【摘 要】
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目的 研究HCV全长(天然)核心蛋白(C蛋白)和成熟C蛋白在HepG2细胞内的亚细胞定位,为进一步研究C蛋白与宿主细胞蛋白因子相互作用提供实验依据.方法 设计HCV全长和成熟核心基因
【机 构】
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第四军医大学,唐都医院胸外科,陕西,西安,710038第四军医大学,病理学教研室,陕西,西安,710038;
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目的 研究HCV全长(天然)核心蛋白(C蛋白)和成熟C蛋白在HepG2细胞内的亚细胞定位,为进一步研究C蛋白与宿主细胞蛋白因子相互作用提供实验依据.方法 设计HCV全长和成熟核心基因引物,以pBRTM/HCV1-3011为真核表达载体为模版行PCR;将PCR扩增产物酶切纯化后定向插入pEGFP-C1的BeglⅡ和EcoR Ⅰ位点,得到能表达全长HCV核心蛋白(C191 aa.)和成熟核心蛋白(C173 aa.)的真核表达载体pEGFP-C1-C191、pEGFP-C1-C173;将扩增pEGFP-C1-C191、pEGFP-C1-C173质粒转染到HepG2细胞中,28 h、5 d在荧光显微镜下观察两种C蛋白的亚细胞定位.5 d后再用免疫细胞化学法观察两种C蛋白在HepG2细胞中着色现象.结果 HCV核心基因PCR产物和构建的pEGFP-C1-C191、pEGFP-C1-C173经扩增测序证实.pEGDP-C1-C191转染HepG2细胞28 h后融合荧光全长C蛋白C191主要出现在核膜和胞质中,少部分出现在胞核及其膜中;而pEGDP-C1-C173转染HepG2细胞28 h后主要定位在核中和核膜上.但pEGDP-C1-C191转染HepG2细胞5 d后,其表达的融合荧光蛋白主要出现在核内和核膜上,少量在胞质中;而成熟C蛋白C173则仍然在胞核内及核膜上.pEGDP-C1-C转染HepG2细胞5 d后进行免疫细胞化学显示,C191蛋白和C173蛋白主要在核中、核膜着色,胞质有少量着色.结论 HCV全长C蛋白的亚细胞定位是一动态过程,先出现在胞质中和核膜上,最后定位在核中和核膜上;成熟C蛋白主要定位在核中和核膜上.这种现象为解释瞬时转染HCV不同长度C基因对p53/p21通路作用出现相反结果奠定基础.
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