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【摘 要】目的：探讨高糖诱导肝细胞脂变中的可能机制。方法：分别以18、25mmol/l的葡萄糖浓度培养L02细胞，以11mmol/l葡萄糖浓度培养L02细胞作为对照，测定细胞内甘油三酯（TG）含量反应肝细胞脂变程度；RT-PCR检测乙酰辅酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase，ACC）、固醇调节元件结合蛋白1c（Sterol regulatory element binding protein 1c ，SREBP-1c）的mRNA表达水平，Western blot分析乙酰辅酶A羧化酶、肝X受体α（liver X receptor alpha ，LXRα）的蛋白表达水平。结果：与对照组比较，高糖可促进L02细胞内甘油三酯含量增加，上调ACC mRNA和ACC蛋白的表达量，而高糖组各时间点SREBP-1c mRNA 和LXRα蛋白表达与对照组比较无明显变化。结论：1、高糖可通过上调ACC的表达，参与肝细胞脂肪沉积的形成过程。2、LXRα- SREBP-1c -ACC途径可能没有参与葡萄糖及其代谢产物诱导的肝细胞脂肪沉积。
【关键词】高糖；肝细胞脂肪变性；乙酰辅酶A羧化酶；肝X受体α；固醇调节元件结合蛋白1c
【中图分类号】R589 【文献标识码】A 【文章编号】1004—7484（2013）09—0022—003
糖尿病和脂肪肝是常见的伴发疾病，在糖尿病患者中，脂肪肝的发病率明显增加，而当前对于这种现象的机制并不十分清楚，因此，研究NAFLD的具体发病机制，制定有效防治措施显得刻不容缓。
目前葡萄糖代谢信号途径在脂肪肝形成中的作用及可能机制引起了广泛的关注，我们既往研究[6]发现碳水化合物反应元件结合蛋白（carbohydrate response element binding protein， ChREBP）在糖和脂肪代谢过程中发挥着重要的作用，调节糖酵解和脂肪酸合成酶基因的表达，但也有学者认为 [4]，过多的葡萄糖可直接作为LXRα的配体，上调LXRα靶基因如SREBP-lc、ACC等的表达，影响肝脏的脂肪沉积。
本实验利用高糖体外培养人正常肝细胞（L02细胞），观察L02细胞的脂肪沉积、LXRα、SREBP-lc、 ACC表达的变化，从正常人肝细胞水平探讨高糖条件下肝脂肪形成的可能机制，为进一步防治脂肪肝提供实验依据。
1 材料和方法
1.1 材料 L02 细胞（重庆医科大学附二院消化内科实验室保存） ；甘油三酯试剂盒（南京建成生物研究所）；ACC、LXRα抗体（美国Santa cruz公司）；β-actin抗体、GAPDH抗体（碧云天生物研究所）； RNA提取试剂盒、PCR试剂盒、RT试剂盒（日本TaKaRa公司）；ACC引物、SREBP-1c引物、β-actin1引物、β-actin2引物（大连宝生物公司）。
1.2方法
1.2.1细胞培养 用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基培养L02细胞，置入37℃含5%C02孵箱，当细胞贴壁约85%时，用含0.25%胰蛋白酶溶液消化，收集并传代。
1.2.2 实验分组 根据文献研究[3]，实验分为3组：G1组（葡萄糖浓度为11mmol/l，为对照组），G2组（葡萄糖浓度为18mmol/l）和G3组（葡萄糖浓度为25mmol/l）。
1.2.3 TG含量检测 高糖刺激24、48h后收集细胞，按试剂盒说明进行操作，并行细胞蛋白定量，计算每毫克蛋白所对应的TG含量。
1.2.6 ACC 、SREBP-1cmRNA表达的检测 分别在高糖刺激0，3， 6， 12，24，36，48h提取L02细胞总RNA，检测细胞总RNA的纯度和完整性，用RT-PCR方法检测ACC、SREBP-1c基因的mRNA表达量。ACC-1上游引物：5-ACCTGTGGGAGTAGTTGCTG-3，下游引物：5-ATTAGAGGTAGCCCTTCACG-3，扩增片段长度为180bp， β-actin1 上游引物： 5-GGGACCTGACTGACTACCTC-3，下游引物： 5-CGTCATACTCCTGCTTCCTG-3，扩增片段长度为540bp。SREBP-1c上游引物：5-CCCAGAAACTCAAGCGAGAAC-3，下游引物：5-CTTTGCTGTCCTCAAAGACTGG-3，扩增片段长度为274bp；β-actin2 上游引物：5-GACCCAGATCATGTTTGAGACC-3，下游引物：5-ATCTCCTTCTGCATCCTGTCG-3，扩增片段长度为625bp。PCR反应条件为：94℃预变性2min，94℃变性30 s， 53℃退火30 s， 72℃ 延伸30s，共35個循环， 72℃再延伸2min。取反应产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果经凝胶成像分析仪成像，计算出目的条带与内参条带光密度的比值。
1.2.7 ACC、LXRα蛋白表达的检测 分别在高糖刺激24、48h提取L02细胞总蛋白，BCA法检测蛋白浓度，使用电泳胶进行电泳分离，然后转膜， 封闭液封闭，把膜放入一抗中，温箱中温育2小时，取出膜， PBST洗涤，然后加入相应二抗中，温育1小时，取出膜，PBST洗涤，DAB 显色剂显色，于凝胶成像分析仪中成像，计算每个样本与内参光密度值的比值。
统计学处理： 数据以均数±标准差表示，用SPSS16.0软件进行统计分析，，多组均数的比较采用单因素方差分析，两两之间比较用t检验， P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 葡萄糖对L02细胞内TG含量的影响 细胞内TG含量随着葡萄糖浓度升高及作用时间的延长逐渐增加。与对照组相比， G2、G3组细胞24h时间段细胞TG含量稍升高，但差异无统计学意义（P=0.1994）；48h时间段TG含量明显增加，差异有均统计学意义（P =0.0001和P =0.0000），且G3组细胞内TG含量增加更明显，故我们选择25mmol/l葡萄糖浓度为高糖浓度，进行后继实验。（见表1）. 2.2 葡萄糖對L02细胞ACC、SREBP-1c mRNA表达的影响
与对照组比较，高糖组细胞随着葡萄糖作用时间的延长， ACC mRNA表达量逐渐增加（P=0.0000），与对照组比较，高糖组细胞各时间点SREBP-1c mRNA差异无统计学意义（P>0.05）。（见图1、图2、表2）
高糖组各时间点与对照组比较，a P =0.0211，b P =0.0012， c P =0.0011，dP =0.0002； 高糖组内与前一时间点比较，e P =0.0162， f P =0.0188，g P =0.0284， hP =0.0328
2.3葡萄糖对L02细胞ACC、LXRα蛋白质表达的影响
与对照组比较，高糖组细胞24h、48h的ACC蛋白表达增加，差异均有统计学意义（P=0.0030和P=0.0001）；与对照组比较，高糖组细胞24h、48h的LXRα蛋白差异无统计学意义（P>0.05）。（见图3、图4、表3）
3 讨论
SREBP-lc是碱性螺旋-环-螺旋-亮氨酸锌指（bHLH-ZIP）转录因子家族的一员，调控脂肪合成路径中关键酶的基因，如乙酰CoA羧化酶、脂肪酸合成酶等 [10]。同时，研究表明，SREBP-lc的转录受到LXRα、胰岛素等的调控[5]。LXRα属于核受体超家族，以肝脏中含量最多。LXRα与类视黄醇X受体（Retinoid X receptor ，RXR）形成异二聚体后与LXR反应元件（LXR Response element ，LXRE）结合，促进靶基因如SREBP-1c、ACC等的转录，调节和维持脂肪酸代谢平衡[8，9]。文献研究显示[1，2，5，7]，当饮食中摄取过多的葡萄糖，肝脏就会通过胰岛素-SREBP-lc途径和葡萄糖-ChREBP途径促使葡萄糖向脂肪转化，增加胰岛素抵抗，导致疾病的恶性循环发展。但也有文献研究表明 [4]，过多的葡萄糖可直接作为LXRα的配体，上调LXRα靶基因如SREBP-lc等的表达，进而调控肝脏的脂质合成。
本实验采用高浓度葡萄糖体外培养L02细胞，观察肝细胞的脂肪沉积、LXRα、SREBP-lc以及ACC的表达情况，以期揭示LXRα和SREBP-lc在葡萄糖向脂质转变过程中的可能作用。细胞TG含量测定显示，肝细胞内脂肪随着葡萄糖浓度的增加和作用时间的延长合成逐渐增多。实验通过对ACC mRNA和蛋白水平检测发现，高糖组较对照组显著升高，且随着造模时间的延长，ACC表达进一步增加；同时，我们的研究也发现高糖体外培养L02细胞的条件下，各时间点的LXRα蛋白和SREBP-lc mRNA表达量与对照组比较差异不明显。结合既往研究[6]可知，高糖可促进肝细胞内脂肪沉积，其可能机制是葡萄糖代谢产物促进ChREBP向细胞核转位，进入细胞核的ChREBP与ACC靶基因启动子上的ChoRE序列结合，上调ACC基因表达，以及进一步上调ACC蛋白的表达。同时，我们的研究也证实，高浓度葡萄糖并不能直接和LXRα结合，促进SREBP-lc表达以及进一步的调控脂质合成。文献研究表明[5]，当摄取过多的碳水化合物时，可刺激体内胰岛素的释放，诱导LXRα表达，激活SREBP-lc转录，从而调节ACC 、FAS等脂肪合成酶的表达。由此可以推断，SREBP-lc和ChREBP分别从胰岛素和葡萄糖两个不同途径来调节相应靶基因的表达，促进脂肪肝的形成。
参考文献：
[1] da Silva Xavier G， Rutter GA， Diraison F， et al. ChREBP binding to fatty acid synthase and L-type pyruvate kinase genes is stimulated by glucose in pancreatic β-cells[J]. J Lipid Res， 2006， 47： 2482–2491.
[2] Denechaud PD， Bossard P， Lobaccaro JMA， et al. ChREBP， but not LXRs， is required for the induction of glucose-regulated genes in mouse liver[J]. J Clin Invest， 2008， 118（3）： 956–964.
[3] Li MV， Chang B， Imamura M， et al. Glucose-dependent transcriptional regulation by an evolutionarily conserved glucose-sensing module[J]. Diabetes， 2006， 55：1179–1189.
[4] Mitro N， Mak PA， Vargas L， et al. The nuclear receptor LXR is a glucose sensor[J].Nature， 2007， 445（11）：219-223.
[5] Chen G， Liang G， Ou J， et a1. Central role for liver X receptor in insulin-mediated activation of Srebp-1 transcription and stimulation of fatty acid synthesis in liver [J]. Proc Natl Acad Sci USA， 2004， 101： l1245-11250.
[6] 熊玲，沈薇. 碳水化合物反应元件结合蛋白对L02细胞糖脂代谢的影响[J].中国生物制品学杂志，2011，24（4）：421-425.
[7] Green CD， Jump DB， Olson LK. Elevated Insulin Secretion from Liver X Receptor-Activated Pancreatic β-Cells Involves Increased de Novo Lipid Synthesis and Triacylglyceride Turnover [J]. Endocrinology， 2009，150（6）：2637–2645.
[8] McEwan IJ. Nuclear receptors： one big family [J]. Methods Mol Biol， 2009， 505： 3–18.
[9] Perez E， Bourguet W， Gronemeyer H， et al. Modulation of RXR function through ligand design [J]. Biochim Biophys Acta ， 2011， 1821： 57–69.
[10] Yokoyama C， Wang X， Briggs MR， et al. SREBP-1， a basic-helix-loop-helix-leucine zipper protein that controls transcription of the low density lipoprotein receptor gene [J]. Cell， 1993， 75： 187–197.
【关键词】高糖；肝细胞脂肪变性；乙酰辅酶A羧化酶；肝X受体α；固醇调节元件结合蛋白1c
【中图分类号】R589 【文献标识码】A 【文章编号】1004—7484（2013）09—0022—003
糖尿病和脂肪肝是常见的伴发疾病，在糖尿病患者中，脂肪肝的发病率明显增加，而当前对于这种现象的机制并不十分清楚，因此，研究NAFLD的具体发病机制，制定有效防治措施显得刻不容缓。
目前葡萄糖代谢信号途径在脂肪肝形成中的作用及可能机制引起了广泛的关注，我们既往研究[6]发现碳水化合物反应元件结合蛋白（carbohydrate response element binding protein， ChREBP）在糖和脂肪代谢过程中发挥着重要的作用，调节糖酵解和脂肪酸合成酶基因的表达，但也有学者认为 [4]，过多的葡萄糖可直接作为LXRα的配体，上调LXRα靶基因如SREBP-lc、ACC等的表达，影响肝脏的脂肪沉积。
本实验利用高糖体外培养人正常肝细胞（L02细胞），观察L02细胞的脂肪沉积、LXRα、SREBP-lc、 ACC表达的变化，从正常人肝细胞水平探讨高糖条件下肝脂肪形成的可能机制，为进一步防治脂肪肝提供实验依据。
1 材料和方法
1.1 材料 L02 细胞（重庆医科大学附二院消化内科实验室保存） ；甘油三酯试剂盒（南京建成生物研究所）；ACC、LXRα抗体（美国Santa cruz公司）；β-actin抗体、GAPDH抗体（碧云天生物研究所）； RNA提取试剂盒、PCR试剂盒、RT试剂盒（日本TaKaRa公司）；ACC引物、SREBP-1c引物、β-actin1引物、β-actin2引物（大连宝生物公司）。
1.2方法
1.2.1细胞培养 用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基培养L02细胞，置入37℃含5%C02孵箱，当细胞贴壁约85%时，用含0.25%胰蛋白酶溶液消化，收集并传代。
1.2.2 实验分组 根据文献研究[3]，实验分为3组：G1组（葡萄糖浓度为11mmol/l，为对照组），G2组（葡萄糖浓度为18mmol/l）和G3组（葡萄糖浓度为25mmol/l）。
1.2.3 TG含量检测 高糖刺激24、48h后收集细胞，按试剂盒说明进行操作，并行细胞蛋白定量，计算每毫克蛋白所对应的TG含量。
1.2.6 ACC 、SREBP-1cmRNA表达的检测 分别在高糖刺激0，3， 6， 12，24，36，48h提取L02细胞总RNA，检测细胞总RNA的纯度和完整性，用RT-PCR方法检测ACC、SREBP-1c基因的mRNA表达量。ACC-1上游引物：5-ACCTGTGGGAGTAGTTGCTG-3，下游引物：5-ATTAGAGGTAGCCCTTCACG-3，扩增片段长度为180bp， β-actin1 上游引物： 5-GGGACCTGACTGACTACCTC-3，下游引物： 5-CGTCATACTCCTGCTTCCTG-3，扩增片段长度为540bp。SREBP-1c上游引物：5-CCCAGAAACTCAAGCGAGAAC-3，下游引物：5-CTTTGCTGTCCTCAAAGACTGG-3，扩增片段长度为274bp；β-actin2 上游引物：5-GACCCAGATCATGTTTGAGACC-3，下游引物：5-ATCTCCTTCTGCATCCTGTCG-3，扩增片段长度为625bp。PCR反应条件为：94℃预变性2min，94℃变性30 s， 53℃退火30 s， 72℃ 延伸30s，共35個循环， 72℃再延伸2min。取反应产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果经凝胶成像分析仪成像，计算出目的条带与内参条带光密度的比值。
1.2.7 ACC、LXRα蛋白表达的检测 分别在高糖刺激24、48h提取L02细胞总蛋白，BCA法检测蛋白浓度，使用电泳胶进行电泳分离，然后转膜， 封闭液封闭，把膜放入一抗中，温箱中温育2小时，取出膜， PBST洗涤，然后加入相应二抗中，温育1小时，取出膜，PBST洗涤，DAB 显色剂显色，于凝胶成像分析仪中成像，计算每个样本与内参光密度值的比值。
统计学处理： 数据以均数±标准差表示，用SPSS16.0软件进行统计分析，，多组均数的比较采用单因素方差分析，两两之间比较用t检验， P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 葡萄糖对L02细胞内TG含量的影响 细胞内TG含量随着葡萄糖浓度升高及作用时间的延长逐渐增加。与对照组相比， G2、G3组细胞24h时间段细胞TG含量稍升高，但差异无统计学意义（P=0.1994）；48h时间段TG含量明显增加，差异有均统计学意义（P =0.0001和P =0.0000），且G3组细胞内TG含量增加更明显，故我们选择25mmol/l葡萄糖浓度为高糖浓度，进行后继实验。（见表1）. 2.2 葡萄糖對L02细胞ACC、SREBP-1c mRNA表达的影响
与对照组比较，高糖组细胞随着葡萄糖作用时间的延长， ACC mRNA表达量逐渐增加（P=0.0000），与对照组比较，高糖组细胞各时间点SREBP-1c mRNA差异无统计学意义（P>0.05）。（见图1、图2、表2）
高糖组各时间点与对照组比较，a P =0.0211，b P =0.0012， c P =0.0011，dP =0.0002； 高糖组内与前一时间点比较，e P =0.0162， f P =0.0188，g P =0.0284， hP =0.0328
2.3葡萄糖对L02细胞ACC、LXRα蛋白质表达的影响
与对照组比较，高糖组细胞24h、48h的ACC蛋白表达增加，差异均有统计学意义（P=0.0030和P=0.0001）；与对照组比较，高糖组细胞24h、48h的LXRα蛋白差异无统计学意义（P>0.05）。（见图3、图4、表3）
3 讨论
SREBP-lc是碱性螺旋-环-螺旋-亮氨酸锌指（bHLH-ZIP）转录因子家族的一员，调控脂肪合成路径中关键酶的基因，如乙酰CoA羧化酶、脂肪酸合成酶等 [10]。同时，研究表明，SREBP-lc的转录受到LXRα、胰岛素等的调控[5]。LXRα属于核受体超家族，以肝脏中含量最多。LXRα与类视黄醇X受体（Retinoid X receptor ，RXR）形成异二聚体后与LXR反应元件（LXR Response element ，LXRE）结合，促进靶基因如SREBP-1c、ACC等的转录，调节和维持脂肪酸代谢平衡[8，9]。文献研究显示[1，2，5，7]，当饮食中摄取过多的葡萄糖，肝脏就会通过胰岛素-SREBP-lc途径和葡萄糖-ChREBP途径促使葡萄糖向脂肪转化，增加胰岛素抵抗，导致疾病的恶性循环发展。但也有文献研究表明 [4]，过多的葡萄糖可直接作为LXRα的配体，上调LXRα靶基因如SREBP-lc等的表达，进而调控肝脏的脂质合成。
本实验采用高浓度葡萄糖体外培养L02细胞，观察肝细胞的脂肪沉积、LXRα、SREBP-lc以及ACC的表达情况，以期揭示LXRα和SREBP-lc在葡萄糖向脂质转变过程中的可能作用。细胞TG含量测定显示，肝细胞内脂肪随着葡萄糖浓度的增加和作用时间的延长合成逐渐增多。实验通过对ACC mRNA和蛋白水平检测发现，高糖组较对照组显著升高，且随着造模时间的延长，ACC表达进一步增加；同时，我们的研究也发现高糖体外培养L02细胞的条件下，各时间点的LXRα蛋白和SREBP-lc mRNA表达量与对照组比较差异不明显。结合既往研究[6]可知，高糖可促进肝细胞内脂肪沉积，其可能机制是葡萄糖代谢产物促进ChREBP向细胞核转位，进入细胞核的ChREBP与ACC靶基因启动子上的ChoRE序列结合，上调ACC基因表达，以及进一步上调ACC蛋白的表达。同时，我们的研究也证实，高浓度葡萄糖并不能直接和LXRα结合，促进SREBP-lc表达以及进一步的调控脂质合成。文献研究表明[5]，当摄取过多的碳水化合物时，可刺激体内胰岛素的释放，诱导LXRα表达，激活SREBP-lc转录，从而调节ACC 、FAS等脂肪合成酶的表达。由此可以推断，SREBP-lc和ChREBP分别从胰岛素和葡萄糖两个不同途径来调节相应靶基因的表达，促进脂肪肝的形成。
参考文献：
[1] da Silva Xavier G， Rutter GA， Diraison F， et al. ChREBP binding to fatty acid synthase and L-type pyruvate kinase genes is stimulated by glucose in pancreatic β-cells[J]. J Lipid Res， 2006， 47： 2482–2491.
[2] Denechaud PD， Bossard P， Lobaccaro JMA， et al. ChREBP， but not LXRs， is required for the induction of glucose-regulated genes in mouse liver[J]. J Clin Invest， 2008， 118（3）： 956–964.
[3] Li MV， Chang B， Imamura M， et al. Glucose-dependent transcriptional regulation by an evolutionarily conserved glucose-sensing module[J]. Diabetes， 2006， 55：1179–1189.
[4] Mitro N， Mak PA， Vargas L， et al. The nuclear receptor LXR is a glucose sensor[J].Nature， 2007， 445（11）：219-223.
[5] Chen G， Liang G， Ou J， et a1. Central role for liver X receptor in insulin-mediated activation of Srebp-1 transcription and stimulation of fatty acid synthesis in liver [J]. Proc Natl Acad Sci USA， 2004， 101： l1245-11250.
[6] 熊玲，沈薇. 碳水化合物反应元件结合蛋白对L02细胞糖脂代谢的影响[J].中国生物制品学杂志，2011，24（4）：421-425.
[7] Green CD， Jump DB， Olson LK. Elevated Insulin Secretion from Liver X Receptor-Activated Pancreatic β-Cells Involves Increased de Novo Lipid Synthesis and Triacylglyceride Turnover [J]. Endocrinology， 2009，150（6）：2637–2645.
[8] McEwan IJ. Nuclear receptors： one big family [J]. Methods Mol Biol， 2009， 505： 3–18.
[9] Perez E， Bourguet W， Gronemeyer H， et al. Modulation of RXR function through ligand design [J]. Biochim Biophys Acta ， 2011， 1821： 57–69.
[10] Yokoyama C， Wang X， Briggs MR， et al. SREBP-1， a basic-helix-loop-helix-leucine zipper protein that controls transcription of the low density lipoprotein receptor gene [J]. Cell， 1993， 75： 187–197.