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摘 要：将鸽Ⅰ型副粘病毒F基因亚克隆到pGEX-4T-1载体中，并用大肠杆菌BL21（DE3）为宿主菌诱导表达。以纯化的F蛋白为诊断抗原，建立鸽Ⅰ型副粘病毒间接ELISA检测方法，用方阵法确定了间接ELISA检测的最佳条件：抗原1∶128稀释即抗原包被量为0.6 μg/孔，血清1∶400稀释，与一抗的最佳作用时间为60 min，与酶标二抗的最佳作用时间为60 min，底物显色的最佳作用时间为15 min。用该方法对实验室保存的35份阳性血清和12份阴性血清进行检测，结果阳性符合率达到97 %以上，阴性符号率达100 %。
关键词：鸽Ⅰ型副粘病毒；F基因；原核表达；ELISA；检测
中图分类号：S852.4 3 文献标识码：A 文章编号：1001-0769（2015）06-0059-03
鸽Ⅰ型副粘病毒（Pigeon Paramyxovirus Type 1，PPMV-1）病又称鸽瘟或鸽新城疫，是一种由禽I型副粘病毒（Avian Paramyxovirus 1，PMV-Ⅰ）引起的一种急性、热性、高度性传染病。鸽Ⅰ型副粘病毒的基因组为一条单股负链RNA，长约15 kb，包括6个基因：3’-NP-P-M-F-HN-L-5’，其中F基因全长为1 662 bp。编码553个氨基酸。融合糖蛋白（F蛋白）主要负责病毒与易感细胞发生融合、进入细胞和产生溶血，并对新城疫病毒的毒力起主要决定作用，因此对鸽新城疫F蛋白的研究具有十分重要的意义。
本试验选取F基因部分序列在原核大肠杆菌中高效表达，对表达产物进行纯化，以纯化的F蛋白作为包被抗原建立间接ELISA检测方法，并对其特异性进行初步检测，为鸽新城疫F蛋白单克隆抗体的研制奠定了基础，为进一步建立高效准确鸽新城疫的诊断方法提供依据。
1 材料与方法
1.1 质粒与菌株
含鸽Ⅰ型副粘病毒F基因的大肠杆菌BL21（DE3）重组菌株PGEX4T-1-PPMV-1-F，由本实验室保存。
1.2 主要试剂
IPTG、丙烯酰胺、双甲基丙烯酰胺和十二烷基磺酸钠购自Promega公司，酵母提取物、胰蛋白胨、中等分子量蛋白Marker、氨苄青霉素、Tris-Cl、DTT、考马斯亮兰、PEG4000等购自上海生工公司；其他常规试剂均为国产分析纯。
1.3 血清
鸽Ⅰ型副粘病毒阳性血清35份，鸽Ⅰ型副粘病毒阳性血清12份均为本实验室保存。
1.4 重组菌的诱导表达
将测序正确于-70 ℃保存的重组菌株PGEX4T-1-PPMV-1-F（924），划线接种于LB琼脂平板（Amp ）上，倒置放于37 ℃培养箱中培养12 h～16 h；然后挑取单个菌落接种于4 mL的LB培养液中（Amp ），37 ℃振荡培养至细菌对数生长期；在将此菌以1 %的接种量接种于100 mL LB培养液（Amp ）中，37 ℃振荡培养至细菌对数生长期，以1 %接种量接种于1 000 mL含LB培养液（Amp ）中，37 ℃培养至OD600=0.4时，加入IPTG进行诱导，之后收集菌体。用PBS（pH=7.4）悬浮菌体沉淀，加入1/100体积的溶菌酶10 μg/mL，室温作用15 min。反复冻融3～4次后，在冰浴中超声裂解至菌液澄清透亮；超声条件为：功率18 W，超声作用8 s，停6 s，连续超声30 min左右，使菌体全部破碎；4 ℃ 12 000 r/min离心15 min，分别收集上清和沉淀，沉淀用8 M尿素溶解，对表达产物进行SDS-PAGE分析。
1.4 包涵体蛋白的提取
将诱导的菌体8 000 rpm/min离心5 min，Buffer A溶液洗涤1次，用Buffer A重悬沉淀后强超声波破碎2 min～3 min，至溶液为半透明。4 ℃ 10 000 rpm/min离心10 min，弃上清。用少许Buffer A轻轻洗涤沉淀。加入原细菌培养液体积1/10的Bueffr A溶液重悬沉淀，加入SKL（N-十二烷基肌氨酸钠）室温静置2 h，使其沉淀缓慢溶解。4 ℃ 10 000 rpm/min离心10 min，弃沉淀，取上清，分别加入PEG 4000至2 %（w/v）、氧化型谷胱甘肽至l mM、还原型谷胱甘肽至2 mM，静置30 min 2 h，转至处理好的透析袋中，于0.01 M TE溶液（pH8.0）中透析2 d～3 d，取出用紫外风光光度计测OD260和OD280，计算蛋白浓度。提取蛋白立即使用或分装，-20 ℃或-80 ℃保存备用。
1.5 ELISA方法的建立
1.5.1 抗原最佳包被浓度与血清最佳稀释度的确定
取纯化的重组鸽新城疫F蛋白用包被稀释液做1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256稀释；阴性、阳性血清用封闭液分别做1∶100、1∶200、1∶400、1∶800稀释后，用方阵法确定抗原及对照血清的最适工作浓度。
1.5.2 间接ELISA各工作条件的摸索
确定抗原与待检血清作用时间：采用抗原最佳包被浓度包被微量反应板，封闭，抗原与待检血清作用时间分别为40 min、 60 min、80 min，其它条件相同，计算P/N值，确定抗原与待检血清最佳作用时间。
确定待检血清与酶标二抗作用时间：采用抗原最佳包被浓度包被微量反应板，封闭，待检血清与酶标二抗作用时间分别为 40 min、60 min、80 min，其它条件相同，计算P/N值，确定待检血清与酶标二抗最佳作用时间。
确定底物显色液最佳作用时间：采用抗原最佳包被浓度包被微量反应板，其它条件相同，加入OPD-H2O2底物显色液，每孔加100 μL，室温避光显色10 min、15 min、20 min时分别用 2 mol/L H2SO4每孔50 μL终止反应，计算P/N值，确定底物显色液最佳作用时间。 1.6 临床样本的检测
应用建立的ELISA检测方法对实验室保存的35份鸽Ⅰ型副粘病毒阳性血清和12份阴性血清进行检测，确定其特异性和敏感性。
2 结果
2.1 融合蛋白的表达与纯化
对F蛋白进行诱导表达，超声处理后，取上清和沉淀分别进行SDS-PAGE电泳，结果发现目的蛋白表达于沉淀中，融合蛋白大小约为60 kD，而上清中则无目的条带出现，表明诱导产生的融合蛋白主要以不溶性的包涵体形式存在，结果如见图1所示。
2.2 纯化蛋白的浓度
以0.01 M TE溶液做空白对照，将纯化的重组蛋白用紫外分光光度计测定浓度，结果如下：
OD280=0.786
OD260=0.497
带入公式样本蛋白质含量（mg/mL）= （1.45×OD280-0.74×OD260）×稀释倍数
计算得蛋白浓度为：0.772 mg/mL
2.3 ELISA方法的建立
2.3.1 最佳抗原及抗体工作浓度的确定
用纯化的重组鸽新城疫F蛋白包被ELISA平板，采用方阵法确定蛋白的最佳包被浓度及阳性血清的最佳稀释倍数，结果见下表1。
从上表的F-ELISA方阵滴定结果表明，出 OD492 nm值为0.978时，P/N最大，此时F蛋白及阳性血清的稀释度为最佳工作条件，抗原最佳包被浓度为1∶128，即0.6 μg/孔 的抗原包被量。血清最佳稀释度为1∶400。
2.3.2 一抗作用时间的确定
测出抗原与阳性血清及阴性血清在不同时间作用的OD492 nm值（抗原、血清均采用最佳工作浓度），取平均值，计算P/N，结果见表2，当阴阳性血清与酶标二抗作用时间为60 min时，P/N值最大，故选择与一抗作用时间为60 min。
2.3.3 二抗作用时间的确定
测出阳性血清及阴性血清与二抗在不同时间作用的OD492 nm值（抗原、血清均采用最佳工作），取平均值，计算P/N，结果见表3，当阴、阳性血清与酶标二抗作用时间为60 min时，P/N值最大，故选择与二抗作用时间为60 min。
2.3.4 底物显色液作用时间的确定
抗原、血清均采用最佳工作浓度，其它条件相同，测出阳性血清、阴性血清与底物显色液不同作用时间的OD492 nm值，取平均值，计算 P/N，结果见表4，当底物液时间为15 min时， P/N值最大，且阳性OD492 nm>0.2，故选择底物液作用时间为15 min。
2.4 临床样本的检测
应用建立的间接ELISA检测方法对实验室保存的35份阳性血清和12阴性血清进行检测，结果35份阳性血清应尽量的ELISA方法检测出阳性34份，准确率达到97.14 %，对12份阴性血清用ELISA方法检测结果全部为阴性，表明建立的间接ELISA检测方法具有较好的特异性和敏感性。
3 讨论与结论
酶联免疫吸附试验（ELISA）方法自建立至今已经广泛应用于各种细菌、病毒、寄生虫病的诊断以及在肿瘤学、免疫病理学等方面已广泛应用，该方法具有灵敏、准确、简便等优势。ELISA是将抗原抗体反应的特异性和酶对底物的高效催化性结合起来的一种敏感性很高的检测方法。间接ELISA是将已知的定量抗原吸附在反应板上，加入待测抗体，形成抗原抗体复合物，洗涤除去杂蛋白后加入酶标记的二抗，洗涤除去未吸附或多余的二抗，加入底物显色，以显色反应推知抗体量。该方法可以非常灵敏地检测血清中的IgG抗体。
本实验选用了PGEX-4T-1融合表达载体后，用PITG诱导，SDS-APGE凝胶电泳分析显示，F蛋白为60 KDa左右，诱导产物在预计大小处有表达蛋白产生，是F蛋白片段34 KDa，再加上PGEX-4T-1载体自带的26 Kda的GST标签，所以F蛋白片段在PGEX-4T-1/BL21（DE3）中得到了稳定的表达，通过对表达产物处理后进行SDS-APGE电泳后发现，表达的蛋白都位于包涵体中。
把表达的蛋白进行纯化作为包被抗原，建立间接ELISA检测方法，用方阵法确定其最佳反应条件：抗原1∶128稀释即抗原包被量为0.6 μg/孔，血清1∶400稀释，与一抗的最佳作用时间为60 min，与酶标二抗的最佳作用时间为60 min，底物显色的最佳作用时间为15 min。并把建立的方法进行了临床样本的检测，具有较好的特异性和敏感性，为鸽新城疫的诊断、防治制剂的研制奠定了基础。□□
关键词：鸽Ⅰ型副粘病毒；F基因；原核表达；ELISA；检测
中图分类号：S852.4 3 文献标识码：A 文章编号：1001-0769（2015）06-0059-03
鸽Ⅰ型副粘病毒（Pigeon Paramyxovirus Type 1，PPMV-1）病又称鸽瘟或鸽新城疫，是一种由禽I型副粘病毒（Avian Paramyxovirus 1，PMV-Ⅰ）引起的一种急性、热性、高度性传染病。鸽Ⅰ型副粘病毒的基因组为一条单股负链RNA，长约15 kb，包括6个基因：3’-NP-P-M-F-HN-L-5’，其中F基因全长为1 662 bp。编码553个氨基酸。融合糖蛋白（F蛋白）主要负责病毒与易感细胞发生融合、进入细胞和产生溶血，并对新城疫病毒的毒力起主要决定作用，因此对鸽新城疫F蛋白的研究具有十分重要的意义。
本试验选取F基因部分序列在原核大肠杆菌中高效表达，对表达产物进行纯化，以纯化的F蛋白作为包被抗原建立间接ELISA检测方法，并对其特异性进行初步检测，为鸽新城疫F蛋白单克隆抗体的研制奠定了基础，为进一步建立高效准确鸽新城疫的诊断方法提供依据。
1 材料与方法
1.1 质粒与菌株
含鸽Ⅰ型副粘病毒F基因的大肠杆菌BL21（DE3）重组菌株PGEX4T-1-PPMV-1-F，由本实验室保存。
1.2 主要试剂
IPTG、丙烯酰胺、双甲基丙烯酰胺和十二烷基磺酸钠购自Promega公司，酵母提取物、胰蛋白胨、中等分子量蛋白Marker、氨苄青霉素、Tris-Cl、DTT、考马斯亮兰、PEG4000等购自上海生工公司；其他常规试剂均为国产分析纯。
1.3 血清
鸽Ⅰ型副粘病毒阳性血清35份，鸽Ⅰ型副粘病毒阳性血清12份均为本实验室保存。
1.4 重组菌的诱导表达
将测序正确于-70 ℃保存的重组菌株PGEX4T-1-PPMV-1-F（924），划线接种于LB琼脂平板（Amp ）上，倒置放于37 ℃培养箱中培养12 h～16 h；然后挑取单个菌落接种于4 mL的LB培养液中（Amp ），37 ℃振荡培养至细菌对数生长期；在将此菌以1 %的接种量接种于100 mL LB培养液（Amp ）中，37 ℃振荡培养至细菌对数生长期，以1 %接种量接种于1 000 mL含LB培养液（Amp ）中，37 ℃培养至OD600=0.4时，加入IPTG进行诱导，之后收集菌体。用PBS（pH=7.4）悬浮菌体沉淀，加入1/100体积的溶菌酶10 μg/mL，室温作用15 min。反复冻融3～4次后，在冰浴中超声裂解至菌液澄清透亮；超声条件为：功率18 W，超声作用8 s，停6 s，连续超声30 min左右，使菌体全部破碎；4 ℃ 12 000 r/min离心15 min，分别收集上清和沉淀，沉淀用8 M尿素溶解，对表达产物进行SDS-PAGE分析。
1.4 包涵体蛋白的提取
将诱导的菌体8 000 rpm/min离心5 min，Buffer A溶液洗涤1次，用Buffer A重悬沉淀后强超声波破碎2 min～3 min，至溶液为半透明。4 ℃ 10 000 rpm/min离心10 min，弃上清。用少许Buffer A轻轻洗涤沉淀。加入原细菌培养液体积1/10的Bueffr A溶液重悬沉淀，加入SKL（N-十二烷基肌氨酸钠）室温静置2 h，使其沉淀缓慢溶解。4 ℃ 10 000 rpm/min离心10 min，弃沉淀，取上清，分别加入PEG 4000至2 %（w/v）、氧化型谷胱甘肽至l mM、还原型谷胱甘肽至2 mM，静置30 min 2 h，转至处理好的透析袋中，于0.01 M TE溶液（pH8.0）中透析2 d～3 d，取出用紫外风光光度计测OD260和OD280，计算蛋白浓度。提取蛋白立即使用或分装，-20 ℃或-80 ℃保存备用。
1.5 ELISA方法的建立
1.5.1 抗原最佳包被浓度与血清最佳稀释度的确定
取纯化的重组鸽新城疫F蛋白用包被稀释液做1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256稀释；阴性、阳性血清用封闭液分别做1∶100、1∶200、1∶400、1∶800稀释后，用方阵法确定抗原及对照血清的最适工作浓度。
1.5.2 间接ELISA各工作条件的摸索
确定抗原与待检血清作用时间：采用抗原最佳包被浓度包被微量反应板，封闭，抗原与待检血清作用时间分别为40 min、 60 min、80 min，其它条件相同，计算P/N值，确定抗原与待检血清最佳作用时间。
确定待检血清与酶标二抗作用时间：采用抗原最佳包被浓度包被微量反应板，封闭，待检血清与酶标二抗作用时间分别为 40 min、60 min、80 min，其它条件相同，计算P/N值，确定待检血清与酶标二抗最佳作用时间。
确定底物显色液最佳作用时间：采用抗原最佳包被浓度包被微量反应板，其它条件相同，加入OPD-H2O2底物显色液，每孔加100 μL，室温避光显色10 min、15 min、20 min时分别用 2 mol/L H2SO4每孔50 μL终止反应，计算P/N值，确定底物显色液最佳作用时间。 1.6 临床样本的检测
应用建立的ELISA检测方法对实验室保存的35份鸽Ⅰ型副粘病毒阳性血清和12份阴性血清进行检测，确定其特异性和敏感性。
2 结果
2.1 融合蛋白的表达与纯化
对F蛋白进行诱导表达，超声处理后，取上清和沉淀分别进行SDS-PAGE电泳，结果发现目的蛋白表达于沉淀中，融合蛋白大小约为60 kD，而上清中则无目的条带出现，表明诱导产生的融合蛋白主要以不溶性的包涵体形式存在，结果如见图1所示。
2.2 纯化蛋白的浓度
以0.01 M TE溶液做空白对照，将纯化的重组蛋白用紫外分光光度计测定浓度，结果如下：
OD280=0.786
OD260=0.497
带入公式样本蛋白质含量（mg/mL）= （1.45×OD280-0.74×OD260）×稀释倍数
计算得蛋白浓度为：0.772 mg/mL
2.3 ELISA方法的建立
2.3.1 最佳抗原及抗体工作浓度的确定
用纯化的重组鸽新城疫F蛋白包被ELISA平板，采用方阵法确定蛋白的最佳包被浓度及阳性血清的最佳稀释倍数，结果见下表1。
从上表的F-ELISA方阵滴定结果表明，出 OD492 nm值为0.978时，P/N最大，此时F蛋白及阳性血清的稀释度为最佳工作条件，抗原最佳包被浓度为1∶128，即0.6 μg/孔 的抗原包被量。血清最佳稀释度为1∶400。
2.3.2 一抗作用时间的确定
测出抗原与阳性血清及阴性血清在不同时间作用的OD492 nm值（抗原、血清均采用最佳工作浓度），取平均值，计算P/N，结果见表2，当阴阳性血清与酶标二抗作用时间为60 min时，P/N值最大，故选择与一抗作用时间为60 min。
2.3.3 二抗作用时间的确定
测出阳性血清及阴性血清与二抗在不同时间作用的OD492 nm值（抗原、血清均采用最佳工作），取平均值，计算P/N，结果见表3，当阴、阳性血清与酶标二抗作用时间为60 min时，P/N值最大，故选择与二抗作用时间为60 min。
2.3.4 底物显色液作用时间的确定
抗原、血清均采用最佳工作浓度，其它条件相同，测出阳性血清、阴性血清与底物显色液不同作用时间的OD492 nm值，取平均值，计算 P/N，结果见表4，当底物液时间为15 min时， P/N值最大，且阳性OD492 nm>0.2，故选择底物液作用时间为15 min。
2.4 临床样本的检测
应用建立的间接ELISA检测方法对实验室保存的35份阳性血清和12阴性血清进行检测，结果35份阳性血清应尽量的ELISA方法检测出阳性34份，准确率达到97.14 %，对12份阴性血清用ELISA方法检测结果全部为阴性，表明建立的间接ELISA检测方法具有较好的特异性和敏感性。
3 讨论与结论
酶联免疫吸附试验（ELISA）方法自建立至今已经广泛应用于各种细菌、病毒、寄生虫病的诊断以及在肿瘤学、免疫病理学等方面已广泛应用，该方法具有灵敏、准确、简便等优势。ELISA是将抗原抗体反应的特异性和酶对底物的高效催化性结合起来的一种敏感性很高的检测方法。间接ELISA是将已知的定量抗原吸附在反应板上，加入待测抗体，形成抗原抗体复合物，洗涤除去杂蛋白后加入酶标记的二抗，洗涤除去未吸附或多余的二抗，加入底物显色，以显色反应推知抗体量。该方法可以非常灵敏地检测血清中的IgG抗体。
本实验选用了PGEX-4T-1融合表达载体后，用PITG诱导，SDS-APGE凝胶电泳分析显示，F蛋白为60 KDa左右，诱导产物在预计大小处有表达蛋白产生，是F蛋白片段34 KDa，再加上PGEX-4T-1载体自带的26 Kda的GST标签，所以F蛋白片段在PGEX-4T-1/BL21（DE3）中得到了稳定的表达，通过对表达产物处理后进行SDS-APGE电泳后发现，表达的蛋白都位于包涵体中。
把表达的蛋白进行纯化作为包被抗原，建立间接ELISA检测方法，用方阵法确定其最佳反应条件：抗原1∶128稀释即抗原包被量为0.6 μg/孔，血清1∶400稀释，与一抗的最佳作用时间为60 min，与酶标二抗的最佳作用时间为60 min，底物显色的最佳作用时间为15 min。并把建立的方法进行了临床样本的检测，具有较好的特异性和敏感性，为鸽新城疫的诊断、防治制剂的研制奠定了基础。□□