目的:建立针对西尼罗病毒(West Nile virus,WNV)、委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equine encephalomy-elitis virus,VEEV)和亨德拉病毒(Hendra virus,HeV)的多重RT-PCR检测方法。方法:分别针对WNV的NS1基因、VEE的NSP2基因和HeV的G基因设计3对引物,建立了同时检测WNV,VEEV和HeV的多重RT-PCR方法。以不同滴度的病毒评估该检测方法的敏感性,同时以中国地区流行的与脑炎相关的黄病毒属和甲病毒属成员为模板验证该检测方法的特异性。结果与结论:所建立的3种病毒的多重RT-PCR方法可同时或分别特异扩增WNV,VEEV和HeV的454 bp,541 bp和723 bp基因片段,敏感度分别达到10 PFU/ml,100 PFU/ml和100 fg/ml;而对中国流行的与脑炎相关黄病毒和甲病毒如日本脑炎病毒、森林脑炎病毒、黄热病毒、登革病毒、东部马脑炎病毒和西部马脑炎病毒的扩增均为阴性。结果表明所建立的多重RT-PCR敏感性和特异性良好,可用于3种脑炎病毒的快速鉴定和甄别。