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【摘 要】RNA沉默是由siRNA参与的特异性的抑制或消除目的基因表达的现象，普遍存在于各种生物中。本文介绍了RNA沉默的历史、机制以及影响RNA沉默效率的因素，并简述了丝状真菌中RNA沉默的研究进展。
【关键词】RNA沉默；RNAi；基因抑制；丝状真菌；
【文章编号】1004-7484（2014）07-4252-02
1 RNA沉默的研究历史
Fire等在研究秀丽新小杆线虫的一种肌肉相关蛋白时发现，若同时注射该蛋白的mRNA和相应的反义RNA后，线虫会发生抽搐，分别注射时则线虫无任何变化。这与他们研究的线虫肌肉相关蛋白缺失后的表现一致。使用与其他特定基因互补的siRNA进行实验，结果发现与其同源的mRNA不再表达，相应的蛋白质也不再产生，线虫出现相应基因缺失的表型。他们把这一现象称为RNA干涉（RNAi）[1]。其实在此以前，有文献报道类似实验现象。1990年，Jorgenson等人试图将查尔酮合成酶基因转入紫色牵牛花中以加深它的颜色，结果发现一些花颜色不但没有加深反而表现出杂色，有的甚至成为纯白色。后来发现这是因为转入的查尔酮合成酶的基因和牵牛花中正常的基因一起发生了沉默，因此他们把这种现象叫做共抑制[2]，表现为一种转录后基因沉默现象（PTGS），这是一种转基因诱导的基因沉默。随后的研究发现病毒侵染植物后同样会诱导产生PTGS，被称为病毒诱导的基因沉默。1995年，Guo Su等在用反义抑制的方法使果蝇中的pal-l基因失活的实验中意外发现用有义链也能使基因失活，此实验第一次证明了双链RNA能导致基因沉默[3]。
在丝状真菌中，最早是在粗糙脉胞菌发现此类现象。1992年，Romano等向粗糙脉胞菌中导入额外拷贝的类胡萝卜素基因时发现了类似的基因沉默现象，他们将此现象称为抑制（Quelling）[4]。
迄今为止已在植物、动物、真菌等多种生物中发现了类似的基因沉默现象，并且在各种模式生物中，如拟南芥、果蝇、斑马鱼、小鼠、粗糙脉胞菌等，对这些现象的机理深入研究，结果显示，在不同物种中发生的基因沉默现象在细节上虽然不同，但是都涉及dsRNA的参与，而且发现各物种中存在一些参与此过程的同源蛋白。这里将RNAi、Quilling和PTGS通称为“RNA沉默”。
2 作用机制
2.1 起始阶段
双链RNA通过外源导入、转基因或者病毒感染等方式进入细胞后，专一性的双链RNA内切酶的作用下，将双链RNA切割成约21～23nt的片段。切割后的片段在3’端形成2bp的粘性末端，形成大量的siRNA（分子，又被称为引导RNA。它们可以识别生物体内与之同源的靶mRNA的序列，启动RNAi反应。
2.2 效应阶段
siRNA中的一条链作为向导链，被装配到由多个蛋白质因子组成的RNAi机器中执行RNAi效应。其中Argonaute是RNAi机器的关键蛋白质成分，最小的RNAi机器仅含有一个Argonaute家族蛋白质和一条向导小RNA。 根据向导小RNA的性质及调控基因表达的机制，目前有三种RNAi效应模型：（1） 靶mRNA降解模型。在这一过程中，向导小RNA整合进入一个被称为RNA诱导沉默复合物的RNAi机器，通过碱基配对，向导RNA指导RISC结合到靶mRNA上，然后RISC 执行定点裁剪，导致靶mRNA降解和靶mRNA基因表达的沉默。这种方式在多种植物及少数动物miRNA介导的基因沉默中发现；（2） 靶mRNA翻译抑制模型。在翻译抑制过程中，执行RNAi效应的RNAi机器同样是RISC ，也是通过碱基配对，向导小RNA指导RISC 结合到靶mRNA的3’UTR，导致靶mRNA的翻译抑制。这种方式常见于哺乳动物miRNA介导的基因沉默；（3） 转录水平的沉默模型。在此模型中，RNAi效应由一个被称为RNA诱导基因转录起始沉默复合物（RITS）的RNAi机器行使。RITS通过介导组蛋白甲基化修饰和异染色质形成，抑制基因转录起始，从而在转录水平沉默基因表达。在植物中最早观察到这种沉默方式，后来在裂殖酵母和果蝇中得到证明。
2.3 倍增阶段
倍增阶段主要由RdRP（RNA-dependent RNA Polymerase）实现。siRNA可作为引物，以mRNA为模板，在RdRP作用下合成出mRNA的互补链，它在RNAi机器的作用下也被裂解成新生的siRNA。通过这个聚合酶链式反应，细胞内的siRNA大大增加，显著增加了对基因表达的抑制。
3 设计方法及影响因素
3.1 设计方法
从作用的机理可以看出，RNAi的启动必须有小分子RNA的存在才能实现。在实际应用中，首先要根据靶DNA设计出siRNA的序列，然后，可以直接通过化学合成或PCR等方法得到siRNA，利用适当的方法将其转入宿主细胞后，筛选有沉默效应的细胞或个体。另外也可以通过体外或体内转录的方法，即利用合适的载体构建表达体系，经转录后获得目的双链RNA，该双链RNA可以是siRNA，也可以是由具有茎环结构的短发夹状RNA所形成。转录法的有点是无需人工合成siRNA片段，可以进行长期基因沉默研究，而且若采用了一些具有组织特异性或可诱导的启动子，则能实现特定组织或生长（发育）阶段的基因沉默。
3.2 RNAi效率的影响因素
3.2.1 双链RNA的长度
对于有颌类脊椎动物细胞，大于30bp的外源双链RNA会诱发细胞内的干扰素系统，激活依赖于RNA的蛋白激酶，产生广泛的、非特异性的抑制作用。对于非有颌类脊椎动物细胞，大于100bp的dsRNA有效果，大于200bp的dsRNA能引起线虫、植物等细胞中基因的表达沉默，但是小于300bp的dsRNA被双链RNA内切酶剪切的效率低，效果差。 3.2.2 siRNA的设计
不同的siRNA序列沉默基因的效率差别很大，因此，siRNA的合理设计是RNAi实验成功的关键。2002年，Elbashir等提出了选择siRNA建议：（1） 为了避免5’或3’端的UTRs的蛋白结合位点，从起始密码下游50～100nt开始搜索siRNA；（2）搜索5’AA（N19）UU序列，如果没有相应序列，可以选择5’AA（N21）或5’NA（N21）；（3） G/C含量在32%～79%之间；（4） 利用Blast软件在数据库中进行比对，确定siRNA对靶基因的特异性；（5） 设置对照siRNA，即在基因组中无对应序列的siRNA。
近年来，结合生物信息学手段，通过分析大量的已经发表的高效siRNA序列得出序列规律，或者依据其能量大小来设计siRNA序列。目前已有许多根据这些原则编写的siRNA设计软件。此外，Marina等研究粗糙脉胞菌发现，若siRNA中含有内元，则引发的沉默效应的频率更高，而且含有能剪切的内元引发的沉默效应的频率高于不能剪切的内元[5]。
3.2.3 靶序列的结构
除了siRNA以外，mRNA上靶序列的结构对于沉默的效率也具有重要影响。Luo和Chang通过研究三个基因（Bcl-2， hTF和cycin B1）的沉默效果时证明，目标mRNA上靶序列的结构是位置特异性的主要因素，他们引入了代表平均氢键数目的参量，称为“氢键系数”，来指导siRNA的设计。Steffen等构建了具有不同结构的mRNA，系统的研究了siRNA和mRNA靶序列结构对与RNAi效果的影响，结果显示复杂的二级结构会限制RNAi的效果[6]。
3.2.4 其他因素
Chang等系统研究了siRNA的各种结构变异体（平末端和各种粘性末端）与沉默活性的关系，总结了三条规律：（1） 延长siRNA正义链的3’端对基因沉默的影响不大；（2） 如果要延长正义链和反义链，则延长3’端较好；（3） 如果要延长双链，则在反义链的3’端延长利于保持活性[7]。Lee等在研究根瘤农杆菌致瘤基因色氨酸单氧化酶基因iaaM和吲哚-3-乙酰唑胺水解酶基因iaaH时发现，沉默iaaM的频率远高于 iaaH ，此外若转入的基因不含有起始密码子，则丧失RNAi活性[8]。在宿主细胞中，参与RNAi过程的相关酶类的活性对基因沉默也有影响，Forrest等构建了超量表达qde-1基因（编码RdRP ）的粗糙脉胞菌OQ1，用该菌进行RNAi实验，所需的siRNA大量减少，而且沉默基因后菌株的表型稳定。
4 在丝状真菌中的研究
1992年，Romano等向粗糙脉胞菌中导入额外拷贝的类胡萝卜素基因时发现了基因沉默的现象[5]。对此现象的深入研究发现了三类参与此过程的蛋白qde-1、qde-2和qde-3，其中qde-1编码依赖于RNA的RNA聚合酶RdRP，qde-2编码一个属于Argonaute家族的蛋白质]，qde-3编码一种RecQ解旋酶，其中qde-1基因编码的蛋白QDE-1是沉默过程的限速因子。此外，近年还发现了DCL-1、DCL-2和QIP等参与quelling的蛋白。
粗糙脉胞菌作为模式生物，常作为研究quelling作用机制的材料。在其他丝状真菌中，RNA沉默多用于基因功能研究，但是到目前为止，文献报道相对较少，已报道的有致病菌Magnaporthe oryzae、Cryphonectria parasitica、 Colletotrichum lagenarium、Aspergillus fumigatus 以及工业用菌Aspergillus oryzae等。
5 展望
RNA沉默为基因功能的研究提供了新途径，与传统的基因缺失技术相比，它主要具有以下优点：（1） RNA沉默能下调基因的表达，而不需要考虑基因同源重组效率；（2） 丝状真菌菌丝体具有多核或多细胞，这使得基因缺失变得复杂和低效率； （3） 对于一些致死基因或看家基因，可以直接采用RNA沉默技术进行研究。
随着大量基因组序列信息的测定，需要大规模地研究基因的功能。目前，已在一些物种中建立了高通量的基因沉默平台，在D.melanogaster和C.elegans中甚至已进行了基因组规模的基因沉默。利用RNA沉默技术将有力推动丝状真菌基因功能的研究，加速工业菌种的深度开发。
参考文献：
[1] Fire A.， Xu S.， Montgomery M.K.， et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature， 1998，391： 806～811.
[2]Napoli C.， Lemieux C， Jorgensen R.A. Introduction of a chimericchalcone synthase gene into Petunia results in reversible cosuppression of homologous genes in trans. Plant Cell. 1990， 279～289.
[3] Guo Shu， Kemphues K.J. Par-1， A gene required for establishing polarity in C.elegans embryos encodes a putative Ser/Thr kinase that is asymmetrically distributed. Cell. 1995， 81：611～620.
[4] N. Romano and G. Macino. Quelling： transient inactivation of gene expression in Neurospora crassa by transformation with homologous sequences. Mol. Microbiol. 1992， 6： 3343～3353 .
[5] Marina Goldoni，Gianluca Azzalin，Giuseppe Macino，et al. Efficient gene silencing by expression of double stranded RNA in Neurospora crassa. Fungal Genetics and Biology. 2004，41： 1016～1024.
[6] Steffen Schubert， Arnold Grunweller， Volker A. Erdmann， et al. Local RNA target structure influences siRNA efficacy： systematic analysis of intentionally designed binging regions. J.Mol.Biol. 2005， 348： 883～893.
[7] Chan Il Chang， Sun Woo Hong， Soyoun Kim， et al. A structure-activity relationship study of siRNAs with structural variations. Biochemical and Biophysical Research Communications. 2007， 359： 997～1003.
[8] Hyewon Lee， Jodi L.Humann， Jennifer S.Pitrak， et al. Translation Start Sequences Affect the Efficiency of Silencing of Agrobacterium tumefaciens T-DNA Oncogenes. Plant Physiology， 2003， 133： 1～12.
作者简介：
吴红静，讲师，研究方向：生物化学，分子营养学。
项目来源：
南昌大学科学技术学院科研基金项目，编号：2013-ZR-05）
【关键词】RNA沉默；RNAi；基因抑制；丝状真菌；
【文章编号】1004-7484（2014）07-4252-02
1 RNA沉默的研究历史
Fire等在研究秀丽新小杆线虫的一种肌肉相关蛋白时发现，若同时注射该蛋白的mRNA和相应的反义RNA后，线虫会发生抽搐，分别注射时则线虫无任何变化。这与他们研究的线虫肌肉相关蛋白缺失后的表现一致。使用与其他特定基因互补的siRNA进行实验，结果发现与其同源的mRNA不再表达，相应的蛋白质也不再产生，线虫出现相应基因缺失的表型。他们把这一现象称为RNA干涉（RNAi）[1]。其实在此以前，有文献报道类似实验现象。1990年，Jorgenson等人试图将查尔酮合成酶基因转入紫色牵牛花中以加深它的颜色，结果发现一些花颜色不但没有加深反而表现出杂色，有的甚至成为纯白色。后来发现这是因为转入的查尔酮合成酶的基因和牵牛花中正常的基因一起发生了沉默，因此他们把这种现象叫做共抑制[2]，表现为一种转录后基因沉默现象（PTGS），这是一种转基因诱导的基因沉默。随后的研究发现病毒侵染植物后同样会诱导产生PTGS，被称为病毒诱导的基因沉默。1995年，Guo Su等在用反义抑制的方法使果蝇中的pal-l基因失活的实验中意外发现用有义链也能使基因失活，此实验第一次证明了双链RNA能导致基因沉默[3]。
在丝状真菌中，最早是在粗糙脉胞菌发现此类现象。1992年，Romano等向粗糙脉胞菌中导入额外拷贝的类胡萝卜素基因时发现了类似的基因沉默现象，他们将此现象称为抑制（Quelling）[4]。
迄今为止已在植物、动物、真菌等多种生物中发现了类似的基因沉默现象，并且在各种模式生物中，如拟南芥、果蝇、斑马鱼、小鼠、粗糙脉胞菌等，对这些现象的机理深入研究，结果显示，在不同物种中发生的基因沉默现象在细节上虽然不同，但是都涉及dsRNA的参与，而且发现各物种中存在一些参与此过程的同源蛋白。这里将RNAi、Quilling和PTGS通称为“RNA沉默”。
2 作用机制
2.1 起始阶段
双链RNA通过外源导入、转基因或者病毒感染等方式进入细胞后，专一性的双链RNA内切酶的作用下，将双链RNA切割成约21～23nt的片段。切割后的片段在3’端形成2bp的粘性末端，形成大量的siRNA（分子，又被称为引导RNA。它们可以识别生物体内与之同源的靶mRNA的序列，启动RNAi反应。
2.2 效应阶段
siRNA中的一条链作为向导链，被装配到由多个蛋白质因子组成的RNAi机器中执行RNAi效应。其中Argonaute是RNAi机器的关键蛋白质成分，最小的RNAi机器仅含有一个Argonaute家族蛋白质和一条向导小RNA。 根据向导小RNA的性质及调控基因表达的机制，目前有三种RNAi效应模型：（1） 靶mRNA降解模型。在这一过程中，向导小RNA整合进入一个被称为RNA诱导沉默复合物的RNAi机器，通过碱基配对，向导RNA指导RISC结合到靶mRNA上，然后RISC 执行定点裁剪，导致靶mRNA降解和靶mRNA基因表达的沉默。这种方式在多种植物及少数动物miRNA介导的基因沉默中发现；（2） 靶mRNA翻译抑制模型。在翻译抑制过程中，执行RNAi效应的RNAi机器同样是RISC ，也是通过碱基配对，向导小RNA指导RISC 结合到靶mRNA的3’UTR，导致靶mRNA的翻译抑制。这种方式常见于哺乳动物miRNA介导的基因沉默；（3） 转录水平的沉默模型。在此模型中，RNAi效应由一个被称为RNA诱导基因转录起始沉默复合物（RITS）的RNAi机器行使。RITS通过介导组蛋白甲基化修饰和异染色质形成，抑制基因转录起始，从而在转录水平沉默基因表达。在植物中最早观察到这种沉默方式，后来在裂殖酵母和果蝇中得到证明。
2.3 倍增阶段
倍增阶段主要由RdRP（RNA-dependent RNA Polymerase）实现。siRNA可作为引物，以mRNA为模板，在RdRP作用下合成出mRNA的互补链，它在RNAi机器的作用下也被裂解成新生的siRNA。通过这个聚合酶链式反应，细胞内的siRNA大大增加，显著增加了对基因表达的抑制。
3 设计方法及影响因素
3.1 设计方法
从作用的机理可以看出，RNAi的启动必须有小分子RNA的存在才能实现。在实际应用中，首先要根据靶DNA设计出siRNA的序列，然后，可以直接通过化学合成或PCR等方法得到siRNA，利用适当的方法将其转入宿主细胞后，筛选有沉默效应的细胞或个体。另外也可以通过体外或体内转录的方法，即利用合适的载体构建表达体系，经转录后获得目的双链RNA，该双链RNA可以是siRNA，也可以是由具有茎环结构的短发夹状RNA所形成。转录法的有点是无需人工合成siRNA片段，可以进行长期基因沉默研究，而且若采用了一些具有组织特异性或可诱导的启动子，则能实现特定组织或生长（发育）阶段的基因沉默。
3.2 RNAi效率的影响因素
3.2.1 双链RNA的长度
对于有颌类脊椎动物细胞，大于30bp的外源双链RNA会诱发细胞内的干扰素系统，激活依赖于RNA的蛋白激酶，产生广泛的、非特异性的抑制作用。对于非有颌类脊椎动物细胞，大于100bp的dsRNA有效果，大于200bp的dsRNA能引起线虫、植物等细胞中基因的表达沉默，但是小于300bp的dsRNA被双链RNA内切酶剪切的效率低，效果差。 3.2.2 siRNA的设计
不同的siRNA序列沉默基因的效率差别很大，因此，siRNA的合理设计是RNAi实验成功的关键。2002年，Elbashir等提出了选择siRNA建议：（1） 为了避免5’或3’端的UTRs的蛋白结合位点，从起始密码下游50～100nt开始搜索siRNA；（2）搜索5’AA（N19）UU序列，如果没有相应序列，可以选择5’AA（N21）或5’NA（N21）；（3） G/C含量在32%～79%之间；（4） 利用Blast软件在数据库中进行比对，确定siRNA对靶基因的特异性；（5） 设置对照siRNA，即在基因组中无对应序列的siRNA。
近年来，结合生物信息学手段，通过分析大量的已经发表的高效siRNA序列得出序列规律，或者依据其能量大小来设计siRNA序列。目前已有许多根据这些原则编写的siRNA设计软件。此外，Marina等研究粗糙脉胞菌发现，若siRNA中含有内元，则引发的沉默效应的频率更高，而且含有能剪切的内元引发的沉默效应的频率高于不能剪切的内元[5]。
3.2.3 靶序列的结构
除了siRNA以外，mRNA上靶序列的结构对于沉默的效率也具有重要影响。Luo和Chang通过研究三个基因（Bcl-2， hTF和cycin B1）的沉默效果时证明，目标mRNA上靶序列的结构是位置特异性的主要因素，他们引入了代表平均氢键数目的参量，称为“氢键系数”，来指导siRNA的设计。Steffen等构建了具有不同结构的mRNA，系统的研究了siRNA和mRNA靶序列结构对与RNAi效果的影响，结果显示复杂的二级结构会限制RNAi的效果[6]。
3.2.4 其他因素
Chang等系统研究了siRNA的各种结构变异体（平末端和各种粘性末端）与沉默活性的关系，总结了三条规律：（1） 延长siRNA正义链的3’端对基因沉默的影响不大；（2） 如果要延长正义链和反义链，则延长3’端较好；（3） 如果要延长双链，则在反义链的3’端延长利于保持活性[7]。Lee等在研究根瘤农杆菌致瘤基因色氨酸单氧化酶基因iaaM和吲哚-3-乙酰唑胺水解酶基因iaaH时发现，沉默iaaM的频率远高于 iaaH ，此外若转入的基因不含有起始密码子，则丧失RNAi活性[8]。在宿主细胞中，参与RNAi过程的相关酶类的活性对基因沉默也有影响，Forrest等构建了超量表达qde-1基因（编码RdRP ）的粗糙脉胞菌OQ1，用该菌进行RNAi实验，所需的siRNA大量减少，而且沉默基因后菌株的表型稳定。
4 在丝状真菌中的研究
1992年，Romano等向粗糙脉胞菌中导入额外拷贝的类胡萝卜素基因时发现了基因沉默的现象[5]。对此现象的深入研究发现了三类参与此过程的蛋白qde-1、qde-2和qde-3，其中qde-1编码依赖于RNA的RNA聚合酶RdRP，qde-2编码一个属于Argonaute家族的蛋白质]，qde-3编码一种RecQ解旋酶，其中qde-1基因编码的蛋白QDE-1是沉默过程的限速因子。此外，近年还发现了DCL-1、DCL-2和QIP等参与quelling的蛋白。
粗糙脉胞菌作为模式生物，常作为研究quelling作用机制的材料。在其他丝状真菌中，RNA沉默多用于基因功能研究，但是到目前为止，文献报道相对较少，已报道的有致病菌Magnaporthe oryzae、Cryphonectria parasitica、 Colletotrichum lagenarium、Aspergillus fumigatus 以及工业用菌Aspergillus oryzae等。
5 展望
RNA沉默为基因功能的研究提供了新途径，与传统的基因缺失技术相比，它主要具有以下优点：（1） RNA沉默能下调基因的表达，而不需要考虑基因同源重组效率；（2） 丝状真菌菌丝体具有多核或多细胞，这使得基因缺失变得复杂和低效率； （3） 对于一些致死基因或看家基因，可以直接采用RNA沉默技术进行研究。
随着大量基因组序列信息的测定，需要大规模地研究基因的功能。目前，已在一些物种中建立了高通量的基因沉默平台，在D.melanogaster和C.elegans中甚至已进行了基因组规模的基因沉默。利用RNA沉默技术将有力推动丝状真菌基因功能的研究，加速工业菌种的深度开发。
参考文献：
[1] Fire A.， Xu S.， Montgomery M.K.， et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature， 1998，391： 806～811.
[2]Napoli C.， Lemieux C， Jorgensen R.A. Introduction of a chimericchalcone synthase gene into Petunia results in reversible cosuppression of homologous genes in trans. Plant Cell. 1990， 279～289.
[3] Guo Shu， Kemphues K.J. Par-1， A gene required for establishing polarity in C.elegans embryos encodes a putative Ser/Thr kinase that is asymmetrically distributed. Cell. 1995， 81：611～620.
[4] N. Romano and G. Macino. Quelling： transient inactivation of gene expression in Neurospora crassa by transformation with homologous sequences. Mol. Microbiol. 1992， 6： 3343～3353 .
[5] Marina Goldoni，Gianluca Azzalin，Giuseppe Macino，et al. Efficient gene silencing by expression of double stranded RNA in Neurospora crassa. Fungal Genetics and Biology. 2004，41： 1016～1024.
[6] Steffen Schubert， Arnold Grunweller， Volker A. Erdmann， et al. Local RNA target structure influences siRNA efficacy： systematic analysis of intentionally designed binging regions. J.Mol.Biol. 2005， 348： 883～893.
[7] Chan Il Chang， Sun Woo Hong， Soyoun Kim， et al. A structure-activity relationship study of siRNAs with structural variations. Biochemical and Biophysical Research Communications. 2007， 359： 997～1003.
[8] Hyewon Lee， Jodi L.Humann， Jennifer S.Pitrak， et al. Translation Start Sequences Affect the Efficiency of Silencing of Agrobacterium tumefaciens T-DNA Oncogenes. Plant Physiology， 2003， 133： 1～12.
作者简介：
吴红静，讲师，研究方向：生物化学，分子营养学。
项目来源：
南昌大学科学技术学院科研基金项目，编号：2013-ZR-05）