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摘要SSR是建立在PCR基础上的分子标记，具有多态性高、重复性好、共显性、操作简单等优点，已在棉花研究中被广泛应用。综述了SSR标记的原理与特点，以及其在棉花遗传图谱构建、功能基因及QTLs定位分析、标记辅助育种、种质鉴定及遗传多样性分析等方面的应用；展望了SSR分子标记技术广阔的应用前景。
关键词SSR；棉花；遗传育种
中图分类号 S562.032 文献标识码A文章编号 1007-5739（2009）04-0160-01
SSR（Simple Sequence Repeats）标记即微卫星标记，是由1~6个核苷酸为单位串联重复而成，长度一般在200bp以下，两端为较保守的单拷贝序列。通过重复次数不同及重复程度不完全相同而呈现多态性，呈孟德尔式遗传，共显性。SSR标记广泛存在于基因组的不同位置，根据两侧相对保守的单拷贝序列设计引物，进行PCR扩增，经电泳、显色，便能测出不同个体在某个SSR位点上的多态性，在此基础上进行相应的分析。棉花基因组中存在丰富的SSR标记，而且分布均匀，检测出的多态性频率较高，已广泛应用于遗传图谱构建、遗传多样性分析、种质鉴定、分子标记辅助选择等方面的研究。
1SSR的基本原理及特点
微卫星DNA由两部分组成，即核心序列和两翼的序列，核心序列即前面所称“重复”的短序列，两侧一般是相对保守的单拷贝序列。在PCR基础上的SSR分析是根据微卫星DNA两翼区域的序列设计位点专一的引物，以总基因组为模板进行PCR扩增，扩增产物经变性聚丙烯酰胺凝胶分离，用放射自显影、银染或荧光进行检测。这种序列广泛分布于真核生物基因组，其重复次数的不同就产生了等位基因之间的多态性。由于SSR两端多为相对保守的单拷贝序列，通过设计引物便可以PCR扩增，进行多态性检测。
与其他分子标记相比，SSR有以下优点：①共显性遗传，不易被自然选择和人工选择所淘汰，符合孟德尔遗传定律[1，2]；②多态性高，可通过PCR扩增呈现出来，试验程序简单，重复性高；③SSR序列的两侧序列较保守，在等位基因中多相同，便于重复利用已知引物；④易于检测、重复性好、可进行自动化分析，1个位点一般可在24h内完成，且可同时进行多位点的检测；⑤对DNA质量和数量的要求不高，仅需微量组织便能有效的分析鉴定。尽管微卫星作为分子标记有许多优点，但同样存在不足之处，其中一个最大的麻烦就是必须预先知道试验材料的基因组信息，至少必须知道重复序列两翼的序列信息，才能设计出适宜的引物，这大大地限制了它的应用。
2SSR标记在棉花遗传育种中的应用
2.1SSR标记在棉花遗传图谱构建中的应用
遗传图谱（Genetic map）是通过遗传重组交换结果进行连锁分析所得到的基因在染色体上相对位置的排列图，是植物遗传育种及分子克隆等应用研究的理论依据和基础。而SSR作为一种新型分子标记技术，由于其丰富的多态性信息含量，被广泛的应用于棉花遗传图谱的构建。2008年陈利等[3]利用3 458对SSR引物筛选陆地棉中棉所35和渝棉1号间的多态性引物，获得了173对，以多态性引物检测两者杂交的F2群体180个单株的标记基因型，共获得178个标记位点。构建的遗传连锁图谱包括148个标记，36个连锁群，总长1 309.2cm，标记间平均距离8.8cm，覆盖了棉花基因组的29.5%。李朋波等[4]利用70个SSR标记和15个AFLP标记构建了总长为814cm的遗传图谱，覆盖棉花基因组的18.3%。与AFLP标记相比，SSR标记通常只扩增1个基因座位，有利于遗传图谱之间的比较，这对于确定连锁群所属的染色体及QTL具有比较重要的意义。
2.2SSR标记在棉花功能基因及QTLs定位分析中的应用
QTLs定位是阐明控制有关数量性状的主要基因数目，这些基因在染色体上的位置，以及其联合效应的遗传图。高密度SSR连锁图的构建为基因或QTL定位奠定了基础。利用SSR标记技术对棉花遗传育种进行研究的一个重要方面就是QTLs定位。利用SSR标记技术，可使棉花育种表型选择逐步过渡到基因型选择，进一步利用QTLs定位的成果进行标记辅助选择，大大提高育种的效率。杨昶等[5]用5 300对SSR引物筛选亲本多态，获得了115个多态位点并进行标记间连锁分析，构建了一张包括20个连锁群全长560.1cm的陆地棉品种间分子标记遗传图谱。用复合区间作图法进行QTL定位，在苗期检测到了3个抗病QTL，成株期检测到9个与纤维品质相关性状的QTL及11个产量构成因素的QTL，为棉花抗病育种同时兼顾产量和品质育种提供了非常有用的信息。胡文静等[6]用陆地棉优质品系7235、渝棉1号做亲本，以7235×渝棉1号的F2与F2：3分离群体为材料，从5514对SSR引物中筛选到117个多态性标记，并用其中80个标记构建了总长为1 147.8cm的遗传图谱；应用复合区间作图分析了该组合的F2单株和F2：3家系纤维品质性状，共检测到36个纤维品质QTL。
2.3SSR标记在棉花标记辅助育种中的应用
分子标记辅助育种（molecular marker-assisted selection MAS）是现代分子生物学与传统遗传育种相结合，借助分子标记对育种材料从DNA水平上进行选择，从而达到作物产量、品质和抗性等综合性状的高效改良[7]。它是通过分析与目标基因紧密连锁的分子标记来判断目标基因是否存在[8]。与传统的表型性状选择相比，标记辅助育种具有标记基因型鉴定可以在低世代和植株生长的任何阶段进行、共显性的分子标记允许在杂合体阶段鉴定隐性基因、对目的基因的选择不受基因表达和环境条件的影响等优点。应用标记辅助育种，理论上只要回交3代就可以选到理想的材料。因此，可以加快育种速度，提高选择效率，特别是对多基因位点控制的许多重要农艺性状的准确选择很有利，同时对于开发高新产品具有重要意义。石玉真等[9]用一个已定位的高强纤维QTL紧密连锁的2个SSR标记，在2套杂交组合的不同世代群体中进行分析研究，成功培育出9个纤维优质的株系。
2.4SSR标记在棉花种质鉴定及遗传多样性分析中的应用
遗传多样性是指生物种内不同群体之间或群体内不同个体间遗传变异的总和，它是生物多样性的基础和重要组成部分[10]。不同基因型的种质材料或棉花品种中存在简单重复核苷酸序列差异，应用同一个SSR引物进行PCR扩增时，由于引物互补的模板DNA数目和位点不同，所扩增条带的数目和片断大小就存在差异，从而呈现出多态性。武耀廷等[11]对36份陆地棉栽培品种SSR遗传多样性研究表明，分子标记确定的遗传关系基本上与品种系谱的种质系统一致，但并不能按系谱或种植生态区简单的确定品种的归属。庞朝友等[12]利用37对多态性SSR引物和15个表型性状对155份棉属种间杂交基因渐渗系及其10份陆地棉亲本进行了聚类分析，SSR聚类结果与种质材料的系谱来源基本吻合，而表型性状聚类结果与材料系谱来源相差悬殊。因此，综合利用SSR、表型性状聚类结果将促进棉属种间杂交基因渐渗材料的高效利用。朱四元等[13]利用22对多态SSR引物对14份不同类型的抗虫棉花材料进行扩增，运用Jaccard遗传相似系数计算14个品种间的遗传距离为0.035~1.056，聚类分析表明14份棉花品种可分为2大类4亚类，揭示了大多数品种的遗传基础比较狭窄。陈光等[14]利用24对扩增效果好的引物对53个海岛棉种质资源进行遗传多样性的检测分析，共检测出多态性等位基因变异97个，占总数的91.5%，采用UPGMA法对所选材料进行聚类分析表明，53个品种被分为2大类，与系谱来源一致，这证明了SSR分子标记在鉴别品种和品种遗传多样性研究方面具有重要的作用。
3展望
与其他分子标记技术相比，SSR分子标记技术是一种较为快捷、简单、稳定的遗传标记。在未来的发展中，相信随着大量可利用的微卫星序列的开发，其在棉花遗传育种中的应用前景会更加广阔。
4参考文献
[1] DAVID N S，MICHAEL E D.Occurrence and inheritance of micros-atellites in Pinus radiate[J].Genome，1994（37）：977-983.
[2] DEVEY M E，BELL J C，SMITH D N，et al.A genetic map for Pinus radiata based on RFLP，RAPD and microsatellite markers[J].Theor Appl Genet，1996（92）：673-679.
[3] 陈利，张正圣，胡美纯，等.陆地棉遗传图谱构建及产量和纤维品质性状QTL定位[J].作物学报，2008，34（7）：1199-1205.
[4] 李朋波，曹美莲，刘惠民，等.陆地棉遗传图谱构建与纤维品质性状QTL定位[J].西北植物学报，2006，26（6）：1098-1104.
[5] 杨昶，郭旺珍，张天真.陆地棉抗黄萎病、纤维品质和产量等农艺性状的QTL定位[J].分子植物育种，2007，5（6）：797-805.
[6] 胡文静，张晓阳，张天真，等.陆地棉优质纤维QTL的分子标记筛选及优质来源分析[J].作物学报，2008，34（4）：578-586.
[7] 袁昭岚，沈颂东，黄鹤忠，等.SSR和ISSR分子标记技术及其在遗传多态性方面的应用[J].水产养殖，2005，26（2）：10-13.
[8] 赵卫国，苗雪霞，潘一乐，等.SSR和ISSR分子标记及其在桑树遗传育种研究中的应用前景[J].江苏农业，2006，28（4）：l-5.
[9] 石玉真，刘爱英，李俊文，等.与棉花纤维强度连锁的主效QTL应用于棉花分子标记辅助育种[J].分子植物育种，2007，5（4）：521-527.
[10] 李永强，李宏伟，高丽锋，等.基于表达序列标签的微卫星标记（EST-SSRs）研究进展[J].植物遗传资源学报，2004，5（1）：91-95.
[11] 武耀廷，张天真，殷剑美.利用分子标记和形态学性状检测的陆地棉栽培品种遗传多样性[J].遗传学报，2001，28（11）：1040-1050.
[12] 庞朝友，杜雄明，马峙英.棉属种间杂交基因渐渗系SSR标记及其表型性状的聚类分析[J].作物学报，2006，32（9）：1371-1378.
[13] 朱四元，陈金湘，刘爱玉，等.利用SSR标记对不同类型抗虫棉品种的遗传多样性分析[J].湖南农业大学学报（自然科学版），2006，32（5）：469-472.
[14] 陈光，杜雄明，卢东柏，等.利用SSR分子标记进行海岛棉遗传多样性研究[J].植物遗传资源学报，2005，6（2）：135-139.
关键词SSR；棉花；遗传育种
中图分类号 S562.032 文献标识码A文章编号 1007-5739（2009）04-0160-01
SSR（Simple Sequence Repeats）标记即微卫星标记，是由1~6个核苷酸为单位串联重复而成，长度一般在200bp以下，两端为较保守的单拷贝序列。通过重复次数不同及重复程度不完全相同而呈现多态性，呈孟德尔式遗传，共显性。SSR标记广泛存在于基因组的不同位置，根据两侧相对保守的单拷贝序列设计引物，进行PCR扩增，经电泳、显色，便能测出不同个体在某个SSR位点上的多态性，在此基础上进行相应的分析。棉花基因组中存在丰富的SSR标记，而且分布均匀，检测出的多态性频率较高，已广泛应用于遗传图谱构建、遗传多样性分析、种质鉴定、分子标记辅助选择等方面的研究。
1SSR的基本原理及特点
微卫星DNA由两部分组成，即核心序列和两翼的序列，核心序列即前面所称“重复”的短序列，两侧一般是相对保守的单拷贝序列。在PCR基础上的SSR分析是根据微卫星DNA两翼区域的序列设计位点专一的引物，以总基因组为模板进行PCR扩增，扩增产物经变性聚丙烯酰胺凝胶分离，用放射自显影、银染或荧光进行检测。这种序列广泛分布于真核生物基因组，其重复次数的不同就产生了等位基因之间的多态性。由于SSR两端多为相对保守的单拷贝序列，通过设计引物便可以PCR扩增，进行多态性检测。
与其他分子标记相比，SSR有以下优点：①共显性遗传，不易被自然选择和人工选择所淘汰，符合孟德尔遗传定律[1，2]；②多态性高，可通过PCR扩增呈现出来，试验程序简单，重复性高；③SSR序列的两侧序列较保守，在等位基因中多相同，便于重复利用已知引物；④易于检测、重复性好、可进行自动化分析，1个位点一般可在24h内完成，且可同时进行多位点的检测；⑤对DNA质量和数量的要求不高，仅需微量组织便能有效的分析鉴定。尽管微卫星作为分子标记有许多优点，但同样存在不足之处，其中一个最大的麻烦就是必须预先知道试验材料的基因组信息，至少必须知道重复序列两翼的序列信息，才能设计出适宜的引物，这大大地限制了它的应用。
2SSR标记在棉花遗传育种中的应用
2.1SSR标记在棉花遗传图谱构建中的应用
遗传图谱（Genetic map）是通过遗传重组交换结果进行连锁分析所得到的基因在染色体上相对位置的排列图，是植物遗传育种及分子克隆等应用研究的理论依据和基础。而SSR作为一种新型分子标记技术，由于其丰富的多态性信息含量，被广泛的应用于棉花遗传图谱的构建。2008年陈利等[3]利用3 458对SSR引物筛选陆地棉中棉所35和渝棉1号间的多态性引物，获得了173对，以多态性引物检测两者杂交的F2群体180个单株的标记基因型，共获得178个标记位点。构建的遗传连锁图谱包括148个标记，36个连锁群，总长1 309.2cm，标记间平均距离8.8cm，覆盖了棉花基因组的29.5%。李朋波等[4]利用70个SSR标记和15个AFLP标记构建了总长为814cm的遗传图谱，覆盖棉花基因组的18.3%。与AFLP标记相比，SSR标记通常只扩增1个基因座位，有利于遗传图谱之间的比较，这对于确定连锁群所属的染色体及QTL具有比较重要的意义。
2.2SSR标记在棉花功能基因及QTLs定位分析中的应用
QTLs定位是阐明控制有关数量性状的主要基因数目，这些基因在染色体上的位置，以及其联合效应的遗传图。高密度SSR连锁图的构建为基因或QTL定位奠定了基础。利用SSR标记技术对棉花遗传育种进行研究的一个重要方面就是QTLs定位。利用SSR标记技术，可使棉花育种表型选择逐步过渡到基因型选择，进一步利用QTLs定位的成果进行标记辅助选择，大大提高育种的效率。杨昶等[5]用5 300对SSR引物筛选亲本多态，获得了115个多态位点并进行标记间连锁分析，构建了一张包括20个连锁群全长560.1cm的陆地棉品种间分子标记遗传图谱。用复合区间作图法进行QTL定位，在苗期检测到了3个抗病QTL，成株期检测到9个与纤维品质相关性状的QTL及11个产量构成因素的QTL，为棉花抗病育种同时兼顾产量和品质育种提供了非常有用的信息。胡文静等[6]用陆地棉优质品系7235、渝棉1号做亲本，以7235×渝棉1号的F2与F2：3分离群体为材料，从5514对SSR引物中筛选到117个多态性标记，并用其中80个标记构建了总长为1 147.8cm的遗传图谱；应用复合区间作图分析了该组合的F2单株和F2：3家系纤维品质性状，共检测到36个纤维品质QTL。
2.3SSR标记在棉花标记辅助育种中的应用
分子标记辅助育种（molecular marker-assisted selection MAS）是现代分子生物学与传统遗传育种相结合，借助分子标记对育种材料从DNA水平上进行选择，从而达到作物产量、品质和抗性等综合性状的高效改良[7]。它是通过分析与目标基因紧密连锁的分子标记来判断目标基因是否存在[8]。与传统的表型性状选择相比，标记辅助育种具有标记基因型鉴定可以在低世代和植株生长的任何阶段进行、共显性的分子标记允许在杂合体阶段鉴定隐性基因、对目的基因的选择不受基因表达和环境条件的影响等优点。应用标记辅助育种，理论上只要回交3代就可以选到理想的材料。因此，可以加快育种速度，提高选择效率，特别是对多基因位点控制的许多重要农艺性状的准确选择很有利，同时对于开发高新产品具有重要意义。石玉真等[9]用一个已定位的高强纤维QTL紧密连锁的2个SSR标记，在2套杂交组合的不同世代群体中进行分析研究，成功培育出9个纤维优质的株系。
2.4SSR标记在棉花种质鉴定及遗传多样性分析中的应用
遗传多样性是指生物种内不同群体之间或群体内不同个体间遗传变异的总和，它是生物多样性的基础和重要组成部分[10]。不同基因型的种质材料或棉花品种中存在简单重复核苷酸序列差异，应用同一个SSR引物进行PCR扩增时，由于引物互补的模板DNA数目和位点不同，所扩增条带的数目和片断大小就存在差异，从而呈现出多态性。武耀廷等[11]对36份陆地棉栽培品种SSR遗传多样性研究表明，分子标记确定的遗传关系基本上与品种系谱的种质系统一致，但并不能按系谱或种植生态区简单的确定品种的归属。庞朝友等[12]利用37对多态性SSR引物和15个表型性状对155份棉属种间杂交基因渐渗系及其10份陆地棉亲本进行了聚类分析，SSR聚类结果与种质材料的系谱来源基本吻合，而表型性状聚类结果与材料系谱来源相差悬殊。因此，综合利用SSR、表型性状聚类结果将促进棉属种间杂交基因渐渗材料的高效利用。朱四元等[13]利用22对多态SSR引物对14份不同类型的抗虫棉花材料进行扩增，运用Jaccard遗传相似系数计算14个品种间的遗传距离为0.035~1.056，聚类分析表明14份棉花品种可分为2大类4亚类，揭示了大多数品种的遗传基础比较狭窄。陈光等[14]利用24对扩增效果好的引物对53个海岛棉种质资源进行遗传多样性的检测分析，共检测出多态性等位基因变异97个，占总数的91.5%，采用UPGMA法对所选材料进行聚类分析表明，53个品种被分为2大类，与系谱来源一致，这证明了SSR分子标记在鉴别品种和品种遗传多样性研究方面具有重要的作用。
3展望
与其他分子标记技术相比，SSR分子标记技术是一种较为快捷、简单、稳定的遗传标记。在未来的发展中，相信随着大量可利用的微卫星序列的开发，其在棉花遗传育种中的应用前景会更加广阔。
4参考文献
[1] DAVID N S，MICHAEL E D.Occurrence and inheritance of micros-atellites in Pinus radiate[J].Genome，1994（37）：977-983.
[2] DEVEY M E，BELL J C，SMITH D N，et al.A genetic map for Pinus radiata based on RFLP，RAPD and microsatellite markers[J].Theor Appl Genet，1996（92）：673-679.
[3] 陈利，张正圣，胡美纯，等.陆地棉遗传图谱构建及产量和纤维品质性状QTL定位[J].作物学报，2008，34（7）：1199-1205.
[4] 李朋波，曹美莲，刘惠民，等.陆地棉遗传图谱构建与纤维品质性状QTL定位[J].西北植物学报，2006，26（6）：1098-1104.
[5] 杨昶，郭旺珍，张天真.陆地棉抗黄萎病、纤维品质和产量等农艺性状的QTL定位[J].分子植物育种，2007，5（6）：797-805.
[6] 胡文静，张晓阳，张天真，等.陆地棉优质纤维QTL的分子标记筛选及优质来源分析[J].作物学报，2008，34（4）：578-586.
[7] 袁昭岚，沈颂东，黄鹤忠，等.SSR和ISSR分子标记技术及其在遗传多态性方面的应用[J].水产养殖，2005，26（2）：10-13.
[8] 赵卫国，苗雪霞，潘一乐，等.SSR和ISSR分子标记及其在桑树遗传育种研究中的应用前景[J].江苏农业，2006，28（4）：l-5.
[9] 石玉真，刘爱英，李俊文，等.与棉花纤维强度连锁的主效QTL应用于棉花分子标记辅助育种[J].分子植物育种，2007，5（4）：521-527.
[10] 李永强，李宏伟，高丽锋，等.基于表达序列标签的微卫星标记（EST-SSRs）研究进展[J].植物遗传资源学报，2004，5（1）：91-95.
[11] 武耀廷，张天真，殷剑美.利用分子标记和形态学性状检测的陆地棉栽培品种遗传多样性[J].遗传学报，2001，28（11）：1040-1050.
[12] 庞朝友，杜雄明，马峙英.棉属种间杂交基因渐渗系SSR标记及其表型性状的聚类分析[J].作物学报，2006，32（9）：1371-1378.
[13] 朱四元，陈金湘，刘爱玉，等.利用SSR标记对不同类型抗虫棉品种的遗传多样性分析[J].湖南农业大学学报（自然科学版），2006，32（5）：469-472.
[14] 陈光，杜雄明，卢东柏，等.利用SSR分子标记进行海岛棉遗传多样性研究[J].植物遗传资源学报，2005，6（2）：135-139.