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摘 要 选用大茎野生种57NG208与南涧果蔗正反交所得的12个后代为试验材料，采用桶栽试验的方法，在甘蔗拔节初期设正常供水（CK）、轻度胁迫和重度胁迫3处理进行人工水分胁迫，分别测定3处理的形态指标及生理生化指标，利用隶属函数分析﹑灰色关联度分析和聚类分析，综合评价12份参试材料在不同水分胁迫下耐旱性的强弱。结果表明：不同水分胁迫处理对供试甘蔗主要测定指标均有显著影响;在不同水分胁迫下甘蔗叶片中的PMP、MDA含量、Pro含量、SOD和POD酶活性数值升高，CHL含量和Hight数值降低，变化幅度因水分胁迫程度及参试材料的差异而不同;隶属函数分析结果表明，在不同水分胁迫下，大茎野生种57NG208與南涧果蔗正交材料排在前5位的数量比其反交多;聚类分析表明，所有参试材料在轻度、重度水分胁迫下，均可分为4大类别，云瑞2012-9-11和云瑞2012-38-81的耐旱性较好，无论轻度、重度水分胁迫处理均聚为一类;灰色关联度分析表明，在不同程度的水分胁迫下，各项测定指标与耐旱性间的关联度不同，CHL、Pro和POD等3项生理生化指标与甘蔗耐旱性关联度较高，是甘蔗耐旱性评价的优良指标。
关键词 甘蔗;大茎野生种;南涧果蔗;正反交;灰色关联度分析;聚类分析
中图分类号 S566.103 文献标识码 A
甘蔗是我国重要的糖料作物，蔗糖产量占中国食糖总产的90%以上[1]。水是制约甘蔗产量的重要因素，有研究表明，约30%的甘蔗产量取决于合适的水分供应[2]。近年来，缺水无灌溉条件的山地、旱坡地成为中国甘蔗生产发展的地方，我国旱地植蔗面积约占全国植蔗总面积的80%，广西和云南蔗田的有效灌溉面积分别仅占各省蔗田总面积的8%和14.4%，与蔗糖先进国家相差6～7倍，干旱已成为制约我国蔗糖生产的关键因素之一，严重影响我国糖业的国际竞争力[3]。此外，现有主栽品种已经出现种性退化，产量减少和品质变劣，目前急需扩宽杂交亲本野生种血缘，实现亲本抗逆性突破。大茎野生种别名伊里安野生种（Saccharum robustum L.），具有植株高大、长势旺盛、茎硬抗风、抗虫、宿根性强、生物产量高等特点，用于拓宽甘蔗遗传基础及品种改良有十分重要意义。因此开展野生甘蔗创新种质的抗旱性研究，筛选出抗旱性强的甘蔗杂交亲本或新品种，提供全国甘蔗育种机构应用，从而提高育种效率，增强旱地甘蔗水分利用效率，对我国蔗糖产业的可持续发展具有重要意义。
作物的抗旱节水性是复杂的数量性状[4]，既受多基因遗传控制，又与外界环境条件变化息息相关[5-6]。多年来，国内外很多学者从不同角度研究作物抗旱性指标和鉴定方法，高三基等[7]研究膜脂过氧化代谢、质膜透性及光合参数与甘蔗品种抗旱性的关系，建立相应的判别模型。卢会文等[8]认为，叶片衰老枯黄情况与株高伤害度结果较为一致，而株高伤害度与叶面积伤害度存在显著相关;对多个指标进行综合评价时，常采用模糊隶属函数法[9-12]、抗旱性度量值（D值）[13]、逐步判别分析法[7]、聚类分析[14]等方法对甘蔗农艺性状和生理特性进行抗旱性评价。本研究利用云南省农业科学院甘蔗研究所瑞丽育种站所保育的大茎野生种57NG208与热带、亚热带蔗区适应性极广的热带种南涧果蔗进行正反交，在前期对132个真杂种后代遗传变异分析[15]的基础上，筛选出12份代表材料，测定与抗旱性相关的形态学及生理生化指标，并利用隶属函数分析﹑灰色关联度分析和聚类分析相结合的方法，比较其拔节期耐旱性的强弱，以期为大茎野生种在抗旱种质资源评价筛选及抗旱新品种选育提供一定的参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料
参试材料及亲本信息详见表1。
1.2 方法
1.2.1 试验设计 试验于2017年3月10日，布置在云南省农业科学院甘蔗研究所瑞丽育种站抗旱温室，对参试材料单芽砍种桶栽，每桶栽种5个单芽，每个材料设轻度水分胁迫﹑重度水分胁迫和正常供水3个处理，每个处理3桶。于2017年9月27日把所有材料分成3个组，其中第1组作为对照正常供水，2、3组停止供水进行胁迫，其中对第2组进行轻度胁迫处理，第3组作重度胁迫处理。7 d后，处理材料呈轻微萎蔫状态，在清晨无“吐水”时，对第2组材料进行抗旱生理生化指标测定，而第3组继续进行胁迫，15 d后待第3组较第1组（对照组）三分之一以上材料出现永久萎蔫、叶片枯黄卷曲、少部分甚至枯死等严重缺水症状时进行重度胁迫抗旱指标的测定，同时再次测定对照组材料。
1.2.2 测定指标及方法 （1）生理指标测定 从胁迫处理的3桶甘蔗中，每桶各取1株甘蔗的+1叶及心叶，共6片，迅速带回实验室，用自来水漂洗叶片以除去表面沾污物，再用去离子水冲洗一次，用干净的纱布轻轻吸干表面的水分，混合叶片（各材料的+1叶混在一起，心叶混在一起）后进行生理指标的测定。其中，相对质膜透性（PMP）采用雷磁DDSJ2308型电导仪参照张宪政[16]的方法测定;采用SPAD叶绿素仪测定叶绿素（CHL）含量;参照李忠光等[17]的方法测定丙二醛含量（MDA）和脯氨酸（Pro）含量，其中丙二醛含量（MDA）采用硫代巴比妥酸显色法，脯氨酸（Pro）含量采用酸性茚三酮法测定。其中，叶片质膜透性（plasma membrane permeability，PMP）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、叶绿素（chlorophyll，CHL）和脯氨酸（proline，Pro）含量的测定用+1叶，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和过氧化物酶（peroxidase，POD）酶活性的测定需用心叶参照王学奎[18]的方法。 （2）形态指标测定 株高茎径于抗旱胁迫前的8月8日对胁迫处理组的每个桶选择一根甘蔗挂上标签牌，8月9日测定挂着标签的甘蔗株高和茎径，以后每隔10 d测定一次。
1.2.3 模糊隶属函数[19]
j=1，2，3，...， n （1）
j=1，2，3，...，n （2）
j=1，2，3，...，n （3）
式中，Xmin表示参试材料中某一指标抗旱系数的最小值，Xmax为最大值，若指标性状与抗旱性呈正相关，则用上述公式计算其隶属函数值;反之则用1Z（Xj）即公式（2）表示;公式（3）表示抗旱隶属度，即i基因型各指标的抗旱隶属函数平均值，n是测定指标数。
1.3 数据分析
采用Microsoft Excel 2007软件的一般通用公式对各项形态指标和生理指标的原始数据进行整理，用DPS数据处理系统[20]进行灰色关联度分析、相关分析和聚类分析。采用卡方距离、可变类平均法对8项形态及生理生化指标数据进行系统聚类分析。
2 结果与分析
2.1 不同水分胁迫条件下各参试材料测定指标数值的差异性分析
从表2可以看出，不同水分胁迫处理对参试材料主要测定指标均有显著影响，参试材料的Diameter、SOD和POD酶活性在轻度胁迫与正常供水间的差异不显著，但其重度胁迫与轻度胁迫、重度胁迫与正常供水间差异极显著;MDA含量在轻度胁迫与正常供水间的差异不显著，但其重度胁迫与正常供水间的差异显著;PMP和Pro轻度、重度胁迫间差异不显著，其余指标差异显著。从变异系数来看，除轻度水分胁迫下MDA的变异系数超过80%外，其余指标的變异系数均低于65%，说明所选指标对水分胁迫敏感，水分胁迫处理试验效果较好。
在不同水分胁迫下，参试材料的株高与正常供水相比较数值明显较低，株高（Hight）在轻度、重度水分胁迫间的差异显著，但其轻度胁迫与正常供水间的差异不显著;茎径（Diameter）在轻度水分胁迫时，仍然在长粗，但轻度胁迫与正常供水间差异不显著，在重度水分胁迫时，茎径受到明显影响;质膜透性（PMP）在水分胁迫下，细胞膜脂的过氧化作用加剧，细胞质膜透性增大，轻度、重度水分胁迫间PMP含量的差异不明显，但轻度胁迫与正常供水、重度胁迫与正常供水间的差异均达到极显著水平;丙二醛（MDA）是膜
脂过氧化的产物之一，常被用作衡量脂质过氧化程度的指标[21]。由表2可知，在水分胁迫下，MDA含量明显增加，轻度、重度水分胁迫间MDA的含量差异显著，但轻度水分胁迫与正常供水间的MDA含量差异不显著，说明甘蔗在轻度水分胁迫环境时，生物膜有一定程度的破坏，MDA含量慢慢积累，在重度水分胁迫下，生物膜破坏加大，MDA含量大量积累;水分胁迫下叶绿素（CHL）含量的变化，可以指示植物对水分胁迫的敏感性[22]。由表2可知，轻度、重度水分胁迫与正常供水3种水分处理间的叶绿素含量差异显著，说明参试材料对水分胁迫反应较敏感，甘蔗叶片内叶绿素降解的快;脯氨酸（Pro）是植物体内的渗透调节物质，在水分胁迫下，Pro会大量积累，增加了细胞质浓度，降低渗透势，从而保持水分和各生理活动正常进行，缓解细胞脱水伤害。由表2可知，轻度、重度水分胁迫间的Pro含量差异不显著，但其与正常供水差异显著，轻度、重度水分胁迫下Pro含量明显高于正常供水;POD和SOD是保护酶系统中重要成员，在水分胁迫下植物抗旱能力和受伤害程度与保护酶的活性变化密切相关。在轻度、重度水分胁迫下，POD和SOD的活性明显增加，轻度、重度水分胁迫处理间差异不显著，但其与正常供水间的差异较显著。
2.2 参试材料对水分胁迫的响应
参试材料在不同水分胁迫条件下各项测定指标的增减变化幅度详见表3，从表中可以看出植物各项指标在水分亏缺情况下的敏感程度。在对参试材料进行水分胁迫时，甘蔗叶片中的PMP、Pro、SOD和POD含量增加，株高数值下降，茎径的数值在轻度胁迫时上升，在重度胁迫却下降，其变化幅度因甘蔗的基因型差异而不同。CHL、SOD和POD酶活性的变化幅度表现为重度胁迫大于轻度胁迫，其余5个指标因甘蔗基因型不同而呈现出不同的规律，其中MDA和CHL轻度、重度胁迫变化幅度的数值大小差别较大，茎径在轻度胁迫时数值变化幅度为正值，在重度胁迫时数值变化幅度为负值，从数值变化幅度看茎径在轻度胁迫时任再长粗，在重度胁迫时受到影响。
在水分重度胁迫下，云瑞2012-9-60、云瑞2012-10-20和云瑞2012-38-5响应最敏感，出现叶面枯黄卷曲现象，云瑞2012-38-5直接枯死。3份材料的生理生化指标测定为，PMP（145.6%～ 174.3%）、MDA（91.0%～148.4%）和CHL（72.6%～93.6%）增幅较大。云瑞2012-9-22、云瑞2012-9-60、云瑞2012-9-108、云瑞2012-10-20、云瑞2012-38-1、云瑞2012-38-76等材料的SOD酶活性变化幅度在1.0%～4.7%之间，增幅小于5%;云瑞2012-10-20、云瑞2012-38-38和云瑞2012-38-84等POD酶活性变化幅度在0.5%～1.7%之间，增幅小于2%，不能有效缓解干旱给膜系统带来的伤害。云瑞2012-9-108、云瑞2012-38-37和云瑞2012-38-81的渗透调节物质脯氨酸含量均低过30%。
2.3 隶属函数分析
从表4的隶属函数分析结果可以看出，在轻度、重度水分胁迫下参试材料的隶属度及耐旱性排序不同。云瑞2012-9-11、云瑞2012-38-81、云瑞2012-38-1和云瑞2012-9-108等在水分轻度胁迫下，隶属函数值较大，表现出较好的抗旱性，但在水分重度胁迫时隶属函数值较小，抗旱性较差;云瑞2012-38-81、云瑞2012-38-1、云瑞2012-9-108、云瑞2012-38-76等材料在水分轻度胁迫时，隶属函数值排序分别位于第2、3、4、6位，但在水分重度胁迫时，隶属函数值排序却位于第6、11、12、2位。在水分重度胁迫条件下，植物缺水表现比较充分，各项变化指标比较明显。方差分析结果表明，选择的8项测定指标中，除PMP、MDA和Pro轻度、重度胁迫间差异不显著 外另外5项差异显著，其中Diameter、CHL、SOD和POD轻度、重度胁迫间差异达到极显著水平。重度水分胁迫下，测定指标结果与植物在严重缺水时的症状表现基本吻合，因此表4以重度胁迫下参试材料的隶属值排序来表示其耐旱性。
在参试的12份材料中，云瑞2012-38-5、云瑞2012-38-76和云瑞2012-9-11的耐旱性分别位于前3位，云瑞2012-9-108、云瑞2012-38-1和云瑞2012-38-37的耐旱性较差，其中云瑞2012-9-108和云瑞2012-38-1在轻度胁迫时表现出较强的抗旱性，随着水分胁迫强度的不断加大，当胁迫达到一定程度时，其耐旱性表现为较差。
从正反交情况来看，在轻度水分胁迫下，正交后代云瑞2012-9-11、云瑞2012-9-22、云瑞2012-9-60、云瑞2012-9-108分别位于第1、7、9、4位，反交后代除云瑞2012-38-81、云瑞2012-38-84和云瑞2012-38-5位于前5位外，其余材料均排在第5位后面，从排前5位材料的数量上看，正交后代比反交后代多;在重度水分胁迫下，正交后代云瑞2012-9-11、云瑞2012-9-22、云瑞2012-9-60、云瑞2012-9-108分别位于第3、4、5、12位，反交后代除云瑞2012-38-76和云瑞2012-38-5位于前5位外，其余均排在第5位后面，从排前5位材料的数量上看，正交后代比反交多。
2.4 参试材料在不同水分胁迫下的抗旱性系统聚类分析
以12份大茎野生种57NG208与南涧果蔗正反交后代材料的8项指标进行系统聚类分析，从图1可知，12份参试材料在轻度、重度水分胁迫下，均可分为4大类别（图1A，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ，图1B，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ），其中在水分轻度胁迫下见图1A，Ⅰ类有2份，Ⅱ类4份、Ⅲ类3份、Ⅳ类3份;在重度水分胁迫下见图1B，Ⅰ类有2份，Ⅱ类4份、Ⅲ类1份、Ⅳ类5份。此分类结果与隶属函数分类结果基本一致，但有个别材料存在偏差。在轻度水分胁迫下，第Ⅰ类和第Ⅳ类材料的耐旱性最好，第Ⅱ类耐旱性次之，第Ⅲ类材料耐旱性较差，7份正交材料分布在第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类;在水分重度胁迫下，第Ⅰ类和第Ⅳ类的部分材料耐旱性最好，第Ⅲ、Ⅱ类耐旱性次之，7份正交材料分布在第Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ类。从轻度、重度水分胁迫的聚类结果来看，云瑞2012-9-11和云瑞2012-38-81的耐旱性较好，无论轻度、重度
A：轻度水分胁迫;B：重度水分胁迫。
A： Mild water stress; B： Severe water stress.
图1 大茎野生种57NG208与南涧果蔗正反交
后代耐旱性聚类分析
Fig. 1 Drought tolerance cluster of the progeny from reciprocal crosses between Saccharum robustum 57NG208 and Nanjian chewing cane
水分胁迫处理均聚为一类;其余材料聚类结果差别较大，在重度水分胁迫下对8项指标的系统积累与隶属函数分析结果有差别，但总体趋势基本吻合。
2.5 测定指标与耐旱性之间的灰色关联度分析
参照田春艳等[23]的方法，利用DPS软件进行灰色关联度分析。结果表明，在轻度、重度水分胁迫下，8项目测定指标与耐旱性的关联度不同，说明不同基因型的植物在不同水分胁迫下，各个指标对抗旱的响应程度不一样。轻度水分胁迫下，各指标与甘蔗耐旱性间的关联密切程度依次为：CHL>Pro>POD>SOD>Hight>Diameter>MDA>PMP，关联系数分别为0.5872、0.4587、0.4126、0.4077、0.3915、0.3855、0.3656和0.3367;重度胁迫下，其关联度依次为CHL>Pro>POD>Hight>MDA>SOD>Diameter>PMP，关联系数分别为0.7792、0.5175、0.4306、0.4259、0.4227、0.3709、0.3198和0.2562。叶绿素含量、脯氨酸含量和POD酶活性无论是在轻度水分胁迫下，还是重度水分胁迫下均与甘蔗耐旱性关联度最高，而质膜透性在轻度、重度水分胁迫下均与甘蔗耐旱性关联度最低。
2.6 测定指标与耐旱性之间的相关分析
从表5可以看出，在不同程度的水分胁迫下，甘蔗各个指标与耐旱性的相关程度不一致，在轻度、重度水分胁迫下，甘蔗的耐旱机制不同，各指标的敏感程度也不一样。在轻度水分胁迫下，Hight、Diameter、PMP、CHL、Pro、SOD和POD与耐旱性呈正相关，其中Diameter、CHL和SOD与耐旱性呈显著正相关，POD与耐旱性呈极显著正相关;在重度水分胁迫下，Diameter与耐旱性呈负相关，CHL与耐旱性呈显著正相关，其余6项指标与耐旱性呈正相关。
3 讨论
作物抗旱性是一个复杂的生物学数量性状，是众多因素﹑多种机制共同作用的结果，最终通过各种指标在不同生育时期的一系列变化表现出来，因而指标性状的合理选择是抗旱性鉴定的关键[22]。目前，国内外的大量研究表明，作物抗旱性鉴定指标大致可分为形态生长指标和生理生化指标2大类，其中形态结构能够直观地反映出作物对干旱的响应，是人们对作物抗旱性研究最早﹑最多的指标[24];作物在水分胁迫下生理生化代谢涉及面较广，前人研究也较深入，主要集中在生理渗透调节和保护酶活性两方面。不同学者针对不同的作物筛选出了不同的抗旱指标[24-29]，对其抗旱性作出综合性评价分析。赵俊等[30]、李广敏等[31]、叶燕萍等[32]对甘蔗的耐旱性研究表明，株高、茎径是反映甘蔗生长状态的重要因子，充裕的水分可促进甘蔗植株的生长，干旱对甘蔗株高的影响比茎径更大[33]，在轻度、重度水分胁迫下，株高、茎径与耐旱性之间的灰色关联度排序结果正佐证了该研究结论;另外，MDA（丙二醛）含量和PMP（质膜透性）已被国家九五重点科技攻关项目96-002-02-15专题和国家十五863糖料新品种选育课题采纳为全国统一的鉴定指标[34]。本研究中PMP、MDA、Pro和CHL的变化情况与兰靖等[35]、杨建波等[36]研究认为干旱胁迫会导致甘蔗品种（系）的叶片膜透性增大，丙二醛、脯氨酸的含量显著升高，叶绿素有不同程度地下降的结论相吻合。在轻度、重度水分胁迫下，12份甘蔗的SOD活性、POD活性和Chl、Pro含量变化存在品种（系）差异与周桂等[37]和陆国盈等[38]的研究结论一致。其次，本研究结论CHL、Pro和POD是甘蔗耐旱性評价的优良指标与田春艳等[23]的研究结论（PMP、MDA、CHL、SOD酶活性和POD酶活性等是可靠的抗逆评价指标，而对于脯氨酸的可靠性则仍存在较大的争议）不一致。出现这种情况可能有以下几方面的原因：（1）研究材料的血缘基础不同，本研究的主要对象是12份大茎野生种57NG208与热带种南涧果蔗的正反交后代;（2）评价指标的不同，本研究采用直观的形态指标和生理生化指标相结合的方法进行评价;（3）样本群体数量不同。 甘蔗在生理生化方面对水分胁迫的响应主要是渗透调节和保护酶活性。在甘蔗水分亏缺时，甘蔗叶片失水，细胞膜脂过氧化作用加剧，膜脂过氧化最终产物MDA增加，细胞质膜透性增大。同时，甘蔗叶片内叶绿素大量降解，体内的渗透调节物质脯氨酸积累来增加细胞质浓度，降低渗透势，缓解细胞脱水伤害;其植物体内的氧自由基含量及种类也会大量增多，此时SOD和POD酶活性增强。本研究在轻度、重度水分胁迫下，8项测定指标与耐旱性（隶属函数值）进行相关分析结果显示，在重度水分胁迫下Diameter与耐旱性呈负相关，CHL与耐旱性呈显著正相关，其余6项指标与耐旱性呈正相关，该结论与甘蔗对水分胁迫的生理生化响应机制吻合，因此在对12份材料进行耐旱性排序时选用重度水分胁迫下的隶属函数值。
本研究中云瑞2012-38-5在轻度水分胁迫时耐旱性最差，在重度水分胁迫下且表现出较好的耐旱性;云瑞2012-9-108和云瑞2012-38-1在轻度水分胁迫时耐旱性很强，而在重度水分胁迫下却表现出较弱的耐旱性。这与田春艳等[23]对5种气候生态型割手密F1和F2杂种的耐旱性评价研究结果一致，也与白向历等[39]对玉米的抗旱性研究结果一致，即同一基因型的作物在不同程度的干旱胁迫下，抗旱评价结果也会不同，当然也不排除试验误差。
4 结论
在水分胁迫下，12份大茎野生种57NG208与南涧果蔗正反交后代材料中，云瑞2012-38-5、云瑞2012-38-76和云瑞2012-9-11等3份材料的抗旱性较强，其中云瑞2012-9-11无论在轻度、重度水分胁迫下，耐旱性排名均位于前3位;云瑞2012-38-5和云瑞2012-38-1在轻度水分胁迫时耐旱性最差，在重度水分胁迫下且表现出较好的耐旱性。在聚类分析中，云瑞2012-9-11和云瑞2012-38-81的耐旱性较好，无论轻度、重度水分胁迫处理均聚为一类;参试材料在轻度、重度水分胁迫下聚类结果差别较大;12份大茎野生种57NG208与南涧果蔗正反交后代，在轻度、重度胁迫下，耐旱性排序中正交材料排在前5位的数量比反交材料多;相关分析表明，在不同程度的水分胁迫下，甘蔗各个指标与耐旱性的相关程度不一致，在轻度水分胁迫下，Hight、Diameter、PMP、CHL、Pro、SOD和POD与耐旱性呈正相关，在重度水分胁迫下，Diameter与耐旱性呈负相关，CHL与耐旱性呈显著正相关，其余6项指标与耐旱性呈正相关;8项测定指标中，CHL含量、Pro含量和POD酶活性无论是轻度水分胁迫下，还是重度水分胁迫下均与甘蔗耐旱性关联度最高，是耐旱性评价的优良指标。
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关键词 甘蔗;大茎野生种;南涧果蔗;正反交;灰色关联度分析;聚类分析
中图分类号 S566.103 文献标识码 A
甘蔗是我国重要的糖料作物，蔗糖产量占中国食糖总产的90%以上[1]。水是制约甘蔗产量的重要因素，有研究表明，约30%的甘蔗产量取决于合适的水分供应[2]。近年来，缺水无灌溉条件的山地、旱坡地成为中国甘蔗生产发展的地方，我国旱地植蔗面积约占全国植蔗总面积的80%，广西和云南蔗田的有效灌溉面积分别仅占各省蔗田总面积的8%和14.4%，与蔗糖先进国家相差6～7倍，干旱已成为制约我国蔗糖生产的关键因素之一，严重影响我国糖业的国际竞争力[3]。此外，现有主栽品种已经出现种性退化，产量减少和品质变劣，目前急需扩宽杂交亲本野生种血缘，实现亲本抗逆性突破。大茎野生种别名伊里安野生种（Saccharum robustum L.），具有植株高大、长势旺盛、茎硬抗风、抗虫、宿根性强、生物产量高等特点，用于拓宽甘蔗遗传基础及品种改良有十分重要意义。因此开展野生甘蔗创新种质的抗旱性研究，筛选出抗旱性强的甘蔗杂交亲本或新品种，提供全国甘蔗育种机构应用，从而提高育种效率，增强旱地甘蔗水分利用效率，对我国蔗糖产业的可持续发展具有重要意义。
作物的抗旱节水性是复杂的数量性状[4]，既受多基因遗传控制，又与外界环境条件变化息息相关[5-6]。多年来，国内外很多学者从不同角度研究作物抗旱性指标和鉴定方法，高三基等[7]研究膜脂过氧化代谢、质膜透性及光合参数与甘蔗品种抗旱性的关系，建立相应的判别模型。卢会文等[8]认为，叶片衰老枯黄情况与株高伤害度结果较为一致，而株高伤害度与叶面积伤害度存在显著相关;对多个指标进行综合评价时，常采用模糊隶属函数法[9-12]、抗旱性度量值（D值）[13]、逐步判别分析法[7]、聚类分析[14]等方法对甘蔗农艺性状和生理特性进行抗旱性评价。本研究利用云南省农业科学院甘蔗研究所瑞丽育种站所保育的大茎野生种57NG208与热带、亚热带蔗区适应性极广的热带种南涧果蔗进行正反交，在前期对132个真杂种后代遗传变异分析[15]的基础上，筛选出12份代表材料，测定与抗旱性相关的形态学及生理生化指标，并利用隶属函数分析﹑灰色关联度分析和聚类分析相结合的方法，比较其拔节期耐旱性的强弱，以期为大茎野生种在抗旱种质资源评价筛选及抗旱新品种选育提供一定的参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料
参试材料及亲本信息详见表1。
1.2 方法
1.2.1 试验设计 试验于2017年3月10日，布置在云南省农业科学院甘蔗研究所瑞丽育种站抗旱温室，对参试材料单芽砍种桶栽，每桶栽种5个单芽，每个材料设轻度水分胁迫﹑重度水分胁迫和正常供水3个处理，每个处理3桶。于2017年9月27日把所有材料分成3个组，其中第1组作为对照正常供水，2、3组停止供水进行胁迫，其中对第2组进行轻度胁迫处理，第3组作重度胁迫处理。7 d后，处理材料呈轻微萎蔫状态，在清晨无“吐水”时，对第2组材料进行抗旱生理生化指标测定，而第3组继续进行胁迫，15 d后待第3组较第1组（对照组）三分之一以上材料出现永久萎蔫、叶片枯黄卷曲、少部分甚至枯死等严重缺水症状时进行重度胁迫抗旱指标的测定，同时再次测定对照组材料。
1.2.2 测定指标及方法 （1）生理指标测定 从胁迫处理的3桶甘蔗中，每桶各取1株甘蔗的+1叶及心叶，共6片，迅速带回实验室，用自来水漂洗叶片以除去表面沾污物，再用去离子水冲洗一次，用干净的纱布轻轻吸干表面的水分，混合叶片（各材料的+1叶混在一起，心叶混在一起）后进行生理指标的测定。其中，相对质膜透性（PMP）采用雷磁DDSJ2308型电导仪参照张宪政[16]的方法测定;采用SPAD叶绿素仪测定叶绿素（CHL）含量;参照李忠光等[17]的方法测定丙二醛含量（MDA）和脯氨酸（Pro）含量，其中丙二醛含量（MDA）采用硫代巴比妥酸显色法，脯氨酸（Pro）含量采用酸性茚三酮法测定。其中，叶片质膜透性（plasma membrane permeability，PMP）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、叶绿素（chlorophyll，CHL）和脯氨酸（proline，Pro）含量的测定用+1叶，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和过氧化物酶（peroxidase，POD）酶活性的测定需用心叶参照王学奎[18]的方法。 （2）形态指标测定 株高茎径于抗旱胁迫前的8月8日对胁迫处理组的每个桶选择一根甘蔗挂上标签牌，8月9日测定挂着标签的甘蔗株高和茎径，以后每隔10 d测定一次。
1.2.3 模糊隶属函数[19]
j=1，2，3，...， n （1）
j=1，2，3，...，n （2）
j=1，2，3，...，n （3）
式中，Xmin表示参试材料中某一指标抗旱系数的最小值，Xmax为最大值，若指标性状与抗旱性呈正相关，则用上述公式计算其隶属函数值;反之则用1Z（Xj）即公式（2）表示;公式（3）表示抗旱隶属度，即i基因型各指标的抗旱隶属函数平均值，n是测定指标数。
1.3 数据分析
采用Microsoft Excel 2007软件的一般通用公式对各项形态指标和生理指标的原始数据进行整理，用DPS数据处理系统[20]进行灰色关联度分析、相关分析和聚类分析。采用卡方距离、可变类平均法对8项形态及生理生化指标数据进行系统聚类分析。
2 结果与分析
2.1 不同水分胁迫条件下各参试材料测定指标数值的差异性分析
从表2可以看出，不同水分胁迫处理对参试材料主要测定指标均有显著影响，参试材料的Diameter、SOD和POD酶活性在轻度胁迫与正常供水间的差异不显著，但其重度胁迫与轻度胁迫、重度胁迫与正常供水间差异极显著;MDA含量在轻度胁迫与正常供水间的差异不显著，但其重度胁迫与正常供水间的差异显著;PMP和Pro轻度、重度胁迫间差异不显著，其余指标差异显著。从变异系数来看，除轻度水分胁迫下MDA的变异系数超过80%外，其余指标的變异系数均低于65%，说明所选指标对水分胁迫敏感，水分胁迫处理试验效果较好。
在不同水分胁迫下，参试材料的株高与正常供水相比较数值明显较低，株高（Hight）在轻度、重度水分胁迫间的差异显著，但其轻度胁迫与正常供水间的差异不显著;茎径（Diameter）在轻度水分胁迫时，仍然在长粗，但轻度胁迫与正常供水间差异不显著，在重度水分胁迫时，茎径受到明显影响;质膜透性（PMP）在水分胁迫下，细胞膜脂的过氧化作用加剧，细胞质膜透性增大，轻度、重度水分胁迫间PMP含量的差异不明显，但轻度胁迫与正常供水、重度胁迫与正常供水间的差异均达到极显著水平;丙二醛（MDA）是膜
脂过氧化的产物之一，常被用作衡量脂质过氧化程度的指标[21]。由表2可知，在水分胁迫下，MDA含量明显增加，轻度、重度水分胁迫间MDA的含量差异显著，但轻度水分胁迫与正常供水间的MDA含量差异不显著，说明甘蔗在轻度水分胁迫环境时，生物膜有一定程度的破坏，MDA含量慢慢积累，在重度水分胁迫下，生物膜破坏加大，MDA含量大量积累;水分胁迫下叶绿素（CHL）含量的变化，可以指示植物对水分胁迫的敏感性[22]。由表2可知，轻度、重度水分胁迫与正常供水3种水分处理间的叶绿素含量差异显著，说明参试材料对水分胁迫反应较敏感，甘蔗叶片内叶绿素降解的快;脯氨酸（Pro）是植物体内的渗透调节物质，在水分胁迫下，Pro会大量积累，增加了细胞质浓度，降低渗透势，从而保持水分和各生理活动正常进行，缓解细胞脱水伤害。由表2可知，轻度、重度水分胁迫间的Pro含量差异不显著，但其与正常供水差异显著，轻度、重度水分胁迫下Pro含量明显高于正常供水;POD和SOD是保护酶系统中重要成员，在水分胁迫下植物抗旱能力和受伤害程度与保护酶的活性变化密切相关。在轻度、重度水分胁迫下，POD和SOD的活性明显增加，轻度、重度水分胁迫处理间差异不显著，但其与正常供水间的差异较显著。
2.2 参试材料对水分胁迫的响应
参试材料在不同水分胁迫条件下各项测定指标的增减变化幅度详见表3，从表中可以看出植物各项指标在水分亏缺情况下的敏感程度。在对参试材料进行水分胁迫时，甘蔗叶片中的PMP、Pro、SOD和POD含量增加，株高数值下降，茎径的数值在轻度胁迫时上升，在重度胁迫却下降，其变化幅度因甘蔗的基因型差异而不同。CHL、SOD和POD酶活性的变化幅度表现为重度胁迫大于轻度胁迫，其余5个指标因甘蔗基因型不同而呈现出不同的规律，其中MDA和CHL轻度、重度胁迫变化幅度的数值大小差别较大，茎径在轻度胁迫时数值变化幅度为正值，在重度胁迫时数值变化幅度为负值，从数值变化幅度看茎径在轻度胁迫时任再长粗，在重度胁迫时受到影响。
在水分重度胁迫下，云瑞2012-9-60、云瑞2012-10-20和云瑞2012-38-5响应最敏感，出现叶面枯黄卷曲现象，云瑞2012-38-5直接枯死。3份材料的生理生化指标测定为，PMP（145.6%～ 174.3%）、MDA（91.0%～148.4%）和CHL（72.6%～93.6%）增幅较大。云瑞2012-9-22、云瑞2012-9-60、云瑞2012-9-108、云瑞2012-10-20、云瑞2012-38-1、云瑞2012-38-76等材料的SOD酶活性变化幅度在1.0%～4.7%之间，增幅小于5%;云瑞2012-10-20、云瑞2012-38-38和云瑞2012-38-84等POD酶活性变化幅度在0.5%～1.7%之间，增幅小于2%，不能有效缓解干旱给膜系统带来的伤害。云瑞2012-9-108、云瑞2012-38-37和云瑞2012-38-81的渗透调节物质脯氨酸含量均低过30%。
2.3 隶属函数分析
从表4的隶属函数分析结果可以看出，在轻度、重度水分胁迫下参试材料的隶属度及耐旱性排序不同。云瑞2012-9-11、云瑞2012-38-81、云瑞2012-38-1和云瑞2012-9-108等在水分轻度胁迫下，隶属函数值较大，表现出较好的抗旱性，但在水分重度胁迫时隶属函数值较小，抗旱性较差;云瑞2012-38-81、云瑞2012-38-1、云瑞2012-9-108、云瑞2012-38-76等材料在水分轻度胁迫时，隶属函数值排序分别位于第2、3、4、6位，但在水分重度胁迫时，隶属函数值排序却位于第6、11、12、2位。在水分重度胁迫条件下，植物缺水表现比较充分，各项变化指标比较明显。方差分析结果表明，选择的8项测定指标中，除PMP、MDA和Pro轻度、重度胁迫间差异不显著 外另外5项差异显著，其中Diameter、CHL、SOD和POD轻度、重度胁迫间差异达到极显著水平。重度水分胁迫下，测定指标结果与植物在严重缺水时的症状表现基本吻合，因此表4以重度胁迫下参试材料的隶属值排序来表示其耐旱性。
在参试的12份材料中，云瑞2012-38-5、云瑞2012-38-76和云瑞2012-9-11的耐旱性分别位于前3位，云瑞2012-9-108、云瑞2012-38-1和云瑞2012-38-37的耐旱性较差，其中云瑞2012-9-108和云瑞2012-38-1在轻度胁迫时表现出较强的抗旱性，随着水分胁迫强度的不断加大，当胁迫达到一定程度时，其耐旱性表现为较差。
从正反交情况来看，在轻度水分胁迫下，正交后代云瑞2012-9-11、云瑞2012-9-22、云瑞2012-9-60、云瑞2012-9-108分别位于第1、7、9、4位，反交后代除云瑞2012-38-81、云瑞2012-38-84和云瑞2012-38-5位于前5位外，其余材料均排在第5位后面，从排前5位材料的数量上看，正交后代比反交后代多;在重度水分胁迫下，正交后代云瑞2012-9-11、云瑞2012-9-22、云瑞2012-9-60、云瑞2012-9-108分别位于第3、4、5、12位，反交后代除云瑞2012-38-76和云瑞2012-38-5位于前5位外，其余均排在第5位后面，从排前5位材料的数量上看，正交后代比反交多。
2.4 参试材料在不同水分胁迫下的抗旱性系统聚类分析
以12份大茎野生种57NG208与南涧果蔗正反交后代材料的8项指标进行系统聚类分析，从图1可知，12份参试材料在轻度、重度水分胁迫下，均可分为4大类别（图1A，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ，图1B，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ），其中在水分轻度胁迫下见图1A，Ⅰ类有2份，Ⅱ类4份、Ⅲ类3份、Ⅳ类3份;在重度水分胁迫下见图1B，Ⅰ类有2份，Ⅱ类4份、Ⅲ类1份、Ⅳ类5份。此分类结果与隶属函数分类结果基本一致，但有个别材料存在偏差。在轻度水分胁迫下，第Ⅰ类和第Ⅳ类材料的耐旱性最好，第Ⅱ类耐旱性次之，第Ⅲ类材料耐旱性较差，7份正交材料分布在第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类;在水分重度胁迫下，第Ⅰ类和第Ⅳ类的部分材料耐旱性最好，第Ⅲ、Ⅱ类耐旱性次之，7份正交材料分布在第Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ类。从轻度、重度水分胁迫的聚类结果来看，云瑞2012-9-11和云瑞2012-38-81的耐旱性较好，无论轻度、重度
A：轻度水分胁迫;B：重度水分胁迫。
A： Mild water stress; B： Severe water stress.
图1 大茎野生种57NG208与南涧果蔗正反交
后代耐旱性聚类分析
Fig. 1 Drought tolerance cluster of the progeny from reciprocal crosses between Saccharum robustum 57NG208 and Nanjian chewing cane
水分胁迫处理均聚为一类;其余材料聚类结果差别较大，在重度水分胁迫下对8项指标的系统积累与隶属函数分析结果有差别，但总体趋势基本吻合。
2.5 测定指标与耐旱性之间的灰色关联度分析
参照田春艳等[23]的方法，利用DPS软件进行灰色关联度分析。结果表明，在轻度、重度水分胁迫下，8项目测定指标与耐旱性的关联度不同，说明不同基因型的植物在不同水分胁迫下，各个指标对抗旱的响应程度不一样。轻度水分胁迫下，各指标与甘蔗耐旱性间的关联密切程度依次为：CHL>Pro>POD>SOD>Hight>Diameter>MDA>PMP，关联系数分别为0.5872、0.4587、0.4126、0.4077、0.3915、0.3855、0.3656和0.3367;重度胁迫下，其关联度依次为CHL>Pro>POD>Hight>MDA>SOD>Diameter>PMP，关联系数分别为0.7792、0.5175、0.4306、0.4259、0.4227、0.3709、0.3198和0.2562。叶绿素含量、脯氨酸含量和POD酶活性无论是在轻度水分胁迫下，还是重度水分胁迫下均与甘蔗耐旱性关联度最高，而质膜透性在轻度、重度水分胁迫下均与甘蔗耐旱性关联度最低。
2.6 测定指标与耐旱性之间的相关分析
从表5可以看出，在不同程度的水分胁迫下，甘蔗各个指标与耐旱性的相关程度不一致，在轻度、重度水分胁迫下，甘蔗的耐旱机制不同，各指标的敏感程度也不一样。在轻度水分胁迫下，Hight、Diameter、PMP、CHL、Pro、SOD和POD与耐旱性呈正相关，其中Diameter、CHL和SOD与耐旱性呈显著正相关，POD与耐旱性呈极显著正相关;在重度水分胁迫下，Diameter与耐旱性呈负相关，CHL与耐旱性呈显著正相关，其余6项指标与耐旱性呈正相关。
3 讨论
作物抗旱性是一个复杂的生物学数量性状，是众多因素﹑多种机制共同作用的结果，最终通过各种指标在不同生育时期的一系列变化表现出来，因而指标性状的合理选择是抗旱性鉴定的关键[22]。目前，国内外的大量研究表明，作物抗旱性鉴定指标大致可分为形态生长指标和生理生化指标2大类，其中形态结构能够直观地反映出作物对干旱的响应，是人们对作物抗旱性研究最早﹑最多的指标[24];作物在水分胁迫下生理生化代谢涉及面较广，前人研究也较深入，主要集中在生理渗透调节和保护酶活性两方面。不同学者针对不同的作物筛选出了不同的抗旱指标[24-29]，对其抗旱性作出综合性评价分析。赵俊等[30]、李广敏等[31]、叶燕萍等[32]对甘蔗的耐旱性研究表明，株高、茎径是反映甘蔗生长状态的重要因子，充裕的水分可促进甘蔗植株的生长，干旱对甘蔗株高的影响比茎径更大[33]，在轻度、重度水分胁迫下，株高、茎径与耐旱性之间的灰色关联度排序结果正佐证了该研究结论;另外，MDA（丙二醛）含量和PMP（质膜透性）已被国家九五重点科技攻关项目96-002-02-15专题和国家十五863糖料新品种选育课题采纳为全国统一的鉴定指标[34]。本研究中PMP、MDA、Pro和CHL的变化情况与兰靖等[35]、杨建波等[36]研究认为干旱胁迫会导致甘蔗品种（系）的叶片膜透性增大，丙二醛、脯氨酸的含量显著升高，叶绿素有不同程度地下降的结论相吻合。在轻度、重度水分胁迫下，12份甘蔗的SOD活性、POD活性和Chl、Pro含量变化存在品种（系）差异与周桂等[37]和陆国盈等[38]的研究结论一致。其次，本研究结论CHL、Pro和POD是甘蔗耐旱性評价的优良指标与田春艳等[23]的研究结论（PMP、MDA、CHL、SOD酶活性和POD酶活性等是可靠的抗逆评价指标，而对于脯氨酸的可靠性则仍存在较大的争议）不一致。出现这种情况可能有以下几方面的原因：（1）研究材料的血缘基础不同，本研究的主要对象是12份大茎野生种57NG208与热带种南涧果蔗的正反交后代;（2）评价指标的不同，本研究采用直观的形态指标和生理生化指标相结合的方法进行评价;（3）样本群体数量不同。 甘蔗在生理生化方面对水分胁迫的响应主要是渗透调节和保护酶活性。在甘蔗水分亏缺时，甘蔗叶片失水，细胞膜脂过氧化作用加剧，膜脂过氧化最终产物MDA增加，细胞质膜透性增大。同时，甘蔗叶片内叶绿素大量降解，体内的渗透调节物质脯氨酸积累来增加细胞质浓度，降低渗透势，缓解细胞脱水伤害;其植物体内的氧自由基含量及种类也会大量增多，此时SOD和POD酶活性增强。本研究在轻度、重度水分胁迫下，8项测定指标与耐旱性（隶属函数值）进行相关分析结果显示，在重度水分胁迫下Diameter与耐旱性呈负相关，CHL与耐旱性呈显著正相关，其余6项指标与耐旱性呈正相关，该结论与甘蔗对水分胁迫的生理生化响应机制吻合，因此在对12份材料进行耐旱性排序时选用重度水分胁迫下的隶属函数值。
本研究中云瑞2012-38-5在轻度水分胁迫时耐旱性最差，在重度水分胁迫下且表现出较好的耐旱性;云瑞2012-9-108和云瑞2012-38-1在轻度水分胁迫时耐旱性很强，而在重度水分胁迫下却表现出较弱的耐旱性。这与田春艳等[23]对5种气候生态型割手密F1和F2杂种的耐旱性评价研究结果一致，也与白向历等[39]对玉米的抗旱性研究结果一致，即同一基因型的作物在不同程度的干旱胁迫下，抗旱评价结果也会不同，当然也不排除试验误差。
4 结论
在水分胁迫下，12份大茎野生种57NG208与南涧果蔗正反交后代材料中，云瑞2012-38-5、云瑞2012-38-76和云瑞2012-9-11等3份材料的抗旱性较强，其中云瑞2012-9-11无论在轻度、重度水分胁迫下，耐旱性排名均位于前3位;云瑞2012-38-5和云瑞2012-38-1在轻度水分胁迫时耐旱性最差，在重度水分胁迫下且表现出较好的耐旱性。在聚类分析中，云瑞2012-9-11和云瑞2012-38-81的耐旱性较好，无论轻度、重度水分胁迫处理均聚为一类;参试材料在轻度、重度水分胁迫下聚类结果差别较大;12份大茎野生种57NG208与南涧果蔗正反交后代，在轻度、重度胁迫下，耐旱性排序中正交材料排在前5位的数量比反交材料多;相关分析表明，在不同程度的水分胁迫下，甘蔗各个指标与耐旱性的相关程度不一致，在轻度水分胁迫下，Hight、Diameter、PMP、CHL、Pro、SOD和POD与耐旱性呈正相关，在重度水分胁迫下，Diameter与耐旱性呈负相关，CHL与耐旱性呈显著正相关，其余6项指标与耐旱性呈正相关;8项测定指标中，CHL含量、Pro含量和POD酶活性无论是轻度水分胁迫下，还是重度水分胁迫下均与甘蔗耐旱性关联度最高，是耐旱性评价的优良指标。
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