【摘 要】
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[目的]山新杨(Poputlus davidiana ×P.bolleana)是林木基因工程育种基础和应用研究的良好材料;以山新杨蔗糖合酶基因(PdbSUS)为例研究聚合酶链式反应(polymerase chain reac
【机 构】
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南京林业大学,南方现代林业协同创新中心,林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室,江苏 南京 210037
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[目的]山新杨(Poputlus davidiana ×P.bolleana)是林木基因工程育种基础和应用研究的良好材料;以山新杨蔗糖合酶基因(PdbSUS)为例研究聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)过程介导的重组现象,在此基础上区分每一个PdbSUS基因的两种单倍型,为后续研究提供准确的序列信息,并为判断木本植物基因真实的单倍型遗传信息提供参考.[方法]分别采集番茄(Lycopersicon escuilentum)和山新杨新鲜嫩叶,以番茄基因组为内参,利用流式细胞仪测定山新杨基因组大小及其倍性水平.参考毛果杨(P.trichocarpa)蔗糖合酶序列设计引物,分别以山新杨基因组DNA和cDNA为模板进行同源克隆,将PCR扩增产物回收纯化,连接测序载体并转化大肠杆菌感受态细胞,挑取阳性克隆进行菌液PCR验证,将整合有外源片段的转化子进行一代测序.利用SnapGene及DNAMAN软件对测序结果进行分析比对.[结果]山新杨为二倍体植物,获得了 7个PdbSUS基因的全长序列,并分别在基因组和转录水平鉴定出每个基因的两种单倍型序列.同时,检测到PCR介导的重组现象并通过限制性酶切多态性(RFLP)进行了验证.在测序的209个克隆中,发现有18个含有嵌合产物,占比8.6％,不同基因产生嵌合产物的概率为0-33.3％.检测到的嵌合产物均来自同一个位点的不同等位基因之间发生重组,未发现不同蔗糖合酶基因之间发生重组的现象.[结论]PCR介导的重组是PCR反应过程中能够衍生重组分子的一种高频事件,该现象可能是由于引物延伸不完全或聚合酶模板转换导致.在利用PCR技术克隆木本植物或其他基因组杂合度较高物种的基因时,需识别产物中重组分子才能够准确区分单倍型的遗传信息.
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