌是一类对多种病、虫、草害具广谱性抑制作用的有益微生物，广泛应用于生物防治。目前，荧光假单胞菌活芽孢制剂（PD20151707， PD20090002， PD20140874）已登记用于防治作物青枯病或小麦全蚀病。源自M18菌株的申嗪霉素原药已登记用于防治烟草黑胫病Phytophthora parasitica var. nicotianae [40]。美国西北农产品公司的荧光假单胞菌D7菌株能抑制雀麦草Bromus japonicus Thunb. ex Murr.、节节麦Aegilops tauschii Coss.等杂草，可用于大田或草坪种子生产中。生防菌的有效成分为活体，加工比化学药剂更为复杂。研究表明，加工成微生物松脂基植物油悬浮剂，较粉剂更稳定，生防效果更持久[41]。
荧光假单胞菌对植物病毒的抑制作用主要是促生防病，其在植物根部定殖，产生植物保护素、木质素和糖蛋白，诱导与抗性相关的水解酶和氧化酶类，促进作物生长并提高抗性[42-44]。此外，其还能利用难溶性磷酸盐，通过解磷作用，提高肥料利用效率，增加植株体磷含量，促进植物根系发育，从而抑制根际土壤病原菌[45-46]。磷的主要作用是提高作物的抗旱和抗寒能力，促进根系生长发育，增强植物抗性。土壤碱性磷酸酶可催化有机磷化合物水解为无机磷，是土壤内源无机磷的主要来源和磷素循环的重要环节。
本研究的荧光假单胞菌CZ菌株能产生活性代谢物碱性磷酸酶（AKP）钝化病毒和提高植株抗性[31]。CRISPR/Cas是一种高效、简便的基因编辑技术[47]，利用这一系统构建基因敲除载体，在电转后未能筛选到AKP基因突变菌株，尚不能确认AKP在菌株抗病毒活性中的分量。开发应用中，考虑使用活菌制剂。
荧光假单胞菌除了分泌胞外蛋白抑制植物病毒外，还能促进烟株生长和提高抗性。菌株在作物根际或叶表面的定殖能力是其发挥拮抗促生作用的关键，构建绿色荧光标记菌株或筛选抗生素抗性标记菌株是研究根际促生菌定殖规律的有效途径。张亮等构建绿色荧光蛋白的表达质粒，通过电转法获得带GFP标记的荧光假单胞菌PEF-5#18，制成生防菌泥炭后施入番茄根际，观察到菌株能在根表、根内及茎内定殖，有效控制尖孢镰刀菌引起的番茄枯萎病并增加植株鲜、干重[9]。本文通过抗生素逐级诱导法筛选到能在含利福平培养基上生长的标记型菌株。在温室盆栽试验中，标记型与野生型菌株的發酵上清和粗蛋白液均能有效抑制TMV初侵染（图1、表1），且菌株能在烟草根际有效定殖并促进植株生长。叶面中的定殖菌量明显少于根际土壤中，说明根际环境更利于菌株的定殖。与喷施培养基对照相比，叶面喷施菌液后1 d，对TMV的预防效果为45.85%（图4），之后定殖菌量较低，失去对TMV的预防效果。推测CZ抑制TMV的主要机制是形成生物膜，阻碍病毒侵染。形成生物膜是细菌定殖的一个重要策略，在作物根表形成的微菌落是生物膜形成的一种形式。例如非黏液型野生型P.fluorescens CHA0只有少许菌落可以黏附到根表，而突变的黏液型菌株CHA211和CHA213M在植物根表能形成密集的菌落层，在土壤中的生存能力也增强[48-49]。
田间试验采用菌株发酵稀释液（106～108 cfu/g）喷淋处理烟株，末次药后7 d对病毒病的防效为62.76%，高于对照药剂;药后21 d的防效为42.02%，与对照药剂相当（表2）。说明在发病前或初期，喷淋生防菌能有效抑制病毒的初侵染，可以开发为防治病毒病的生物制剂。适当浓度的CZ发酵上清能促进种子萌芽和幼苗生长，浸种包衣处理不影响萌芽（图5、图6）。
综上所述，根际促生细菌P.fluorescens CZ能在烟草根际有效定殖，促进作物生长和预防病毒侵染，可进行菌剂工艺研究。
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（责任编辑：田 喆）