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摘要：【目的】制备出能有效防御黄鳝出血病的三联微胶囊口服疫苗，促进黄鳝养殖业健康发展。【方法】以嗜水气单胞菌、弗氏柠檬酸杆菌及温和气单胞菌为抗原，海藻酸钠为壁材，利用乳化法制备三联微胶囊口服疫苗，然后直接拌入饵料对健康黄鳝进行口服免疫，7 d后进行加强免疫，测定各项血清免疫指标。加强免疫结束15 d后，经腹腔注射3种活菌（1.0×109 CFU/mL）进行攻毒试验，检验三联微胶囊口服疫苗对黄鳝的免疫保护率。【结果】制备获得的三联微胶囊口服疫苗的平均粒径为44.5 μm，平均含菌量为4.56×109 CFU/mg。按0.4和0.6 g/kg的剂量口服免疫黄鳝，其血清补体C3含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性、酸性磷酸酶（ACP）活性均显著高于对照组（P<0.05），血清平均抗体效价分别为7.5949和11.0651，对应的免疫保护率为60%和65%，且0.6 g/kg剂量组的各项指标均高于0.4 g/kg剂量组。【结论】制备获得的三联微胶囊口服疫苗能显著提高黄鳝血清SOD、ACP活性及刺激血清补体C3产生，有效抵御由嗜水气单胞菌、温和气单胞菌和弗氏柠檬酸杆菌引起的出血病，生产使用时须进行加强免疫，并适当加大免疫剂量。
关键词： 黄鳝；出血病；三联微胶囊口服疫苗；补体C3；超氧化物歧化酶；酸性磷酸酶；抗体效价；免疫保护率
中图分类号： S966.4 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）06-1039-06
0 引言
【研究意义】黄鳝（Monopterus albus）不仅有丰富的营养价值，还具有重要的药用价值。近年来，由于养殖密度加大、集约化程度加快及疾病研究的滞后，黄鳝病害日趋严重。黄鳝出血病是导致其死亡的主要疾病之一，具有发病快、传染性强、死亡率高等特点，如处理不及时通常会造成大批量死亡（陈怀青和陆承平，1991），但至今尚无有效的治疗方法，仍以预防为主。长期使用化学药物和抗生素进行鱼病防治极易造成药物残留、水域污染及致使部分病原产生耐药性等不良情况（殷睿，2005），与之相比，疫苗既可以提高鱼类机体的抗病能力，又不会造成环境污染和药物残留（黄宁和李海峰，2003）。多联口服疫苗是将两种及以上的疫苗同次使用或混合使用进行免疫，可预防由不同病原引起的多种疾病，或不同种病原引起的同一种疾病（李亚南等，1995；许宗丽等，2014），极大降低工人的劳动强度且操作方便，因此在实际生产中具有极高的应用价值。【前人研究进展】目前，已有较多关于黄鳝出血病的研究报道。陈怀青和陆承平（1991）从江苏某养殖场患出血病黄鳝的体内分离出嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila），且首次证实嗜水气单胞菌是黄鳝出血性败血症的病原菌；马有智和舒妙安（2000）从患出血病黄鳝苗种中分离出产碱假单胞菌（Pseudomonas alcaligenes）；沈锦玉等（2001）从浙江湖州某养殖场患出血病黄鳝的肝脏、肾脏中分离到致病菌，并证实该致病菌为嗜水气单胞菌；徐海圣和舒妙安（2003）从患出血病黄鳝体内分离出温和气单胞菌（Aeromonas sobria），经过人工回感试验，确定为黄鳝出血病的致病菌。在黄鳝疫病疫苗方面，仅徐海圣和舒妙安（2003）研制出黄鳝温和气单胞菌灭活疫苗，陈晓利和舒妙安（2013）制备出嗜水气单胞菌与温和气单胞菌的二联疫苗。【本研究切入点】现有文献鲜见弗氏柠檬酸菌（Citrobacter freundii）能引起黄鳝出血病的报道，将黄鳝出血病的3种致病菌（温和气单胞菌、嗜水气单胞菌和弗氏柠檬酸杆菌）制成全菌灭活三联微胶囊口服疫苗的研究也尚未见报道。【拟解决的关键问题】将黄鳝出血病的3种病原菌制成三联微胶囊口服疫苗，并对健康黄鳝进行免疫，探究黄鳝对此疫苗的免疫应答，以期有效防御黄鳝出血病，促进黄鳝养殖业健康发展。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
2015年7月3日从河南购入健康黄鳝苗种，体重30～50 g，体长30～45 cm。黄鳝苗在余干县瑞洪镇黄鳝养殖基地人工网箱养殖30 d，选择9个等重量的网箱进行试验，网箱投放密度2.5 kg/m2。海藻酸钠、植物油、氯化钙、吐温-80均为国产分析纯，超氧化物歧化酶（SOD）活性、酸性磷酸酶（ACP）活性检测试剂盒购自南京建成生物技术研究所。主要仪器设备有振荡培养箱、生化培养箱、紫外可见光分光光度计、pH计、双目生物显微镜、电动恒速搅拌机、冷冻干燥机、冰箱等。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 菌株来源及培养条件 3株病原菌分别是从患出血病黄鳝体内分离获得的嗜水气单胞菌、弗氏柠檬酸杆菌（杨宗英等，2015）及从中国科学院水生生物研究所购买的温和气单胞菌。将3株菌株分别接种于LB液体培养基中，28 ℃摇床培养24 h，一部分菌液用生理盐水调节至1.0×109 CFU/mL备用；一部分加入0.2%福尔马林灭活24 h，再用灭菌生理盐水离心（1500 r/min，10 min）洗涤3次，最后加入少量生理盐水用于制备微胶囊口服疫苗。
1. 2. 2 微胶囊疫苗制备 采用乳化法（Rodrigues et al.，2006）将等体积的3种菌液（共10 mL）加入到80 mL海藻酸钠溶液中，充分混合后加入乳化剂吐温-80，漩涡振荡器充分振荡至完全乳化，加入氯化钙溶液，用搅拌器充分搅拌至钙化形成均匀微胶囊，收集制得的微胶囊在冷冻干燥机中干燥过夜，制成三联微胶囊口服疫苗成品，4 ℃保存备用。
1. 2. 3 微胶囊疫苗检测 用显微镜观察三联微胶囊口服疫苗的形态并进行粒径测量。在清晰的视野中，随机选取50个微胶囊颗粒测量其直徑，取平均值；取0.10 g三联微胶囊口服疫苗溶于10 mL灭菌生理盐水中，按0.2 mL/尾的剂量对10尾外观健康的黄鳝进行腹腔注射，连续观察记录2周内的死亡情况。同时，准确称取制备的三联微胶囊口服疫苗0.01 g溶于100 mL经滤膜过滤除去死菌体的无颗粒水中，充分溶解后取1 mL进行10倍梯度稀释，取合适稀释度的试管以吖啶橙荧光直接镜检计数（徐怀恕等，1999），测定三联微胶囊口服疫苗含菌量。 1. 2. 4 试验饵料制备 以黄鳝的体重为标准，将制备的三联微胶囊口服疫苗分别按照0（对照）、0.4和0.6 g/kg混匀拌入黄鳝饵料中进行投喂。
1. 2. 5 三联微胶囊口服疫苗投喂量及投喂方法 在正常的养殖条件下，将9个网箱分为3个组，分别为试验组1、试验组2和对照组，每组3个重复。从2015年8月4日开始将三联微胶囊口服疫苗混匀至黄鳝饵料中进行投喂，其中，试验组1的三联微胶囊口服疫苗剂量为0.4 g/kg，试验组2的剂量为0.6 g/kg。两试验组在投喂7 d后暂停7 d，8月18号再按照同样的剂量继续投喂7 d进行加强免疫；对照组投喂未混入三联微胶囊口服疫苗的黄鳝饵料。
1. 2. 6 采血及免疫指标测定 在黄鳝加强免疫结束15 d后（9月10日），分别从各处理组的网箱中随机选择5尾黄鳝进行尾部静脉采血。采集的血样迅速转至无菌离心管中，室温下静置凝血后4 ℃下3000 r/min离心15 min，收集血清，-20 ℃保存，用于血清相关免疫指标测定。其中，血清补体C3含量根据补体C3检测试剂盒使用说明进行测定；血清SOD活性按照SOD测定试剂盒说明进行测定，SOD活性以在0.24 mL反应体系中SOD抑制率达50%时所对应的酶量为一个活力单位；血清ACP活性按照ACP测定试剂盒说明进行测定，ACP活性以100 mL血清在37 ℃下与基质作用30 min产生 1 mg酚为一个活力单位；血清凝集抗体效价采用间接ELISA进行测定。
1. 2. 7 攻毒试验 在加强免疫结束15 d后从各处理组的网箱中随机捞取20尾黄鳝，分别通过腹腔注射3种混合菌（0.2 mL），3种菌液的浓度均为1.0×109 CFU/mL。饲养观察1周，记录黄鳝死亡率，并换算三联微胶囊口服疫苗的免疫保护率。
免疫保护率（%）=■×100
1. 3 统计分析
利用Excel 2010进行单因素方差分析（One-way ANOVA），检验试验结果的差异显著性。
2 结果与分析
2. 1 三联微胶囊口服疫苗的形态及特性
按照本研究条件制得的三联微胶囊口服疫苗经冷冻干燥后，呈米黄色粉末，在显微镜下可观察到大部分呈椭圆形，颗粒均匀。大部分微粒中有黑色的不透光区，可能是菌体存在胶囊中所造成。经测定，三联微胶囊口服疫苗的颗粒直径20.4～66.4 μm，平均为44.5 μm；经吖啶橙荧光直接镜检计数测得总菌量为4.56×108 CFU/mL，即疫苗颗粒含菌量为4.56×109 CFU/mg；注射三联微胶囊口服疫苗后黄鳝行动正常，抢食积极，2周内无任何异常，即三联微胶囊口服疫苗安全性良好。
2. 2 黄鳝血清免疫指标的测定结果
2. 2. 1 血清补体C3含量 在对试验组黄鳝进行加强免疫结束15 d后，试验组1和试验组2的黄鳝血清补体C3含量分别为0.0802±0.0047和0.0998±0.1500 mg/mL，均显著高于对照组（P<0.05，下同），说明三联微胶囊口服疫苗能有效提高黄鳝血清补体C3含量（图1），且免疫剂量为0.6 g/kg的黄鳝免疫反应比免疫剂量为0.4 g/kg的更强烈。
2. 2. 2 血清SOD活性 从图2可以看出，试验组1和试验组2的黄鳝血清SOD活性均显著高于对照组，且试验组2的黄鳝血清SOD活性高于试验组1，但二者间差异不显著（P>0.05，下同）。
2. 2. 3 血清ACP活性 从图3可以看出，试验组1和试验组2的黄鳝血清ACP活性均显著高于对照组，且试验组2的黄鳝血清ACP活性显著高于试验组1。说明投喂三联微胶囊口服疫苗能有效提高黄鳝血清ACP活性，生产建议投喂剂量为0.6 g/kg。
2. 2. 4 血清凝集抗体效价 由表1可知，试验组1的黄鳝血清平均抗体效价为7.5949，试验组2的平均抗体效价为11.0651，而对照组在整个试验过程中未能检测到抗体。
2. 3 三联微胶囊口服疫苗对黄鳝的免疫保护效果
由表2可以看出，试验组1和试验组2的黄鳝均获得不同程度的免疫保护力，1周内试验组1黄鳝获得的平均免疫保护率为60%，试验组2获得的平均免疫保护率为65%，二者差异不显著。
3 讨论
3. 1 三联微胶囊口服疫苗对黄鳝的免疫保护效果
SOD是生物体内非常重要的一种抗氧化酶，能清除氧自由基，以保护功能大分子不因氧化而被破坏，是预防分子生物损伤和机体衰老的重要物质，其活性与生物体的免疫水平密切相关（林林等，1998；牟海津等，1999）。ACP是巨噬细胞溶酶体的标志酶，属于生物体内调控酶，在免疫反应中发挥重要作用（刘永贵，2009）。补体系统是鱼类抵抗微生物感染的重要成分，由存在于体液中的数十种具有酶活性的球蛋白组成。本研究制备的三联微胶囊口服疫苗能够显著提高黄鳝血清SOD、ACP活性及刺激血清补体C3产生，进而提高机体免疫力。免疫保护率和抗体水平是评价疫苗免疫效果的重要指标，抗体是由淋巴细胞产生的能与相应抗原特异性结合的球蛋白，免疫保护率则是直接反映机体获得的免疫防病能力。本研究结果表明，在加强免疫结束15 d后，试验组1和试验组2的黄鳝血清抗体效价分别为7.5949和11.0651，攻毒后试验组黄鳝获得的免疫保护率在60%以上。说明该三联微胶囊口服疫苗对黄鳝抵御常规细菌性疾病起到一定的促进作用，尤其对抵御由嗜水气单胞菌、温和气单胞菌及弗氏柠檬酸杆菌引起的出血病具有积极作用。
3. 2 口服疫苗投喂过程中要避免造成免疫耐受
本研究分别按0.4和0.6 g/kg的剂量投喂黄鳝，且进行加强免疫，结果显示，试验组1（0.4 g/kg）的各项免疫指标及免疫保护率均低于试验组2（0.6 g/kg），可能是由于试验组2的疫苗投喂量高于试验组1所导致，因此实际生产中为了提高免疫效果和节省养殖费用，可适当加大免疫剂量。但不是免疫剂量越高越好，只有在正确、科学的用药前提下，免疫药物才能正常发挥作用，否则產生免疫耐受（杨先乐等，1989）。口服疫苗是通过胃肠道黏膜进行抗原呈递，可经不同的免疫通路产生与常规注射类似的免疫反应（余丽芸等，2008）。Weiner等（2000）研究发现，一次性给予大剂量的口服抗原易使机体内抗原特异性的CD4+T细胞凋亡，从而引起免疫耐受。此外，免疫持久性也是鱼类免疫应答的一个重要特性，不仅与机体自身的遗传信息有关，还与免疫接种剂量、免疫原性质等有关。关于本研究制备三联微胶囊口服疫苗的免疫持久性尚需进一步探究。 3. 3 多联微胶囊口服疫苗的优越性
多联疫苗能够对一种以上的疾病起免疫保护作用（许宗丽等，2014）。L■nnstrom等（2001）用杀鲑气单胞菌和鳗弧菌的二联疫苗免疫白鲢，结果发现该二联疫苗对白鲢弧菌病和疖疮病具有很好的免疫效果；陈晓利（2010）研究表明，利用嗜水气单胞菌与温和气单胞菌制成的全菌体二联疫苗可有效提高黄鳝的各项免疫指标，且对嗜水气单胞菌和温和气单胞菌侵染具有一定的免疫保护作用。至今，我国已研发出较多的水产多联疫苗，但大多是注射用的多联灭活全菌疫苗。与之相比，口服疫苗可极大降低工人的劳动强度且操作方便（徐希明等，2007），但普通口服疫苗到达胃肠道后会因被胃酸破坏而降低免疫效果（Irie et al.，2005）。微胶囊口服疫苗是将疫苗包裹在微胶囊中，防止疫苗在到达肠道相关淋巴组织前被消化道破坏（陈舒泛和华元渝，2003），其优点主要是：微胶囊可保护菌体抗原，且颗粒化疫苗有利于提高机体对抗原的吸收（Romalde et al.，2004）；通过对微胶囊壁材的选取及工艺优化，能实现对抗原释放时间和释放率的调控，达到缓释效果。Joosten等（1997）研究发现，疫苗微囊化可有效提高鱼体对抗原的吸收；余俊红等（2001）制备了鳗弧菌口服微胶囊疫苗，对鲈鱼幼鱼的免疫保护率达56.1%。本研究制得的三联微胶囊口服疫苗对黄鳝的免疫保护率在60%以上，但相对草鱼出血病活疫苗的免疫保护率并不高，可能与三联疫苗中不同的抗原存在竞争有关，因此下一步将研究单一疫苗的免疫效果，以期研制出针对黄鳝出血病的高效多联口服疫苗，为黄鳝出血病的防治提供技术支持。
4 结论
本研究制备的三联微胶囊口服疫苗能显著提高黄鳝血清SOD、ACP活性及刺激血清补体C3产生，有效抵御由嗜水气单胞菌、温和气单胞菌和弗氏柠檬酸杆菌引起的出血病，生产使用时须进行加强免疫，并适当加大免疫剂量。
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（责任编辑 兰宗宝）
关键词： 黄鳝；出血病；三联微胶囊口服疫苗；补体C3；超氧化物歧化酶；酸性磷酸酶；抗体效价；免疫保护率
中图分类号： S966.4 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）06-1039-06
0 引言
【研究意义】黄鳝（Monopterus albus）不仅有丰富的营养价值，还具有重要的药用价值。近年来，由于养殖密度加大、集约化程度加快及疾病研究的滞后，黄鳝病害日趋严重。黄鳝出血病是导致其死亡的主要疾病之一，具有发病快、传染性强、死亡率高等特点，如处理不及时通常会造成大批量死亡（陈怀青和陆承平，1991），但至今尚无有效的治疗方法，仍以预防为主。长期使用化学药物和抗生素进行鱼病防治极易造成药物残留、水域污染及致使部分病原产生耐药性等不良情况（殷睿，2005），与之相比，疫苗既可以提高鱼类机体的抗病能力，又不会造成环境污染和药物残留（黄宁和李海峰，2003）。多联口服疫苗是将两种及以上的疫苗同次使用或混合使用进行免疫，可预防由不同病原引起的多种疾病，或不同种病原引起的同一种疾病（李亚南等，1995；许宗丽等，2014），极大降低工人的劳动强度且操作方便，因此在实际生产中具有极高的应用价值。【前人研究进展】目前，已有较多关于黄鳝出血病的研究报道。陈怀青和陆承平（1991）从江苏某养殖场患出血病黄鳝的体内分离出嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila），且首次证实嗜水气单胞菌是黄鳝出血性败血症的病原菌；马有智和舒妙安（2000）从患出血病黄鳝苗种中分离出产碱假单胞菌（Pseudomonas alcaligenes）；沈锦玉等（2001）从浙江湖州某养殖场患出血病黄鳝的肝脏、肾脏中分离到致病菌，并证实该致病菌为嗜水气单胞菌；徐海圣和舒妙安（2003）从患出血病黄鳝体内分离出温和气单胞菌（Aeromonas sobria），经过人工回感试验，确定为黄鳝出血病的致病菌。在黄鳝疫病疫苗方面，仅徐海圣和舒妙安（2003）研制出黄鳝温和气单胞菌灭活疫苗，陈晓利和舒妙安（2013）制备出嗜水气单胞菌与温和气单胞菌的二联疫苗。【本研究切入点】现有文献鲜见弗氏柠檬酸菌（Citrobacter freundii）能引起黄鳝出血病的报道，将黄鳝出血病的3种致病菌（温和气单胞菌、嗜水气单胞菌和弗氏柠檬酸杆菌）制成全菌灭活三联微胶囊口服疫苗的研究也尚未见报道。【拟解决的关键问题】将黄鳝出血病的3种病原菌制成三联微胶囊口服疫苗，并对健康黄鳝进行免疫，探究黄鳝对此疫苗的免疫应答，以期有效防御黄鳝出血病，促进黄鳝养殖业健康发展。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
2015年7月3日从河南购入健康黄鳝苗种，体重30～50 g，体长30～45 cm。黄鳝苗在余干县瑞洪镇黄鳝养殖基地人工网箱养殖30 d，选择9个等重量的网箱进行试验，网箱投放密度2.5 kg/m2。海藻酸钠、植物油、氯化钙、吐温-80均为国产分析纯，超氧化物歧化酶（SOD）活性、酸性磷酸酶（ACP）活性检测试剂盒购自南京建成生物技术研究所。主要仪器设备有振荡培养箱、生化培养箱、紫外可见光分光光度计、pH计、双目生物显微镜、电动恒速搅拌机、冷冻干燥机、冰箱等。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 菌株来源及培养条件 3株病原菌分别是从患出血病黄鳝体内分离获得的嗜水气单胞菌、弗氏柠檬酸杆菌（杨宗英等，2015）及从中国科学院水生生物研究所购买的温和气单胞菌。将3株菌株分别接种于LB液体培养基中，28 ℃摇床培养24 h，一部分菌液用生理盐水调节至1.0×109 CFU/mL备用；一部分加入0.2%福尔马林灭活24 h，再用灭菌生理盐水离心（1500 r/min，10 min）洗涤3次，最后加入少量生理盐水用于制备微胶囊口服疫苗。
1. 2. 2 微胶囊疫苗制备 采用乳化法（Rodrigues et al.，2006）将等体积的3种菌液（共10 mL）加入到80 mL海藻酸钠溶液中，充分混合后加入乳化剂吐温-80，漩涡振荡器充分振荡至完全乳化，加入氯化钙溶液，用搅拌器充分搅拌至钙化形成均匀微胶囊，收集制得的微胶囊在冷冻干燥机中干燥过夜，制成三联微胶囊口服疫苗成品，4 ℃保存备用。
1. 2. 3 微胶囊疫苗检测 用显微镜观察三联微胶囊口服疫苗的形态并进行粒径测量。在清晰的视野中，随机选取50个微胶囊颗粒测量其直徑，取平均值；取0.10 g三联微胶囊口服疫苗溶于10 mL灭菌生理盐水中，按0.2 mL/尾的剂量对10尾外观健康的黄鳝进行腹腔注射，连续观察记录2周内的死亡情况。同时，准确称取制备的三联微胶囊口服疫苗0.01 g溶于100 mL经滤膜过滤除去死菌体的无颗粒水中，充分溶解后取1 mL进行10倍梯度稀释，取合适稀释度的试管以吖啶橙荧光直接镜检计数（徐怀恕等，1999），测定三联微胶囊口服疫苗含菌量。 1. 2. 4 试验饵料制备 以黄鳝的体重为标准，将制备的三联微胶囊口服疫苗分别按照0（对照）、0.4和0.6 g/kg混匀拌入黄鳝饵料中进行投喂。
1. 2. 5 三联微胶囊口服疫苗投喂量及投喂方法 在正常的养殖条件下，将9个网箱分为3个组，分别为试验组1、试验组2和对照组，每组3个重复。从2015年8月4日开始将三联微胶囊口服疫苗混匀至黄鳝饵料中进行投喂，其中，试验组1的三联微胶囊口服疫苗剂量为0.4 g/kg，试验组2的剂量为0.6 g/kg。两试验组在投喂7 d后暂停7 d，8月18号再按照同样的剂量继续投喂7 d进行加强免疫；对照组投喂未混入三联微胶囊口服疫苗的黄鳝饵料。
1. 2. 6 采血及免疫指标测定 在黄鳝加强免疫结束15 d后（9月10日），分别从各处理组的网箱中随机选择5尾黄鳝进行尾部静脉采血。采集的血样迅速转至无菌离心管中，室温下静置凝血后4 ℃下3000 r/min离心15 min，收集血清，-20 ℃保存，用于血清相关免疫指标测定。其中，血清补体C3含量根据补体C3检测试剂盒使用说明进行测定；血清SOD活性按照SOD测定试剂盒说明进行测定，SOD活性以在0.24 mL反应体系中SOD抑制率达50%时所对应的酶量为一个活力单位；血清ACP活性按照ACP测定试剂盒说明进行测定，ACP活性以100 mL血清在37 ℃下与基质作用30 min产生 1 mg酚为一个活力单位；血清凝集抗体效价采用间接ELISA进行测定。
1. 2. 7 攻毒试验 在加强免疫结束15 d后从各处理组的网箱中随机捞取20尾黄鳝，分别通过腹腔注射3种混合菌（0.2 mL），3种菌液的浓度均为1.0×109 CFU/mL。饲养观察1周，记录黄鳝死亡率，并换算三联微胶囊口服疫苗的免疫保护率。
免疫保护率（%）=■×100
1. 3 统计分析
利用Excel 2010进行单因素方差分析（One-way ANOVA），检验试验结果的差异显著性。
2 结果与分析
2. 1 三联微胶囊口服疫苗的形态及特性
按照本研究条件制得的三联微胶囊口服疫苗经冷冻干燥后，呈米黄色粉末，在显微镜下可观察到大部分呈椭圆形，颗粒均匀。大部分微粒中有黑色的不透光区，可能是菌体存在胶囊中所造成。经测定，三联微胶囊口服疫苗的颗粒直径20.4～66.4 μm，平均为44.5 μm；经吖啶橙荧光直接镜检计数测得总菌量为4.56×108 CFU/mL，即疫苗颗粒含菌量为4.56×109 CFU/mg；注射三联微胶囊口服疫苗后黄鳝行动正常，抢食积极，2周内无任何异常，即三联微胶囊口服疫苗安全性良好。
2. 2 黄鳝血清免疫指标的测定结果
2. 2. 1 血清补体C3含量 在对试验组黄鳝进行加强免疫结束15 d后，试验组1和试验组2的黄鳝血清补体C3含量分别为0.0802±0.0047和0.0998±0.1500 mg/mL，均显著高于对照组（P<0.05，下同），说明三联微胶囊口服疫苗能有效提高黄鳝血清补体C3含量（图1），且免疫剂量为0.6 g/kg的黄鳝免疫反应比免疫剂量为0.4 g/kg的更强烈。
2. 2. 2 血清SOD活性 从图2可以看出，试验组1和试验组2的黄鳝血清SOD活性均显著高于对照组，且试验组2的黄鳝血清SOD活性高于试验组1，但二者间差异不显著（P>0.05，下同）。
2. 2. 3 血清ACP活性 从图3可以看出，试验组1和试验组2的黄鳝血清ACP活性均显著高于对照组，且试验组2的黄鳝血清ACP活性显著高于试验组1。说明投喂三联微胶囊口服疫苗能有效提高黄鳝血清ACP活性，生产建议投喂剂量为0.6 g/kg。
2. 2. 4 血清凝集抗体效价 由表1可知，试验组1的黄鳝血清平均抗体效价为7.5949，试验组2的平均抗体效价为11.0651，而对照组在整个试验过程中未能检测到抗体。
2. 3 三联微胶囊口服疫苗对黄鳝的免疫保护效果
由表2可以看出，试验组1和试验组2的黄鳝均获得不同程度的免疫保护力，1周内试验组1黄鳝获得的平均免疫保护率为60%，试验组2获得的平均免疫保护率为65%，二者差异不显著。
3 讨论
3. 1 三联微胶囊口服疫苗对黄鳝的免疫保护效果
SOD是生物体内非常重要的一种抗氧化酶，能清除氧自由基，以保护功能大分子不因氧化而被破坏，是预防分子生物损伤和机体衰老的重要物质，其活性与生物体的免疫水平密切相关（林林等，1998；牟海津等，1999）。ACP是巨噬细胞溶酶体的标志酶，属于生物体内调控酶，在免疫反应中发挥重要作用（刘永贵，2009）。补体系统是鱼类抵抗微生物感染的重要成分，由存在于体液中的数十种具有酶活性的球蛋白组成。本研究制备的三联微胶囊口服疫苗能够显著提高黄鳝血清SOD、ACP活性及刺激血清补体C3产生，进而提高机体免疫力。免疫保护率和抗体水平是评价疫苗免疫效果的重要指标，抗体是由淋巴细胞产生的能与相应抗原特异性结合的球蛋白，免疫保护率则是直接反映机体获得的免疫防病能力。本研究结果表明，在加强免疫结束15 d后，试验组1和试验组2的黄鳝血清抗体效价分别为7.5949和11.0651，攻毒后试验组黄鳝获得的免疫保护率在60%以上。说明该三联微胶囊口服疫苗对黄鳝抵御常规细菌性疾病起到一定的促进作用，尤其对抵御由嗜水气单胞菌、温和气单胞菌及弗氏柠檬酸杆菌引起的出血病具有积极作用。
3. 2 口服疫苗投喂过程中要避免造成免疫耐受
本研究分别按0.4和0.6 g/kg的剂量投喂黄鳝，且进行加强免疫，结果显示，试验组1（0.4 g/kg）的各项免疫指标及免疫保护率均低于试验组2（0.6 g/kg），可能是由于试验组2的疫苗投喂量高于试验组1所导致，因此实际生产中为了提高免疫效果和节省养殖费用，可适当加大免疫剂量。但不是免疫剂量越高越好，只有在正确、科学的用药前提下，免疫药物才能正常发挥作用，否则產生免疫耐受（杨先乐等，1989）。口服疫苗是通过胃肠道黏膜进行抗原呈递，可经不同的免疫通路产生与常规注射类似的免疫反应（余丽芸等，2008）。Weiner等（2000）研究发现，一次性给予大剂量的口服抗原易使机体内抗原特异性的CD4+T细胞凋亡，从而引起免疫耐受。此外，免疫持久性也是鱼类免疫应答的一个重要特性，不仅与机体自身的遗传信息有关，还与免疫接种剂量、免疫原性质等有关。关于本研究制备三联微胶囊口服疫苗的免疫持久性尚需进一步探究。 3. 3 多联微胶囊口服疫苗的优越性
多联疫苗能够对一种以上的疾病起免疫保护作用（许宗丽等，2014）。L■nnstrom等（2001）用杀鲑气单胞菌和鳗弧菌的二联疫苗免疫白鲢，结果发现该二联疫苗对白鲢弧菌病和疖疮病具有很好的免疫效果；陈晓利（2010）研究表明，利用嗜水气单胞菌与温和气单胞菌制成的全菌体二联疫苗可有效提高黄鳝的各项免疫指标，且对嗜水气单胞菌和温和气单胞菌侵染具有一定的免疫保护作用。至今，我国已研发出较多的水产多联疫苗，但大多是注射用的多联灭活全菌疫苗。与之相比，口服疫苗可极大降低工人的劳动强度且操作方便（徐希明等，2007），但普通口服疫苗到达胃肠道后会因被胃酸破坏而降低免疫效果（Irie et al.，2005）。微胶囊口服疫苗是将疫苗包裹在微胶囊中，防止疫苗在到达肠道相关淋巴组织前被消化道破坏（陈舒泛和华元渝，2003），其优点主要是：微胶囊可保护菌体抗原，且颗粒化疫苗有利于提高机体对抗原的吸收（Romalde et al.，2004）；通过对微胶囊壁材的选取及工艺优化，能实现对抗原释放时间和释放率的调控，达到缓释效果。Joosten等（1997）研究发现，疫苗微囊化可有效提高鱼体对抗原的吸收；余俊红等（2001）制备了鳗弧菌口服微胶囊疫苗，对鲈鱼幼鱼的免疫保护率达56.1%。本研究制得的三联微胶囊口服疫苗对黄鳝的免疫保护率在60%以上，但相对草鱼出血病活疫苗的免疫保护率并不高，可能与三联疫苗中不同的抗原存在竞争有关，因此下一步将研究单一疫苗的免疫效果，以期研制出针对黄鳝出血病的高效多联口服疫苗，为黄鳝出血病的防治提供技术支持。
4 结论
本研究制备的三联微胶囊口服疫苗能显著提高黄鳝血清SOD、ACP活性及刺激血清补体C3产生，有效抵御由嗜水气单胞菌、温和气单胞菌和弗氏柠檬酸杆菌引起的出血病，生产使用时须进行加强免疫，并适当加大免疫剂量。
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（责任编辑 兰宗宝）