【摘 要】
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目的 构建能够对胶质母细胞瘤小分子RNA(miR)-221和miR-222达到多层次、半定量、共调控效果的腺病毒载体系统. 方法 应用载体融合和短发夹RNA(shRNA)引导链3端突变的策略构建
【机 构】
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300060 天津市环湖医院神经外科,天津市神经外科研究所,天津市脑血管与神经变性重点实验室;300052 天津,天津医科大学总医院神经外科,天津市神经病学研究所神经肿瘤实验室;首都医科大学三博脑科医
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目的 构建能够对胶质母细胞瘤小分子RNA(miR)-221和miR-222达到多层次、半定量、共调控效果的腺病毒载体系统. 方法 应用载体融合和短发夹RNA(shRNA)引导链3端突变的策略构建出突变型(mut)-shmiR-221/222和经典型(class)-shmiR-221/222 2种共表达腺病毒载体并转导入LN229和U251细胞中,分别为class-shmiR-221/222转导组、mut-shmiR-221/222转导组,同时设空白对照组,采用实时荧光定量PCR检测3组细胞miR-221/222的表达,West blotting检测细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子(1Bp27kipl)蛋白的表达,流式细胞仪检测细胞周期G1期阻滞情况,倒置相差显微镜观察细胞形态的变化,Caspase-3/7萤光素酶法检测细胞凋亡,编写基于核苷酸循环基序(NCM)的软件,推断shRNA和靶miR的准确三维结构并计算相应的自由能状态. 结果 空白对照组、mut-shmiR-221/222转导组、class-shmiR-221/222转导组细胞miR-221/222的表达依次下调;p27kipl表达水平依次上调;G0/G1期比例依次上调,S期比例依次下调,G1期阻滞比例依次上调;细胞破坏和丧失原有形态的程度依次上调,细胞数量依次下调;细胞凋亡依次增加,差异均有统计学意义(P＜0.05);自由能计算结果显示,mut-shmiR-221/222转导组(-32.7、-32.7)的引导链与靶miR结合时发生作用的热力学稳定性较class-shmiR-221/222转导组(-42.1、-41.5)减低. 结论 成功构建shRNA共表达腺病毒载体,利用shRNA引导链3端突变的策略影响热力学稳定性可以对胶质母细胞瘤细胞miR-221/222多层次、半定量调控.
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