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摘要：目的 测定康咳灵合剂中重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ的含量。方法 采用HPLC，色谱柱为Poroshell 120 Ec-C18柱（4.6 mm×150 mm，4 ?m），以乙腈（A）-水（B）作为流动相进行梯度洗脱，检测波长为210 nm，流速为1 mL/min，柱温为30 ℃。 结果 重楼皂苷Ⅰ在1.009～10.09 ?g（r=0.999 6）范围内线性关系良好，平均回收率为97.31%（RSD=2.05%，n=6）；重楼皂苷Ⅱ在0.640 5～6.405 ?g（r=0.999 8）范围内线性关系良好，平均回收率为96.41%（RSD=1.67%，n=6）。结论 本方法简便、重复性好，结果准确，可用于测定康咳灵合剂中重楼皂苷的含量。
关键词：康咳灵合剂；高效液相色谱法；重楼皂苷Ⅰ；重楼皂苷Ⅱ
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.11.018
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2017）11-0075-03
Content Determination of Polyphyllin Ⅰ and Ⅱ in Kangkeling Mixture by HPLC PENG Min， SHI Mei-qin， TONG Xiao-dong， YANG Shui-ying， XU Yan （Nantong Hospital of Traditional Chinese Medicine， Nantong 226001， China）
Abstract： Objective To establish a method for determining the contents of polyphyllin Ⅰ and polyphyllin Ⅱ in Kangkeling Mixture. Methods The contents of polyphyllin Ⅰ and Ⅱ were determined by HPLC gradient elution. Poroshell 120 Ec-C18 column （4.6 mm × 150 mm， 4 ?m） was used； Acetonitrile-water （A∶B） was set as the mobile phase； the flow rate was 1.0 mL/min； the detection wavelength was 210 nm； column temperature was 30 ℃. Results Polyphyllin Ⅰ showed good linear relationship in the range of 1.009–10.09 ?g （r=0.999 6）， and the average recovery was 97.31% （RSD=2.05%， n=6）. Polyphyllin Ⅱ showed good linear relationship in the range of 0.640 5– 6.405 ?g （r=0.999 8）， and the average recovery was 96.41% （RSD=1.67%， n=6）. Conclusion The method is simple， with good repeatability and accurate results， which can be used to determine the contents of polyphyllin Ⅰ and Ⅱ in Kangkeling Mixture.
Key words： Kangkeling Mixture； HPLC； polyphyllin Ⅰ； polyphyllin Ⅱ
咳灵合剂是依据本院临床经验方研制而成的院内制剂，由矮地茶、重楼、百部、南沙参、炙枇杷叶、天冬、甘草等组成，具有润肺祛痰、止咳平喘的功效，善于治疗热、痰火型咳嗽。重楼是康咳灵合剂的主要组成之一，具有清热解毒、消肿止痛、凉肝定惊功效。现代研究表明，甾体皂苷是重楼的主要活性成分，也是重楼药材质量控制的重要标准[1]。因此，本研究建立重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ的含量测定方法，作为控制康咳灵合剂质量的方法之一。
1 仪器与试药
DIONEX-UltiMate 3000高效液相色谱仪，紫外检测器（赛默飞世尔科技有限公司）；JP-040S型超声波
基金项目：南通市卫生和计划生育委员会科技项目（WQ2015065）
通訊作者：童晓东，E-mail：924822769@qq.com
清洗机（深圳市洁盟清洗设备有限公司）；ME104/02电子分析天平（梅特勒-托利多有限公司）；EPED-S2- 30DH型超纯水器（南京普益达科技发展有限公司）。
重楼皂苷Ⅰ对照品（批号111590-201103）、重楼皂苷Ⅱ（批号111591-201103）对照品，中国食品药品检定研究院；康咳灵合剂为本院自制（批号分别为160113、160314、160321）；乙腈为色谱纯，水为自制超纯水，甲醇、正丁醇、丙酮为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件与系统适用性
色谱柱：Poroshell 120 Ec-C18（4.6 mm×150 mm，4 ?m）；流动相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脱（0～30 min，38%A；30～50 min，38%～45%A；50～75 min，45%～55%A）；流速：1 mL/min；检测波长：210 nm；进样量：20 ?L；柱温：30 ℃。在此条件下，重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ的出峰时间分别为44.91、49.93 min，重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ的色谱峰与相邻色谱峰之间的分离度均大于1.50，阴性对照在与重楼皂苷对照品相同的保留时间处无色谱峰干扰。色谱图见图1。 2.2 对照品溶液的制备
取重楼皂苷Ⅰ对照品2.018 0 mg、重楼皂苷Ⅱ对照品1.281 1 mg，精密称定，加甲醇溶解，定容至10 mL，即得混合对照品溶液。
2.3 供试品溶液的制备
精密量取本品20 mL，用水饱和的正丁醇萃取4次，每次20 mL，合并正丁醇液，蒸干，残渣用丙酮洗涤2次，每次10 mL，弃去丙酮液，残渣蒸干，用甲醇溶解，定容至10 mL。
2.4 阴性对照溶液的制备
依处方组成，制成缺重楼的康咳灵合剂，按“2.3”项下方法制备阴性对照溶液。
2.5 方法学考察
2.5.1 线性关系考察 分别精密吸取重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ对照品溶液5、10、20、30、40、50 ?L，注入液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件，以重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ进样量为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线，求得回归方程。重楼皂苷Ⅰ：Y=1.432 5X+0.106 4，线性范围为1.009～10.09 ?g，r=0.999 6。重楼皂苷Ⅱ：Y=1.589 2X-0.000 7，线性范围为0.640 5～6.405 ?g，r=0.999 8。
2.5.2 精密度试验 精密吸取重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ对照品溶液20 ?L，按“2.1”项下色谱条件，连续进样6次，测定峰面积，计算得重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ峰面积的RSD分别为1.29%、1.57%，表明仪器的精密度良好。
2.5.3 重复性试验 取同一批号（160314）的样品6份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，测定峰面积，计算得样品中重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ的平均含量分别为0.185 5、0.094 7 mg/mL，RSD分别为2.10%、2.43%，结果表明本方法的重复性良好。
2.5.4 稳定性试验 取同一供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，分别在0、2、4、8、12、16 h进样，测定峰面积，计算得重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ峰面积RSD分别为1.68%、2.12%，表明供试品溶液在16 h内稳定。
2.5.5 加样回收率试验 精密量取已知含量（批号160314）的样品6份，每份10 mL，分别精密加入重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ混合对照品适量，按“2.3”项下方法制成加样回收供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，测定峰面积，计算回收率，结果见表1。
2.6 样品含量测定
取3批样品（批号160113、160314、160321），每批取2份，按“2.3”项下方法制成供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，测定峰面积，并计算重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ的含量，结果见表2。
3 讨论
本试验采用水饱和的正丁醇作为萃取溶剂，并考察了萃取溶剂倍量对重楼皂苷含量测定的影响。经4倍量溶剂萃取后，重楼皂苷得率达到最大，继续增大溶剂量对重楼皂苷得率并無显著影响。综合考虑，选择萃取溶剂的量为样品取样体积的4倍，分4次萃取。
重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ属于甾体皂苷，难溶于丙酮[2]，因此选择丙酮作为洗涤溶剂，除去正丁醇提取物中的杂质。此外，本试验还考察了丙酮作为沉淀试剂提取正丁醇提取物水溶液中的重楼皂苷的方法。由于本品重楼皂苷含量较低，沉淀物的析出量较少，分离后对重楼皂苷含量测定影响较大。因此，选择丙酮洗涤法作为除杂方法。
在探索色谱条件的过程中，本试验参考了《中华人民共和国药典》中重楼药材含量测定方法[3]，选择了乙腈-水梯度洗脱的步骤，结果基线漂移严重，目标成分分离不理想。因此，结合有关报道[4-5]，参照乙腈-水（42∶58）[6]的比例，降低初始流动相的极性，减慢流动相的梯度速度后，分离度较好，目标峰与杂质分离清晰，保留时间适中。
参考文献：
[1] 黄贤校，高文远，满淑丽，等.重楼属药用植物皂苷类化学成分及其生源途径的研究进展[J].中草药，2009，40（3）：483-489.
[2] 匡海学.中药化学[M].北京：中国医药科技出版社，2003：293.
[3] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[M].北京：中国医药科技出版社，2015：260.
[4] 李懿，何佳，赵庭周，等.HPLC同时测定不同产地滇重楼中的6种重楼皂苷[J].中成药，2012，34（1）：113-116.
[5] 韩燕全，洪燕，夏伦祝，等.UPLC-ELSD法同时测定重楼中重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ[J].中草药，2012，43（2）：305-307.
[6] 杨培民，倪健，曹广尚.HPLC法测定重楼克感滴丸中重楼皂苷Ⅰ和重楼皂苷Ⅱ的含量[J].中华中医药杂志，2012，27（3）：678-680.
关键词：康咳灵合剂；高效液相色谱法；重楼皂苷Ⅰ；重楼皂苷Ⅱ
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.11.018
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2017）11-0075-03
Content Determination of Polyphyllin Ⅰ and Ⅱ in Kangkeling Mixture by HPLC PENG Min， SHI Mei-qin， TONG Xiao-dong， YANG Shui-ying， XU Yan （Nantong Hospital of Traditional Chinese Medicine， Nantong 226001， China）
Abstract： Objective To establish a method for determining the contents of polyphyllin Ⅰ and polyphyllin Ⅱ in Kangkeling Mixture. Methods The contents of polyphyllin Ⅰ and Ⅱ were determined by HPLC gradient elution. Poroshell 120 Ec-C18 column （4.6 mm × 150 mm， 4 ?m） was used； Acetonitrile-water （A∶B） was set as the mobile phase； the flow rate was 1.0 mL/min； the detection wavelength was 210 nm； column temperature was 30 ℃. Results Polyphyllin Ⅰ showed good linear relationship in the range of 1.009–10.09 ?g （r=0.999 6）， and the average recovery was 97.31% （RSD=2.05%， n=6）. Polyphyllin Ⅱ showed good linear relationship in the range of 0.640 5– 6.405 ?g （r=0.999 8）， and the average recovery was 96.41% （RSD=1.67%， n=6）. Conclusion The method is simple， with good repeatability and accurate results， which can be used to determine the contents of polyphyllin Ⅰ and Ⅱ in Kangkeling Mixture.
Key words： Kangkeling Mixture； HPLC； polyphyllin Ⅰ； polyphyllin Ⅱ
咳灵合剂是依据本院临床经验方研制而成的院内制剂，由矮地茶、重楼、百部、南沙参、炙枇杷叶、天冬、甘草等组成，具有润肺祛痰、止咳平喘的功效，善于治疗热、痰火型咳嗽。重楼是康咳灵合剂的主要组成之一，具有清热解毒、消肿止痛、凉肝定惊功效。现代研究表明，甾体皂苷是重楼的主要活性成分，也是重楼药材质量控制的重要标准[1]。因此，本研究建立重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ的含量测定方法，作为控制康咳灵合剂质量的方法之一。
1 仪器与试药
DIONEX-UltiMate 3000高效液相色谱仪，紫外检测器（赛默飞世尔科技有限公司）；JP-040S型超声波
基金项目：南通市卫生和计划生育委员会科技项目（WQ2015065）
通訊作者：童晓东，E-mail：924822769@qq.com
清洗机（深圳市洁盟清洗设备有限公司）；ME104/02电子分析天平（梅特勒-托利多有限公司）；EPED-S2- 30DH型超纯水器（南京普益达科技发展有限公司）。
重楼皂苷Ⅰ对照品（批号111590-201103）、重楼皂苷Ⅱ（批号111591-201103）对照品，中国食品药品检定研究院；康咳灵合剂为本院自制（批号分别为160113、160314、160321）；乙腈为色谱纯，水为自制超纯水，甲醇、正丁醇、丙酮为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件与系统适用性
色谱柱：Poroshell 120 Ec-C18（4.6 mm×150 mm，4 ?m）；流动相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脱（0～30 min，38%A；30～50 min，38%～45%A；50～75 min，45%～55%A）；流速：1 mL/min；检测波长：210 nm；进样量：20 ?L；柱温：30 ℃。在此条件下，重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ的出峰时间分别为44.91、49.93 min，重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ的色谱峰与相邻色谱峰之间的分离度均大于1.50，阴性对照在与重楼皂苷对照品相同的保留时间处无色谱峰干扰。色谱图见图1。 2.2 对照品溶液的制备
取重楼皂苷Ⅰ对照品2.018 0 mg、重楼皂苷Ⅱ对照品1.281 1 mg，精密称定，加甲醇溶解，定容至10 mL，即得混合对照品溶液。
2.3 供试品溶液的制备
精密量取本品20 mL，用水饱和的正丁醇萃取4次，每次20 mL，合并正丁醇液，蒸干，残渣用丙酮洗涤2次，每次10 mL，弃去丙酮液，残渣蒸干，用甲醇溶解，定容至10 mL。
2.4 阴性对照溶液的制备
依处方组成，制成缺重楼的康咳灵合剂，按“2.3”项下方法制备阴性对照溶液。
2.5 方法学考察
2.5.1 线性关系考察 分别精密吸取重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ对照品溶液5、10、20、30、40、50 ?L，注入液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件，以重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ进样量为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线，求得回归方程。重楼皂苷Ⅰ：Y=1.432 5X+0.106 4，线性范围为1.009～10.09 ?g，r=0.999 6。重楼皂苷Ⅱ：Y=1.589 2X-0.000 7，线性范围为0.640 5～6.405 ?g，r=0.999 8。
2.5.2 精密度试验 精密吸取重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ对照品溶液20 ?L，按“2.1”项下色谱条件，连续进样6次，测定峰面积，计算得重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ峰面积的RSD分别为1.29%、1.57%，表明仪器的精密度良好。
2.5.3 重复性试验 取同一批号（160314）的样品6份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，测定峰面积，计算得样品中重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ的平均含量分别为0.185 5、0.094 7 mg/mL，RSD分别为2.10%、2.43%，结果表明本方法的重复性良好。
2.5.4 稳定性试验 取同一供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，分别在0、2、4、8、12、16 h进样，测定峰面积，计算得重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ峰面积RSD分别为1.68%、2.12%，表明供试品溶液在16 h内稳定。
2.5.5 加样回收率试验 精密量取已知含量（批号160314）的样品6份，每份10 mL，分别精密加入重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ混合对照品适量，按“2.3”项下方法制成加样回收供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，测定峰面积，计算回收率，结果见表1。
2.6 样品含量测定
取3批样品（批号160113、160314、160321），每批取2份，按“2.3”项下方法制成供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，测定峰面积，并计算重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ的含量，结果见表2。
3 讨论
本试验采用水饱和的正丁醇作为萃取溶剂，并考察了萃取溶剂倍量对重楼皂苷含量测定的影响。经4倍量溶剂萃取后，重楼皂苷得率达到最大，继续增大溶剂量对重楼皂苷得率并無显著影响。综合考虑，选择萃取溶剂的量为样品取样体积的4倍，分4次萃取。
重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ属于甾体皂苷，难溶于丙酮[2]，因此选择丙酮作为洗涤溶剂，除去正丁醇提取物中的杂质。此外，本试验还考察了丙酮作为沉淀试剂提取正丁醇提取物水溶液中的重楼皂苷的方法。由于本品重楼皂苷含量较低，沉淀物的析出量较少，分离后对重楼皂苷含量测定影响较大。因此，选择丙酮洗涤法作为除杂方法。
在探索色谱条件的过程中，本试验参考了《中华人民共和国药典》中重楼药材含量测定方法[3]，选择了乙腈-水梯度洗脱的步骤，结果基线漂移严重，目标成分分离不理想。因此，结合有关报道[4-5]，参照乙腈-水（42∶58）[6]的比例，降低初始流动相的极性，减慢流动相的梯度速度后，分离度较好，目标峰与杂质分离清晰，保留时间适中。
参考文献：
[1] 黄贤校，高文远，满淑丽，等.重楼属药用植物皂苷类化学成分及其生源途径的研究进展[J].中草药，2009，40（3）：483-489.
[2] 匡海学.中药化学[M].北京：中国医药科技出版社，2003：293.
[3] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[M].北京：中国医药科技出版社，2015：260.
[4] 李懿，何佳，赵庭周，等.HPLC同时测定不同产地滇重楼中的6种重楼皂苷[J].中成药，2012，34（1）：113-116.
[5] 韩燕全，洪燕，夏伦祝，等.UPLC-ELSD法同时测定重楼中重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ[J].中草药，2012，43（2）：305-307.
[6] 杨培民，倪健，曹广尚.HPLC法测定重楼克感滴丸中重楼皂苷Ⅰ和重楼皂苷Ⅱ的含量[J].中华中医药杂志，2012，27（3）：678-680.