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摘要：【目的】對芒果维管束锌指蛋白（VOZ）基因家族成员进行鉴定并对其生物信息学进行分析，为深入探究芒果VOZ转录因子在免疫反应中的生物学功能提供理论参考。【方法】基于芒果全基因组数据，利用生物信息学方法鉴定芒果VOZ转录因子基因家族成员，并分析其理化性质、保守基序及系统发育进化。通过实时荧光定量PCR检测胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）与细菌性黑斑病菌（Xanthomonas citri pv. mangiferaeindicae）侵染下的相对表达量。【结果】从芒果全基因组中间鉴定出4个VOZ转录因子家族成员，分别为MiVOZ1、MiVOZ2、MiVOZ3和MiVOZ4基因，开放阅读框（ORF）长度为1290～1482 bp，编码氨基酸数量为429～493，蛋白分子量为47.26～54.96 kD，等电点（pI）为5.47～6.00，亲/疏水性指数为-0.663～-0.552，不稳定指数为37.66～50.86，二级结构均以无规则卷曲和α-螺旋为主要元件。芒果和其他9个物种的49个VOZ蛋白聚为十个分支，在ClassⅠ中3个MiVOZs蛋白（MiVOZ2、MiVOZ3和MiVOZ4）与苹果、木薯和毛果杨聚类在一起，在Class Ⅴ中MiVOZ1与拟南芥、木薯和毛果杨聚类在一起。在胶孢炭疽菌侵染下，仅MiVOZ1和MiVOZ2基因的相对表达量较对照显著升高（P<0.05，下同）;在细菌性黑斑病菌侵染下，仅MiVOZ2基因的相对表达量较对照显著升高。【结论】芒果VOZ转录因子在抵御不同病原菌侵染的生物学功能方面存在差异，其中MiVOZ2基因在抵御胶孢炭疽病和细菌性黑斑病侵染的免疫反应中具有相似生物学功能，属于正调节因子。
关键词： 芒果;VOZ转录因子;生物信息学;实时荧光定量PCR
中图分类号： S667.703.6 文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2021）07-1762-09
Identification and bioinformatics analysis of VOZ transcription factor gene family members in Mangifera indica
LIU Zhi-xin1，2， SUN Yu2， YE Zi2， LUO Rui-xiong3， LI Zhong1， PU Jin-ji2*， ZHANG He2*
（1College of Agricultural，Guizhou University，Guiyang 550025， China; 2Environment and Plant Protection Institute，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/Key Laboratory of Integrated Pest Management on Tropical Crops，Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Haikou 571101， China; 3Tropical Crops Genetic Resources Institute，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou 571101， China）
Abstract：【Objective】By identifying the members of the mango vascular plant one-zinc finger protein（VOZ）gene family members and conducting bioinformatics analysis on them，it laid a foundation for exploring the biological functions of mango VOZ transcription factors in immune response. 【Method】Based on mango genome-wide data， bioinformatics methods were used to identify members of the mango VOZ transcription factor gene family members， and to analyze their physical and chemical properties， conservative motifs， and phylogenetic evolution.Real-time fluorescent quantitative PCR was used to detect the relative expression levels of Colletotrichum gloeosporioides and Xanthomonas citri pv. mangi-feraeindicae infection. 【Result】Four VOZ transcription factor family members were identified from the whole mango genome， namely MiVOZ1， MiVOZ2， MiVOZ3 and MiVOZ4 genes. The open reading frame（ORF） length was 1290-1482 bp， the number of encoded amino acids was 429-493， and the protein molecular weight was 47.26-54.96 kD， isoelectric point（pI） was 5.47-6.00， affinity/hydrophobicity index was -0.663 to -0.552， instability index was 37.66-50.86， secon-dary structure was mainly random coil and α-helix element. Mango and 49 VOZ proteins of 9 other species were clustered into ten major groups. In Class Ⅰ， three MiVOZs proteins（MiVOZ2， MiVOZ3， MiVOZ4） were clustered with apple， cassava and Populus trichocarpa. In Class Ⅴ， MiVOZ1 was clustered with Arabidopsis thaliana， cassava and P.trichocarpa. Under the infection of C. gloeosporioides， only the relative expression of MiVOZ1 and MiVOZ2 genes were significantly higher than the control（P<0.05， the same below）; under X. citri pv. mangiferaeindicae infection， only the relative expression of MiVOZ2 gene was significantly higher than that of the control. 【Conclusion】Mango VOZ transcription factors have different biological functions in resisting different pathogens. Among them， the MiVOZ2 gene has similar biological functions in the immune response to resist the infection of C. gloeosporioides and X. citri pv. mangiferaeindicae， and is a positive regulator. Key words： mango; VOZ transcription factor; bioinformatics; real-time fluorescence quantitative PCR
Foundation item： National Key Research and Development Program of China（2019YFD1000504）;Central Public-interest Scientific Institution Basal Research Fund for Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences（1630042021022， 1630042017019）
0 引言
【研究意义】芒果（Mangifera indica）为漆树科芒果属果树。高质量的芒果参考基因组测序数据可促进芒果的分子育种和进化研究，而芒果基因组的高度杂合给芒果基因组组装带来巨大的挑战（Gao et al.，2018;Wang et al.，2020b）。近年来，芒果的细胞遗传学数据（Mukherjee，1950）、遗传图谱（Luo et al.，2016;Kuhn et al.，2017）和转录组数据（Sivan-kalyani et al.，2016;Tafolla-Arellano et al.，2017）的公开有利于芒果基因组的研究。目前不同品种芒果全基因组工作已相继完成（Li et al.，2020a;Wang et al.，2020a），为芒果全基因组的生物信息分析及功能基因挖掘打下基础。研究发现，芒果于3300万年前发生全基因组复制事件（Wang et al.，2020b），与其他陆地植物一样均保留下来特异性转录因子。其中，维管束锌指蛋白（Vascular plant one-zinc finger protein，VOZ）得以保留，参与植物生长发育和免疫反应（安礼渝等，2015;Koguchi et al.，2017;Wang et al.，2020a）。因此，对芒果VOZ转录因子家族进行生物信息学分析及其在病原菌侵染过程中的表达分析，筛选参与免疫反应的VOZ转录因子，对深入了解芒果VOZ在免疫反應的作用机制具有重要意义。【前人研究进展】VOZ作为植物中特有的转录因子家族，是在植物各生长发育阶段中发挥重要调节作用的转录因子之一。Mitsuda等（2004）通过构建拟南芥的酵母单杂交cDNA文库，筛选鉴定出2种通过与拟南芥V-PPase基因（AVP1）顺式作用区域相互作用从而调控花粉发育过程的新VOZ转录因子，并将其命名为AtVOZ1和AtVOZ2，均含有结构域A（Domain-A）和结构域B（Domain-B），其中结构域B包含锌配位基序和基本区域，为DNA结合区域。Nakai等（2013b）证明拟南芥双突变体voz1voz2均表现出较高的干旱和冷冻耐受性，而对希金斯炭疽菌（Colletotrichum higginsianum）和丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）的抗性有所降低;Schwarzenbacher等（2020）证明拟南芥中VOZ1和VOZ2作为天冬氨酸tRNA合成酶IBI1的相互作用因子，在对抗活体营养型卵菌（Hyaloperonospora arabidopsidis）时通过抑制脱落酸（ABA）而诱导基因表达，证明拟南芥中VOZ基因参与植物免疫反应和非生物胁迫;水稻突变体voz2对Xanthomonas oryzae pv. oryzae（Xoo）的抗性明显增强（Cheong et al.，2013）;随后，Wang等（2020a）研究发现水稻OsVOZ1和OsVOZ2与E3泛素连接酶（AVRPIZ-T INTERACTING PROTEIN 10，APIP10）相互作用可增强植株对稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）的抗性。其他大量研究也证实VOZ在水稻（Zhou et al.，2009;Ganie et al.，2020）、拟南芥（Yasui et al.，2012;Yasui and Kohchi，2014;Celesnik et al.，2013;Luo et al.，2020）、苔藓植物（高贝等，2014）、菠萝（夏杨等，2018）等植物生长发育和免疫反应中发挥重要的作用。【本研究切入点】虽然芒果全基因组数据已公开，但鲜见有关芒果VOZ转录因子基因家族成员的研究报道。【拟解决的关键问题】基于芒果全基因组数据，利用生物信息学软件鉴定分析芒果VOZ转录因子基因家族成员，并通过实时荧光定量PCR检测病原菌侵染过程中的表达水平，筛选出响应病原菌侵染的VOZ转录因子家族基因，为芒果VOZ转录因子免疫机制打下理论基础，也为芒果抗性育种提供基因资源。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
供试材料为1年生贵妃芒果幼苗，种植于农业农村部儋州市芒果种植资源圃的温室。主要试剂：RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒、FirstKing cDNA第一链合成试剂盒购自天根生化科技有限公司; PrimeTaqTM（LA TaqTM Version 2.0）试剂盒购自宝生物工程大连有限公司;UltraSYBR Mixture（Low ROX）试剂盒购自北京康为世纪有限公司;其他生化试剂均购自生工生物工程（上海）股份有限公司。主要设备仪器：Biometra PCR仪（德国）;Fusion Fx VILBER LOURMAT凝胶成像系统（法国）;ABI QuantStudio 6 Flex实时荧光定量PCR仪（美国）;TU-1810紫外可见分光光度计（普析通用，北京）
1. 2 VOZ转录因子基因家族成员鉴定
从NCBI获取芒果全基因组数据及其转录组数据（PRJNA487154）。从PlantTFDB v5.0下载拟南芥、玉米、水稻、苹果、毛果杨、番茄、木薯、菠萝和烟草等9个物种的VOZ转录因子家族蛋白的氨基酸序列，并以拟南芥VOZ转录因子家族蛋白序列为参考序列，在芒果基因组数据库中进行BLASTp比对（E值为10-5），最后从在线网站Pfam和CDD搜索获取芒果VOZ蛋白序列结构域，筛选出具有特征性结构域的序列。 1. 3 VOZ转录因子基因家族生物信息學分析
利用ExPASy-ProtParam Tool对芒果VOZ转录因子成员进行理化性质预测。使用生物信息学在线搜索程序MEME（http：//meme-suite.org/index.html）鉴别芒果VOZ转录因子家族蛋白的保守基序（基序重复数量设为“any”，预测基序的数量设为5个）。
1. 4 多序列比对及系统进化树构建
利用ClustalX软件对芒果与模式植物（拟南芥、水稻、烟草）、双子叶植物（苹果、毛果杨、木薯、番茄、）和单子叶植物（菠萝、玉米）的VOZ转录因子结构域序列进行多序列比对，利用MEGA 5.0中的邻接法（Neighbor-joining，NJ）构建系统发育进化树（Bootstrap设1000次重复），对芒果VOZ转录因子基因家族成员进行分类，分析其进化关系。
1. 5 基因克隆
以芒果全基因组序列中鉴定获得的候选VOZ转录因子家族基因序列，利用Primer Primer 5.0设计基因开放阅读框（ORF）引物及实时荧光定量PCR引物（表1）。采用RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取芒果叶片的总RNA，测定其浓度，并采用FirstKing cDNA第一链合成试剂盒反转录生成第一链cDNA。利用高保真酶pfu酶进行PCR扩增。反应体系（25.0 μL）：2×rTaq 12.5 μL，10 μmol/L正、反引物各1.0 μL，cDNA模板1.0 μL，ddH2O补足至25.0 μL。扩增程序：95 ℃预变性10 min，95 ℃ 15 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，进行30个循环;72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。取10 μL PCR产物用于1%琼脂凝胶电泳检测。
1. 6 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）
用浓度为2×106个/mL的胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides，Cg）分生孢子悬浮液对贵妃芒果苗嫩叶进行均匀喷雾，在处理0（对照）、3、6、12、24、48和72 h时剪取嫩叶片，液氮速冻，-80 ℃保存备用;用浓度为2×107 CFU/mL的细菌性黑斑病菌（Xanthomonas citri pv. mangiferaeindicae，Xcm）悬浮液对贵妃芒果苗新抽的嫩叶进行均匀喷雾，在处理0（对照）、3、6和12 h时剪取嫩叶片，液氮速冻， -80 ℃保存备用。采用RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取芒果嫩叶的总RNA，测定其浓度，并利用FirstKing cDNA第一链合成试剂盒反转录生成第一链cDNA。
以QuantStudio 6 Flex实时荧光定量PCR仪检测不同病原菌侵染下芒果VOZ家族基因的相对表达量，反应体系（20.0 μL）和扩增程序参照UltraSYBR Mixture试剂盒进行。试验设3次重复，每次设3个复孔。以芒果Mi18S作为内参基因，以侵染0 h的相对表达量为对照。
1. 7 统计分析
使用Excel 2019和SPSS 26.0进行数据整理及分析。运用2-△△Ct法计算基因的相对表达量，用Tukey’s HSD法进行显著性分析（P<0.05）。基因相对表达量柱形图使用Excel 2019进行绘制。
2 结果与分析
2. 1 芒果VOZ转录因子基因家族鉴定及扩增结果
从芒果全基因组中间鉴定出4个含有典型结构域（Domain-A和Domain-B）的VOZ转录因子基因家族成员，分别为MiVOZ1、MiVOZ2、MiVOZ3和MiVOZ4基因。其中，MiVOZ1基因包含一个长度为1407 bp的开放阅读框（ORF），编码468个氨基酸残基;MiVOZ2包含一个长度为1482 bp的ORF，编码493个氨基酸残基;MiVOZ3包含一个长度为1290 bp的ORF，编码429个氨基酸残基;MiVOZ4包含一个长度为1461 bp的ORF，编码486个氨基酸残基。以芒果叶片cDNA为模板，用高保真酶pfu酶进行PCR扩增，结果发现，扩增产物单一且清晰，与预期大小相符，而未加cDNA的阴性对照则无清晰的单一条带（图1）。
2. 2 生物信息学分析结果
由表2可知，MiVOZ1、MiVOZ2和MiVOZ4基因外显子数均为4个，MiVOZ3基因外显子数为5个;MiVOZs蛋白氨基酸数量为429～493个，分子量为47.26～54.96 kD，其中以MiVOZ2蛋白最大，MiVOZ3蛋白最小;等电点（pI）为5.47～6.00，其中以MiVOZ1蛋白最大，MiVOZ3蛋白最小; MiVOZ1～MiVOZ4蛋白的亲/疏水性指数为-0.663～-0.552，均为亲水性蛋白;不稳定指数为37.66～50.86，其中MiVOZ1、MiVOZ2和MiVOZ4为不稳定蛋白，MiVOZ3为稳定蛋白。
2. 3 二级结构预测预测结果
对MiVOZs蛋白进行二级结构预测，结果如图2所示。MiVOZ1蛋白二级结构的主要元件是无规则卷曲（53.63%）和α-螺旋（31.84%），其次是延伸链（10.47%）和β-转角（4.06%）;MiVOZ2蛋白二级结构的主要元件为无规则卷曲（52.14%）和α-螺旋（35.29%），其次是延伸链（9.53%）和β-转角（3.04%）;MiVOZ3蛋白二级结构的主要元件是无规则卷曲（54.78%）和α-螺旋（31.70%），其次是延伸链（10.49%）和β-转角（3.03%）;MiVOZ4蛋白二级结构的主要元件是无规则卷曲（55.56%）和α-螺旋（30.45%），其次是延伸链（10.49%）和β-转角（3.50%）。 2. 4 系统发育进化分析结果
基于芒果（4個）、拟南芥（3个）、水稻（2个）、烟草（8个）、苹果（5个）、毛果杨（8个）、木薯（5个）、番茄（2个）、菠萝（2个）和玉米（10个）的VOZ氨基酸序列构建系统发育进化树，结果如图3所示。49个VOZ蛋白聚为十个分支（ClassⅠ～Class Ⅹ），MiVOZ1～MiVOZ4分别存在于Class Ⅰ和Class Ⅴ中，这两个分支中含有毛果杨、木薯和苹果VOZ蛋白，且Class Ⅴ还包含1个拟南芥VOZ蛋白。其中，MiVOZ1与拟南芥VOZ蛋白聚类在Class Ⅴ的一个小分支中;MiVOZ2、MiVOZ3和MiVOZ4与苹果VOZ蛋白聚类在一个较小的分支，再与毛果杨和木薯聚类在ClassⅠ。综上所述，MiVOZs蛋白与毛果杨、木薯、苹果和拟南芥的VOZ蛋白关系较近。
2. 5 保守基序分析结果
对MiVOZs蛋白进行保守基序分析，结果如图4所示。当E-value<4.6e-032时，4个MiVOZs蛋白共有5个相对保守且典型的基序（Motif1～Motif5）。Motif1含有50个氨基酸，以MiVOZ2、MiVOZ3和MiVOZ4蛋白的Motif1序列一致;Motif2含有29个氨基酸，MiVOZ1蛋白的Motif2与其他3个MiVOZs蛋白存在明显序列差异，MiVOZ3和MiVOZ4的Motif2序列一致，与MiVOZ2的Motif2仅有1个氨基酸的差异;Motif3含有38个氨基酸，MiVOZ3与MiVOZ4的Motif3序列完全一致，与MiVOZ2的Motif3仅有2个氨基酸的差异，而MiVOZ1与MiVOZ2的Motif3存在9个氨基酸的差异;Motif4含有50个氨基酸，MiVOZ2、MiVOZ3和MiVOZ4蛋白的Motif1序列完全一致;Motif5含有50个氨基酸，MiVOZ3和MiVOZ4蛋白的Motif5序列完全一致。
2. 6 胶孢炭疽菌侵染下芒果VOZ家族基因的表达分析结果
利用实时荧光定量PCR检测胶孢炭疽菌侵染下芒果叶片中MiVOZs基因的相对表达量，结果如图5所示。与侵染后0 h（对照）相比，MiVOZ1和MiVOZ2基因在其他侵染时间点的相对表达量均显著升高（P<0.05，下同），而MiVOZ3和MiVOZ4基因的相对表达量均上升，但未达显著水平（P>0.05，下同）。表明MiVOZ1和MiVOZ2基因积极响应胶孢炭疽菌的侵染。
2. 7 细菌性黑斑病菌侵染下芒果VOZ家族基因的表达分析结果
利用实时荧光定量PCR检测细菌性黑斑病菌侵染下芒果叶片中MiVOZs基因的相对表达量，结果如图6所示。侵染后0～12 h，MiVOZ2基因的相对表达量呈先升高后降低的变化趋势，其他时间点的相对表达量均与对照存在显著差异，在侵染后6 h时达峰值;MiVOZ3和MiVOZ4基因整体呈略微上升的趋势，仅在侵染后12 h时与对照存在显著差异;MiVOZ1基因的相对表达量相对稳定，与对照无显著差异，表明MiVOZ2基因积极响应芒果细菌性黑斑病菌的侵染。
3 讨论
本研究对4个芒果VOZ转录因子基因家族成员进行生物信息学分析，结果发现MiVOZ1、MiVOZ2、MiVOZ3和MiVOZ4蛋白的等电点均小于6.00，平均亲/疏水性指数均小于0，说明MiVOZs为弱酸性的亲水性蛋白，由此可知MiVOZs蛋白的基本理化性质无明显差异。此外，MiVOZs蛋白二级结构的主要元件为无规则卷曲，与齿肋赤藓ScVOZ1蛋白（高贝等，2014）和菠萝AcoVOZ2蛋白（夏杨等，2018）相似。与拟南芥、水稻、番茄和菠萝相比，芒果的VOZ转录因子基因家族成员数量相对较多，可能是由于芒果中的全基因组重复事件（WGD）所致（Gao et al.，2018;Wang et al.，2020a）。本研究构建的系统发育进化树显示，芒果和其他9个物种的49个VOZ蛋白聚为十个分支，在ClassⅠ中3个MiVOZs蛋白（MiVOZ2、MiVOZ3和MiVOZ4）与苹果、木薯和毛果杨的VOZ蛋白聚类在一起，在Class Ⅴ中MiVOZ1与拟南芥、木薯和毛果杨聚类在一起，推测芒果与苹果和木薯的亲缘关系较近;MiVOZs蛋白可与双子叶植物拟南芥、苹果、木薯和毛果杨的VOZ蛋白聚类在一起，不与单子叶植物玉米和水稻的VOZ蛋白聚类在一起。该结论类似于大豆GmVOZ1G可与双子叶植物拟南芥VOZ蛋白聚类，而不能与单子叶植物水稻、玉米和粟等VOZ蛋白聚类在一起（Li et al.，2020b）。可见，单子叶植物类群和双子叶植物类群的VOZ转录因子存在明显的分化。不仅如此，不同VOZ家族成员含有高度保守的结构域，与其具有相同和相似的调控功能密切相关（Koguchi et al.，2017）。本研究发现，4个MiVOZs蛋白的保守基序中，以Motif1～Motif5较为典型，其中，MiVOZ2、MiVOZ3和MiVOZ4蛋白的这5个基序较保守，尤其是MiVOZ3和MiVOZ4高度保守;MiVOZ1蛋白与上述3个MiVOZs蛋白基序明显不同，系统发育进化树分析结果也证明这一点，说明基序相似性也能反映序列间的亲缘关系。
胶孢炭疽病和细菌性黑斑病是危害芒果较严重的病害之一。本研究利用qRT-PCR检测MiVOZs基因在胶孢炭疽菌和细菌性黑斑病菌侵染下的表达情况，结果显示，MiVOZ1和MiVOZ2基因在胶孢炭疽菌侵染下相对表达量较对照显著升高，MiVOZ2基因在细菌性黑斑病菌侵染下表达量较对照也显著升高，表明部分芒果VOZ转录因子家族成员参与抵御真菌和细菌病原体侵染。Nakai等（2013a）研究也发现，在拟南芥VOZ转录因子家族基因高表达可提高对真菌和细菌病原体的抗性。可见，不同物种的VOZ转录因子家族成员参与植株的免疫反应。此外，内源信号和外源信号刺激可使植物免疫系统对病原体的攻击作出更快速的免疫反应，如Schwarzenbacher等（2020）研究发现，AtVOZ1和AtVOZ2在BIB1-VOZ信号模块通过病原体诱导的ABA信号传导至细胞壁后作出防御反应，同时抑制非生物应激反应基因;Cheong等（2013）研究发现，水稻OsVOZ2对Xanthomonas oryzae pv. oryzae（Xoo）具有明显的抗性。由于MiVOZ2基因在胶孢炭疽菌和细菌性黑斑病菌侵染下的相对表达量均显著升高，推测MiVOZ2基因在芒果对不同病原菌抗性中具有相似的调控功能，属于正调节因子。此外，有研究发现，植物VOZ转录因子是应对生物胁迫、高温胁迫及高盐胁迫的正调节因子，也是寒冷胁迫和干旱胁迫的负调节因子（Nakai et al.，2013a，2013b;Kim et al.，2017;Prasad et al.，2016，2018）。Wang等（2020a）研究了水稻VOZ转录因子介导的水稻抗稻瘟病新机制，结果发现OsVOZ1和OsVOZ2协同负调控水稻细胞死亡和基础抗性，且二者能与抗病蛋白Piz-t相互作用，若抑制OsVOZ1/OsVOZ2表达水平会降低Piz-t的转录水平、蛋白积累及对非亲和小种的稻瘟病抗性，证实OsVOZ1和OsVOZ2可调控Piz-t介导的免疫反应，为水稻抗病育种提供分子理论基础，也为今后深入探究芒果VOZ转录因子的免疫机制提供理论参考。 4 結论
芒果VOZ转录因子在抵御不同病原菌侵害的生物学功能方面存在差异，其中MiVOZ2基因在抵御胶孢炭疽病和细菌性黑斑病侵染的免疫反应中具有相似生物学功能，属于正调节因子。
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（責任编辑 陈 燕）
关键词： 芒果;VOZ转录因子;生物信息学;实时荧光定量PCR
中图分类号： S667.703.6 文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2021）07-1762-09
Identification and bioinformatics analysis of VOZ transcription factor gene family members in Mangifera indica
LIU Zhi-xin1，2， SUN Yu2， YE Zi2， LUO Rui-xiong3， LI Zhong1， PU Jin-ji2*， ZHANG He2*
（1College of Agricultural，Guizhou University，Guiyang 550025， China; 2Environment and Plant Protection Institute，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/Key Laboratory of Integrated Pest Management on Tropical Crops，Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Haikou 571101， China; 3Tropical Crops Genetic Resources Institute，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou 571101， China）
Abstract：【Objective】By identifying the members of the mango vascular plant one-zinc finger protein（VOZ）gene family members and conducting bioinformatics analysis on them，it laid a foundation for exploring the biological functions of mango VOZ transcription factors in immune response. 【Method】Based on mango genome-wide data， bioinformatics methods were used to identify members of the mango VOZ transcription factor gene family members， and to analyze their physical and chemical properties， conservative motifs， and phylogenetic evolution.Real-time fluorescent quantitative PCR was used to detect the relative expression levels of Colletotrichum gloeosporioides and Xanthomonas citri pv. mangi-feraeindicae infection. 【Result】Four VOZ transcription factor family members were identified from the whole mango genome， namely MiVOZ1， MiVOZ2， MiVOZ3 and MiVOZ4 genes. The open reading frame（ORF） length was 1290-1482 bp， the number of encoded amino acids was 429-493， and the protein molecular weight was 47.26-54.96 kD， isoelectric point（pI） was 5.47-6.00， affinity/hydrophobicity index was -0.663 to -0.552， instability index was 37.66-50.86， secon-dary structure was mainly random coil and α-helix element. Mango and 49 VOZ proteins of 9 other species were clustered into ten major groups. In Class Ⅰ， three MiVOZs proteins（MiVOZ2， MiVOZ3， MiVOZ4） were clustered with apple， cassava and Populus trichocarpa. In Class Ⅴ， MiVOZ1 was clustered with Arabidopsis thaliana， cassava and P.trichocarpa. Under the infection of C. gloeosporioides， only the relative expression of MiVOZ1 and MiVOZ2 genes were significantly higher than the control（P<0.05， the same below）; under X. citri pv. mangiferaeindicae infection， only the relative expression of MiVOZ2 gene was significantly higher than that of the control. 【Conclusion】Mango VOZ transcription factors have different biological functions in resisting different pathogens. Among them， the MiVOZ2 gene has similar biological functions in the immune response to resist the infection of C. gloeosporioides and X. citri pv. mangiferaeindicae， and is a positive regulator. Key words： mango; VOZ transcription factor; bioinformatics; real-time fluorescence quantitative PCR
Foundation item： National Key Research and Development Program of China（2019YFD1000504）;Central Public-interest Scientific Institution Basal Research Fund for Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences（1630042021022， 1630042017019）
0 引言
【研究意义】芒果（Mangifera indica）为漆树科芒果属果树。高质量的芒果参考基因组测序数据可促进芒果的分子育种和进化研究，而芒果基因组的高度杂合给芒果基因组组装带来巨大的挑战（Gao et al.，2018;Wang et al.，2020b）。近年来，芒果的细胞遗传学数据（Mukherjee，1950）、遗传图谱（Luo et al.，2016;Kuhn et al.，2017）和转录组数据（Sivan-kalyani et al.，2016;Tafolla-Arellano et al.，2017）的公开有利于芒果基因组的研究。目前不同品种芒果全基因组工作已相继完成（Li et al.，2020a;Wang et al.，2020a），为芒果全基因组的生物信息分析及功能基因挖掘打下基础。研究发现，芒果于3300万年前发生全基因组复制事件（Wang et al.，2020b），与其他陆地植物一样均保留下来特异性转录因子。其中，维管束锌指蛋白（Vascular plant one-zinc finger protein，VOZ）得以保留，参与植物生长发育和免疫反应（安礼渝等，2015;Koguchi et al.，2017;Wang et al.，2020a）。因此，对芒果VOZ转录因子家族进行生物信息学分析及其在病原菌侵染过程中的表达分析，筛选参与免疫反应的VOZ转录因子，对深入了解芒果VOZ在免疫反應的作用机制具有重要意义。【前人研究进展】VOZ作为植物中特有的转录因子家族，是在植物各生长发育阶段中发挥重要调节作用的转录因子之一。Mitsuda等（2004）通过构建拟南芥的酵母单杂交cDNA文库，筛选鉴定出2种通过与拟南芥V-PPase基因（AVP1）顺式作用区域相互作用从而调控花粉发育过程的新VOZ转录因子，并将其命名为AtVOZ1和AtVOZ2，均含有结构域A（Domain-A）和结构域B（Domain-B），其中结构域B包含锌配位基序和基本区域，为DNA结合区域。Nakai等（2013b）证明拟南芥双突变体voz1voz2均表现出较高的干旱和冷冻耐受性，而对希金斯炭疽菌（Colletotrichum higginsianum）和丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）的抗性有所降低;Schwarzenbacher等（2020）证明拟南芥中VOZ1和VOZ2作为天冬氨酸tRNA合成酶IBI1的相互作用因子，在对抗活体营养型卵菌（Hyaloperonospora arabidopsidis）时通过抑制脱落酸（ABA）而诱导基因表达，证明拟南芥中VOZ基因参与植物免疫反应和非生物胁迫;水稻突变体voz2对Xanthomonas oryzae pv. oryzae（Xoo）的抗性明显增强（Cheong et al.，2013）;随后，Wang等（2020a）研究发现水稻OsVOZ1和OsVOZ2与E3泛素连接酶（AVRPIZ-T INTERACTING PROTEIN 10，APIP10）相互作用可增强植株对稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）的抗性。其他大量研究也证实VOZ在水稻（Zhou et al.，2009;Ganie et al.，2020）、拟南芥（Yasui et al.，2012;Yasui and Kohchi，2014;Celesnik et al.，2013;Luo et al.，2020）、苔藓植物（高贝等，2014）、菠萝（夏杨等，2018）等植物生长发育和免疫反应中发挥重要的作用。【本研究切入点】虽然芒果全基因组数据已公开，但鲜见有关芒果VOZ转录因子基因家族成员的研究报道。【拟解决的关键问题】基于芒果全基因组数据，利用生物信息学软件鉴定分析芒果VOZ转录因子基因家族成员，并通过实时荧光定量PCR检测病原菌侵染过程中的表达水平，筛选出响应病原菌侵染的VOZ转录因子家族基因，为芒果VOZ转录因子免疫机制打下理论基础，也为芒果抗性育种提供基因资源。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
供试材料为1年生贵妃芒果幼苗，种植于农业农村部儋州市芒果种植资源圃的温室。主要试剂：RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒、FirstKing cDNA第一链合成试剂盒购自天根生化科技有限公司; PrimeTaqTM（LA TaqTM Version 2.0）试剂盒购自宝生物工程大连有限公司;UltraSYBR Mixture（Low ROX）试剂盒购自北京康为世纪有限公司;其他生化试剂均购自生工生物工程（上海）股份有限公司。主要设备仪器：Biometra PCR仪（德国）;Fusion Fx VILBER LOURMAT凝胶成像系统（法国）;ABI QuantStudio 6 Flex实时荧光定量PCR仪（美国）;TU-1810紫外可见分光光度计（普析通用，北京）
1. 2 VOZ转录因子基因家族成员鉴定
从NCBI获取芒果全基因组数据及其转录组数据（PRJNA487154）。从PlantTFDB v5.0下载拟南芥、玉米、水稻、苹果、毛果杨、番茄、木薯、菠萝和烟草等9个物种的VOZ转录因子家族蛋白的氨基酸序列，并以拟南芥VOZ转录因子家族蛋白序列为参考序列，在芒果基因组数据库中进行BLASTp比对（E值为10-5），最后从在线网站Pfam和CDD搜索获取芒果VOZ蛋白序列结构域，筛选出具有特征性结构域的序列。 1. 3 VOZ转录因子基因家族生物信息學分析
利用ExPASy-ProtParam Tool对芒果VOZ转录因子成员进行理化性质预测。使用生物信息学在线搜索程序MEME（http：//meme-suite.org/index.html）鉴别芒果VOZ转录因子家族蛋白的保守基序（基序重复数量设为“any”，预测基序的数量设为5个）。
1. 4 多序列比对及系统进化树构建
利用ClustalX软件对芒果与模式植物（拟南芥、水稻、烟草）、双子叶植物（苹果、毛果杨、木薯、番茄、）和单子叶植物（菠萝、玉米）的VOZ转录因子结构域序列进行多序列比对，利用MEGA 5.0中的邻接法（Neighbor-joining，NJ）构建系统发育进化树（Bootstrap设1000次重复），对芒果VOZ转录因子基因家族成员进行分类，分析其进化关系。
1. 5 基因克隆
以芒果全基因组序列中鉴定获得的候选VOZ转录因子家族基因序列，利用Primer Primer 5.0设计基因开放阅读框（ORF）引物及实时荧光定量PCR引物（表1）。采用RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取芒果叶片的总RNA，测定其浓度，并采用FirstKing cDNA第一链合成试剂盒反转录生成第一链cDNA。利用高保真酶pfu酶进行PCR扩增。反应体系（25.0 μL）：2×rTaq 12.5 μL，10 μmol/L正、反引物各1.0 μL，cDNA模板1.0 μL，ddH2O补足至25.0 μL。扩增程序：95 ℃预变性10 min，95 ℃ 15 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，进行30个循环;72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。取10 μL PCR产物用于1%琼脂凝胶电泳检测。
1. 6 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）
用浓度为2×106个/mL的胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides，Cg）分生孢子悬浮液对贵妃芒果苗嫩叶进行均匀喷雾，在处理0（对照）、3、6、12、24、48和72 h时剪取嫩叶片，液氮速冻，-80 ℃保存备用;用浓度为2×107 CFU/mL的细菌性黑斑病菌（Xanthomonas citri pv. mangiferaeindicae，Xcm）悬浮液对贵妃芒果苗新抽的嫩叶进行均匀喷雾，在处理0（对照）、3、6和12 h时剪取嫩叶片，液氮速冻， -80 ℃保存备用。采用RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取芒果嫩叶的总RNA，测定其浓度，并利用FirstKing cDNA第一链合成试剂盒反转录生成第一链cDNA。
以QuantStudio 6 Flex实时荧光定量PCR仪检测不同病原菌侵染下芒果VOZ家族基因的相对表达量，反应体系（20.0 μL）和扩增程序参照UltraSYBR Mixture试剂盒进行。试验设3次重复，每次设3个复孔。以芒果Mi18S作为内参基因，以侵染0 h的相对表达量为对照。
1. 7 统计分析
使用Excel 2019和SPSS 26.0进行数据整理及分析。运用2-△△Ct法计算基因的相对表达量，用Tukey’s HSD法进行显著性分析（P<0.05）。基因相对表达量柱形图使用Excel 2019进行绘制。
2 结果与分析
2. 1 芒果VOZ转录因子基因家族鉴定及扩增结果
从芒果全基因组中间鉴定出4个含有典型结构域（Domain-A和Domain-B）的VOZ转录因子基因家族成员，分别为MiVOZ1、MiVOZ2、MiVOZ3和MiVOZ4基因。其中，MiVOZ1基因包含一个长度为1407 bp的开放阅读框（ORF），编码468个氨基酸残基;MiVOZ2包含一个长度为1482 bp的ORF，编码493个氨基酸残基;MiVOZ3包含一个长度为1290 bp的ORF，编码429个氨基酸残基;MiVOZ4包含一个长度为1461 bp的ORF，编码486个氨基酸残基。以芒果叶片cDNA为模板，用高保真酶pfu酶进行PCR扩增，结果发现，扩增产物单一且清晰，与预期大小相符，而未加cDNA的阴性对照则无清晰的单一条带（图1）。
2. 2 生物信息学分析结果
由表2可知，MiVOZ1、MiVOZ2和MiVOZ4基因外显子数均为4个，MiVOZ3基因外显子数为5个;MiVOZs蛋白氨基酸数量为429～493个，分子量为47.26～54.96 kD，其中以MiVOZ2蛋白最大，MiVOZ3蛋白最小;等电点（pI）为5.47～6.00，其中以MiVOZ1蛋白最大，MiVOZ3蛋白最小; MiVOZ1～MiVOZ4蛋白的亲/疏水性指数为-0.663～-0.552，均为亲水性蛋白;不稳定指数为37.66～50.86，其中MiVOZ1、MiVOZ2和MiVOZ4为不稳定蛋白，MiVOZ3为稳定蛋白。
2. 3 二级结构预测预测结果
对MiVOZs蛋白进行二级结构预测，结果如图2所示。MiVOZ1蛋白二级结构的主要元件是无规则卷曲（53.63%）和α-螺旋（31.84%），其次是延伸链（10.47%）和β-转角（4.06%）;MiVOZ2蛋白二级结构的主要元件为无规则卷曲（52.14%）和α-螺旋（35.29%），其次是延伸链（9.53%）和β-转角（3.04%）;MiVOZ3蛋白二级结构的主要元件是无规则卷曲（54.78%）和α-螺旋（31.70%），其次是延伸链（10.49%）和β-转角（3.03%）;MiVOZ4蛋白二级结构的主要元件是无规则卷曲（55.56%）和α-螺旋（30.45%），其次是延伸链（10.49%）和β-转角（3.50%）。 2. 4 系统发育进化分析结果
基于芒果（4個）、拟南芥（3个）、水稻（2个）、烟草（8个）、苹果（5个）、毛果杨（8个）、木薯（5个）、番茄（2个）、菠萝（2个）和玉米（10个）的VOZ氨基酸序列构建系统发育进化树，结果如图3所示。49个VOZ蛋白聚为十个分支（ClassⅠ～Class Ⅹ），MiVOZ1～MiVOZ4分别存在于Class Ⅰ和Class Ⅴ中，这两个分支中含有毛果杨、木薯和苹果VOZ蛋白，且Class Ⅴ还包含1个拟南芥VOZ蛋白。其中，MiVOZ1与拟南芥VOZ蛋白聚类在Class Ⅴ的一个小分支中;MiVOZ2、MiVOZ3和MiVOZ4与苹果VOZ蛋白聚类在一个较小的分支，再与毛果杨和木薯聚类在ClassⅠ。综上所述，MiVOZs蛋白与毛果杨、木薯、苹果和拟南芥的VOZ蛋白关系较近。
2. 5 保守基序分析结果
对MiVOZs蛋白进行保守基序分析，结果如图4所示。当E-value<4.6e-032时，4个MiVOZs蛋白共有5个相对保守且典型的基序（Motif1～Motif5）。Motif1含有50个氨基酸，以MiVOZ2、MiVOZ3和MiVOZ4蛋白的Motif1序列一致;Motif2含有29个氨基酸，MiVOZ1蛋白的Motif2与其他3个MiVOZs蛋白存在明显序列差异，MiVOZ3和MiVOZ4的Motif2序列一致，与MiVOZ2的Motif2仅有1个氨基酸的差异;Motif3含有38个氨基酸，MiVOZ3与MiVOZ4的Motif3序列完全一致，与MiVOZ2的Motif3仅有2个氨基酸的差异，而MiVOZ1与MiVOZ2的Motif3存在9个氨基酸的差异;Motif4含有50个氨基酸，MiVOZ2、MiVOZ3和MiVOZ4蛋白的Motif1序列完全一致;Motif5含有50个氨基酸，MiVOZ3和MiVOZ4蛋白的Motif5序列完全一致。
2. 6 胶孢炭疽菌侵染下芒果VOZ家族基因的表达分析结果
利用实时荧光定量PCR检测胶孢炭疽菌侵染下芒果叶片中MiVOZs基因的相对表达量，结果如图5所示。与侵染后0 h（对照）相比，MiVOZ1和MiVOZ2基因在其他侵染时间点的相对表达量均显著升高（P<0.05，下同），而MiVOZ3和MiVOZ4基因的相对表达量均上升，但未达显著水平（P>0.05，下同）。表明MiVOZ1和MiVOZ2基因积极响应胶孢炭疽菌的侵染。
2. 7 细菌性黑斑病菌侵染下芒果VOZ家族基因的表达分析结果
利用实时荧光定量PCR检测细菌性黑斑病菌侵染下芒果叶片中MiVOZs基因的相对表达量，结果如图6所示。侵染后0～12 h，MiVOZ2基因的相对表达量呈先升高后降低的变化趋势，其他时间点的相对表达量均与对照存在显著差异，在侵染后6 h时达峰值;MiVOZ3和MiVOZ4基因整体呈略微上升的趋势，仅在侵染后12 h时与对照存在显著差异;MiVOZ1基因的相对表达量相对稳定，与对照无显著差异，表明MiVOZ2基因积极响应芒果细菌性黑斑病菌的侵染。
3 讨论
本研究对4个芒果VOZ转录因子基因家族成员进行生物信息学分析，结果发现MiVOZ1、MiVOZ2、MiVOZ3和MiVOZ4蛋白的等电点均小于6.00，平均亲/疏水性指数均小于0，说明MiVOZs为弱酸性的亲水性蛋白，由此可知MiVOZs蛋白的基本理化性质无明显差异。此外，MiVOZs蛋白二级结构的主要元件为无规则卷曲，与齿肋赤藓ScVOZ1蛋白（高贝等，2014）和菠萝AcoVOZ2蛋白（夏杨等，2018）相似。与拟南芥、水稻、番茄和菠萝相比，芒果的VOZ转录因子基因家族成员数量相对较多，可能是由于芒果中的全基因组重复事件（WGD）所致（Gao et al.，2018;Wang et al.，2020a）。本研究构建的系统发育进化树显示，芒果和其他9个物种的49个VOZ蛋白聚为十个分支，在ClassⅠ中3个MiVOZs蛋白（MiVOZ2、MiVOZ3和MiVOZ4）与苹果、木薯和毛果杨的VOZ蛋白聚类在一起，在Class Ⅴ中MiVOZ1与拟南芥、木薯和毛果杨聚类在一起，推测芒果与苹果和木薯的亲缘关系较近;MiVOZs蛋白可与双子叶植物拟南芥、苹果、木薯和毛果杨的VOZ蛋白聚类在一起，不与单子叶植物玉米和水稻的VOZ蛋白聚类在一起。该结论类似于大豆GmVOZ1G可与双子叶植物拟南芥VOZ蛋白聚类，而不能与单子叶植物水稻、玉米和粟等VOZ蛋白聚类在一起（Li et al.，2020b）。可见，单子叶植物类群和双子叶植物类群的VOZ转录因子存在明显的分化。不仅如此，不同VOZ家族成员含有高度保守的结构域，与其具有相同和相似的调控功能密切相关（Koguchi et al.，2017）。本研究发现，4个MiVOZs蛋白的保守基序中，以Motif1～Motif5较为典型，其中，MiVOZ2、MiVOZ3和MiVOZ4蛋白的这5个基序较保守，尤其是MiVOZ3和MiVOZ4高度保守;MiVOZ1蛋白与上述3个MiVOZs蛋白基序明显不同，系统发育进化树分析结果也证明这一点，说明基序相似性也能反映序列间的亲缘关系。
胶孢炭疽病和细菌性黑斑病是危害芒果较严重的病害之一。本研究利用qRT-PCR检测MiVOZs基因在胶孢炭疽菌和细菌性黑斑病菌侵染下的表达情况，结果显示，MiVOZ1和MiVOZ2基因在胶孢炭疽菌侵染下相对表达量较对照显著升高，MiVOZ2基因在细菌性黑斑病菌侵染下表达量较对照也显著升高，表明部分芒果VOZ转录因子家族成员参与抵御真菌和细菌病原体侵染。Nakai等（2013a）研究也发现，在拟南芥VOZ转录因子家族基因高表达可提高对真菌和细菌病原体的抗性。可见，不同物种的VOZ转录因子家族成员参与植株的免疫反应。此外，内源信号和外源信号刺激可使植物免疫系统对病原体的攻击作出更快速的免疫反应，如Schwarzenbacher等（2020）研究发现，AtVOZ1和AtVOZ2在BIB1-VOZ信号模块通过病原体诱导的ABA信号传导至细胞壁后作出防御反应，同时抑制非生物应激反应基因;Cheong等（2013）研究发现，水稻OsVOZ2对Xanthomonas oryzae pv. oryzae（Xoo）具有明显的抗性。由于MiVOZ2基因在胶孢炭疽菌和细菌性黑斑病菌侵染下的相对表达量均显著升高，推测MiVOZ2基因在芒果对不同病原菌抗性中具有相似的调控功能，属于正调节因子。此外，有研究发现，植物VOZ转录因子是应对生物胁迫、高温胁迫及高盐胁迫的正调节因子，也是寒冷胁迫和干旱胁迫的负调节因子（Nakai et al.，2013a，2013b;Kim et al.，2017;Prasad et al.，2016，2018）。Wang等（2020a）研究了水稻VOZ转录因子介导的水稻抗稻瘟病新机制，结果发现OsVOZ1和OsVOZ2协同负调控水稻细胞死亡和基础抗性，且二者能与抗病蛋白Piz-t相互作用，若抑制OsVOZ1/OsVOZ2表达水平会降低Piz-t的转录水平、蛋白积累及对非亲和小种的稻瘟病抗性，证实OsVOZ1和OsVOZ2可调控Piz-t介导的免疫反应，为水稻抗病育种提供分子理论基础，也为今后深入探究芒果VOZ转录因子的免疫机制提供理论参考。 4 結论
芒果VOZ转录因子在抵御不同病原菌侵害的生物学功能方面存在差异，其中MiVOZ2基因在抵御胶孢炭疽病和细菌性黑斑病侵染的免疫反应中具有相似生物学功能，属于正调节因子。
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（責任编辑 陈 燕）