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摘要：在水温（18±0.5）℃、盐度27‰的环境下，研究了重金属Hg2+、Cu2+、Cd2+对渤海湾卤虫无节幼体的急性毒性效应。结果表明，Hg2+对渤海卤虫无节幼体24 h、48 h的LC50分别为201.01 mg/L和0.05 mg/L，安全浓度分别为2.01 mg/L和0.000 5 mg/L；Cu2+对渤海湾卤虫无节幼体24 h、48 h的LC50分别为197.17 mg/L和7.50 mg/L，安全浓度分别为1.97 mg/L和0.08 mg/L；Cd2+对渤海湾卤虫无节幼体24 h、48 h的LC50分别为331.30 mg/L和8.13 mg/L，安全浓度分别为3.31 mg/L和0.08 mg/L。毒性由强至弱依次为Hg2+>Cu2+>Cd2+，但Cu2+与Cd2+的毒性差异不明显。
关键词：渤海湾卤虫无节幼体；重金属；急性毒性
卤虫（Brine Shrimp）俗称丰年虫，是一种广盐性低等甲壳生物，由于其营养丰富，因而也是一种海产鱼虾理想的饵料生物，由其冬卵孵化而来的无节幼体是多种人工驯化养殖的海水鱼虾（如大菱鲆、牙鲆、半滑舌鳎、中国对虾等）幼体的活饵料生物。卤虫的生活习性和生理结构决定了容易受到毒物的攻击，所以常被用于环境物毒性的评价和生态毒理学研究，已被《海洋石油勘探开发污染物的生物毒性检验方法》（GB 18420.2—2001）列为标准的实验生物[1]。
在我国销售的各卤虫卵品系中，渤海湾卤虫卵是品质最好的种类之一，其孵化的无节幼体营养丰富、活力强且持久，广受海水鱼虾育苗者的欢迎。近几年渤海湾沿岸卤虫养殖发展迅速，但随着我国工业的快速发展和人们生活水平的提高，工业及生活污水的排放量也在逐渐增加，污染物的排放，尤其是污水中的重金属污染物对卤虫的养殖业造成了很大影响。Hg2+、Cu2+、Cd2+是渤海中常见的重金属污染物[2]，它们对渤海湾卤虫无节幼体的影响尚不得知，本实验意在研究这3种重金属对渤海湾卤虫无节幼体的急性毒性效应，以期为渤海湾卤虫的养殖及海洋污染物的生物毒性评价提供更多可行的观测指标。
1材料与方法
1.1材料
卤虫卵购自河北省唐山市丰南区，为河北盐田（渤海湾）卤虫，所用卤虫无节幼体为孵化出2～3 h的I期卤虫无节幼体；HgCl2为贵州省铜仁化工研究所生产，含量99.5%，CuSO4和CdCl2均为天津市科密欧化学试剂有限公司生产，含量≥99.0%，试验用水为人工配制海水，使用海水晶（天津市塘沽区海生海水晶厂出品）+双蒸水配制而来，盐度27‰，试验水温模仿鲆鲽类苗种人工培育的中后期水温，保持在（18±0.5）℃。
1.2方法
1.2.1卤虫无节幼体的孵化卤虫卵在实验前保存于冰箱冷冻室内，孵化前24 h取出，置于阴凉处；模仿实际生产时卤虫卵的孵化操作，并从有利于卤虫卵整齐破膜角度出发，卤虫卵孵化前使用淡水浸泡2 h，而后在500 mL烧杯中加入0.2 g卤虫卵和400 mL配制海水，烧杯放入恒温水浴锅内，保持孵化温度在（28±0.5）℃。孵化期间采用自然光照，其中孵化开始的前6 h内光照度在1 000～1 500 lx。搜集孵化2～3 h内的无节幼体进行急性毒性实验，试验期间不换水、不充气、不投喂。
1.2.2实验溶液的配制使用分析天平称取一定量的HgCl2、CuSO4、CdCl2，用双蒸水溶解、稀释至一定浓度作为药物母液，试验时用药物母液配制各实验组所需要的药物浓度。
1.2.3预实验用250 mL烧杯，加入200 mL配制海水，适量药物母液，混匀后，放入20只I期卤虫无节幼体，同一药物组试验的所有烧杯均放入同一恒温水浴锅中，保持实验水温在（18±05）℃，自然光照。实验期间不换水，不充气，不投饵。24 h和48 h后解剖镜下观察死亡情况，以10 s内卤虫无节幼体的附肢不动为判断其死亡的标准进行计数。根据查阅相关资料并进行多次测试实验，设置预实验浓度梯度为：Hg2+0.007、0022、0.037、148.00、222.00、444.00、3 922.00 mg/L， Cu2+ 0.025、0.038、0.064、635.00、76200、889.00、6 096.00 mg/L， Cd2+ 3.92、554、7.84、882.00、1 176.00、1 470.00 mg/L。每个预实验浓度做一组平行试验，同时设一个对照组，取平行实验数据平均值。通过预实验查明重金属离子不引起死亡的最大浓度（ILL）和最小100%致死浓度（LC100）。
1.2.4急性毒性实验经预实验，确定3种重金属离子的实验浓度范围，按照等比级数设定7个浓度组，每组设3个平行， 1个对照，每个烧杯内随机放入20只I期卤虫无节幼体，实验条件与预实验条件保持一致， 24 h和48 h后解剖镜下观察死亡情况并及时清除死亡个体。实验重复一次，最终数据取平均值。
计算平均死亡率，再换算成概率单位，计算出实验药液质量浓度对数，求出概率单位与实验药液质量浓度对数的回归方程，求出各自的半数致死浓度（LC50）；安全浓度为 LC50×AF，其中AF为应用系数，对于稳定且又易于在生物体内积累的污染物，其系数多选在0.01～0.05这个范围内。本实验中重金属离子属于难分解、积累性强的物质，AF值皆取0.01。
2结果与分析
2.2分析
本试验符合对照组死亡率<10%、在所有试验中死亡率出现≤37%和≥67%的各有1组、设立5个以上的浓度组等水生生物急性毒性试验的质量控制要求，本试验每个浓度组设置了3个平行、2个重复，重复试验的毒性之比符合美国实验与材料学（ASTM）提出的“用同种稀释水，同种毒物，同种试验方法得到的2次试验结果之比均小于2”的要求[3]。
2.2.1重金属Hg2+、Cu2+、Cd2+对渤海湾卤虫无节幼体的急性毒性效应本实验在水温（18±0.5）℃、盐度27‰的环境下，研究了重金属Hg2+、Cu2+、Cd2+对渤海湾卤虫无节幼体的急性毒性效应，得出3种重金属离子24、48 h的LC50值及安全浓度。结果表明，Hg2+对渤海卤虫无节幼体24 h、48 h的LC50分别为201.01 mg/L和0.05 mg/L，安全浓度分别为2.01 mg/L和0000 5 mg/L；Cu2+对渤海湾卤虫无节幼体24 h、48 h的LC50分别为197.17 mg/L和7.50 mg/L，安全浓度分别为1.97 mg/L和0.08 mg/L；Cd2+对渤海湾卤虫无节幼体24 h、48 h的LC50分别为331.30 mg/L和8.13 mg/L，安全浓度分别为3.31 mg/L和0.08 mg/L。 2.2.2重金属Hg2+、Cu2+、Cd2+对渤海湾卤虫无节幼体的毒性差异实验结果表明，3种重金属对渤海湾卤虫无节幼体的毒性由强至弱依次为Hg2+>Cu2+>Cd2+。其中Hg2+的毒性最大，远高于Cu2+和Cd2+的毒性，48 h时分别比Cu2和Cd2+高出150倍和163倍，这与众多文献中（卤虫及贝类、小型鱼类等其它生物的毒性实验）报道的趋势结果基本一致。
但本次实验中，Cu2+的毒性与Cd2+基本相似，48 h时Cu2比Cd2+高出1.08倍，这与众多文献中报道的趋势结果虽然相同，但差异不明显。张宜奎等[4]在研究重金属离子对文蛤的急性毒性效应时，发现Cu2+对文蛤的毒性大于Cd2+，暴露96 h高出110倍；李国基等[5]在研究重金属离子对栉孔扇贝稚贝成活的影响时，发现Cu2+对栉孔扇贝稚贝的毒性远大于Cd2+；在对其他水生动物急性毒性效应上，也存在相同的规律，毒性由强至弱依次为Hg2+>Cu2+>Cd2+。李娜等[6]进行了重金属污染物对卤虫无节幼体的毒性研究，报道认为48 h时Cu2对卤虫无节幼体的毒性比Cd2+高出7.12倍，区别是李娜等人实
验时所采用的卤虫卵属于新疆艾比湖品种，实验水温为（27±0.5）℃；本次实验所采用的卤虫卵属于渤海湾品种，实验水温为（18±0.5）℃，这其中是否与毒性差异有直接关联尚有待进一步研究。
2.2.3重金属Hg2+、Cu2+、Cd2+对渤海湾卤虫无节幼体急性毒性机理的初步探讨本次实验中，渤海湾卤虫无节幼体对3种重金属离子在暴露24 h时的反应极不敏感，但在暴露48 h时却表现出极为敏感。例如在暴露Hg2+溶液24 h时，浓度48.100 mg/L的实验组无节幼体才刚刚出现死亡（死亡率5%），但暴露48 h时，浓度0599 mg/L的实验组无节幼体已全部死亡（死亡率100%）；在暴露Cu2+溶液24 h时，浓度95959 mg/L的实验组无节幼体才刚刚出现死亡（死亡率5%），但暴露48 h时，浓度12.240 mg/L的实验组无节幼体已死亡90%；Cd2+实验组的变化趋势也相类似。
分析认为出现这种情况的原因可能与卤虫无节幼体的生理特点有关。孙建华等[7]的报道认为，初孵无节幼体由于40 h才开始摄食，在此期间完全依靠卵黄维持生命活动，对水环境的变化不敏感，对药物的耐受力相对较强；等40 h后幼体开始摄食，虽然摄食量较少，但与水环境开始接触，器官开始发育，对水环境的变化开始敏感。本次实验采用孵化后2～3 h的I期卤虫无节幼体，在实验24 h时无节幼体仍处于内源性营养阶段，因此对外界环境中的重金属敏感性较差，而实验48 h时已开始器官发育，对外界环境敏感性增强，因而出现了这种现象。
参考文献：
[1] 周名江，颜天，李钧，等.黑褐新糠虾的急性毒性测试方法及在钻井液毒性评价中的作用[J].海洋环境科学，2001，20（3）：1-4
[2] 齐凤霞，郑炳辉，万俊.渤海湾（天津段）柱样沉积物重金属污染研究[J].海洋技术，2003（9）：85-91
[3] Girling AE，Pascoe D，Janssen CR，et al. Development of methods for evaluating toxicity to freshwater ecosystems[J].Ecotocicology Environmental Safet，2000，45（2）：148-176
[4] 李国基，刘明星，张首临，等.Zn等金属离子对栉孔稚贝成活的毒性影响[J].海洋环境科学，1994，13（2）：13-16
[5] 张宜奎，宋秀凯，，刘爱英， 等. 重金属Cd2+、Cu2+对文蛤的急性毒性[J]. 海洋湖沼通报，2011（3）：51-55
[6] 李娜，石玉新，齐树亭，等. 渤海主要重金属污染物对卤虫无节幼体的毒性[J].河北渔业，2006，2：14-16
[7] 孙建华，杜少波，楼峻，等.氨氮对我国不同产地卤虫的急性毒性实验[J].青岛海洋大学学报，1997，27（4）：477-482
关键词：渤海湾卤虫无节幼体；重金属；急性毒性
卤虫（Brine Shrimp）俗称丰年虫，是一种广盐性低等甲壳生物，由于其营养丰富，因而也是一种海产鱼虾理想的饵料生物，由其冬卵孵化而来的无节幼体是多种人工驯化养殖的海水鱼虾（如大菱鲆、牙鲆、半滑舌鳎、中国对虾等）幼体的活饵料生物。卤虫的生活习性和生理结构决定了容易受到毒物的攻击，所以常被用于环境物毒性的评价和生态毒理学研究，已被《海洋石油勘探开发污染物的生物毒性检验方法》（GB 18420.2—2001）列为标准的实验生物[1]。
在我国销售的各卤虫卵品系中，渤海湾卤虫卵是品质最好的种类之一，其孵化的无节幼体营养丰富、活力强且持久，广受海水鱼虾育苗者的欢迎。近几年渤海湾沿岸卤虫养殖发展迅速，但随着我国工业的快速发展和人们生活水平的提高，工业及生活污水的排放量也在逐渐增加，污染物的排放，尤其是污水中的重金属污染物对卤虫的养殖业造成了很大影响。Hg2+、Cu2+、Cd2+是渤海中常见的重金属污染物[2]，它们对渤海湾卤虫无节幼体的影响尚不得知，本实验意在研究这3种重金属对渤海湾卤虫无节幼体的急性毒性效应，以期为渤海湾卤虫的养殖及海洋污染物的生物毒性评价提供更多可行的观测指标。
1材料与方法
1.1材料
卤虫卵购自河北省唐山市丰南区，为河北盐田（渤海湾）卤虫，所用卤虫无节幼体为孵化出2～3 h的I期卤虫无节幼体；HgCl2为贵州省铜仁化工研究所生产，含量99.5%，CuSO4和CdCl2均为天津市科密欧化学试剂有限公司生产，含量≥99.0%，试验用水为人工配制海水，使用海水晶（天津市塘沽区海生海水晶厂出品）+双蒸水配制而来，盐度27‰，试验水温模仿鲆鲽类苗种人工培育的中后期水温，保持在（18±0.5）℃。
1.2方法
1.2.1卤虫无节幼体的孵化卤虫卵在实验前保存于冰箱冷冻室内，孵化前24 h取出，置于阴凉处；模仿实际生产时卤虫卵的孵化操作，并从有利于卤虫卵整齐破膜角度出发，卤虫卵孵化前使用淡水浸泡2 h，而后在500 mL烧杯中加入0.2 g卤虫卵和400 mL配制海水，烧杯放入恒温水浴锅内，保持孵化温度在（28±0.5）℃。孵化期间采用自然光照，其中孵化开始的前6 h内光照度在1 000～1 500 lx。搜集孵化2～3 h内的无节幼体进行急性毒性实验，试验期间不换水、不充气、不投喂。
1.2.2实验溶液的配制使用分析天平称取一定量的HgCl2、CuSO4、CdCl2，用双蒸水溶解、稀释至一定浓度作为药物母液，试验时用药物母液配制各实验组所需要的药物浓度。
1.2.3预实验用250 mL烧杯，加入200 mL配制海水，适量药物母液，混匀后，放入20只I期卤虫无节幼体，同一药物组试验的所有烧杯均放入同一恒温水浴锅中，保持实验水温在（18±05）℃，自然光照。实验期间不换水，不充气，不投饵。24 h和48 h后解剖镜下观察死亡情况，以10 s内卤虫无节幼体的附肢不动为判断其死亡的标准进行计数。根据查阅相关资料并进行多次测试实验，设置预实验浓度梯度为：Hg2+0.007、0022、0.037、148.00、222.00、444.00、3 922.00 mg/L， Cu2+ 0.025、0.038、0.064、635.00、76200、889.00、6 096.00 mg/L， Cd2+ 3.92、554、7.84、882.00、1 176.00、1 470.00 mg/L。每个预实验浓度做一组平行试验，同时设一个对照组，取平行实验数据平均值。通过预实验查明重金属离子不引起死亡的最大浓度（ILL）和最小100%致死浓度（LC100）。
1.2.4急性毒性实验经预实验，确定3种重金属离子的实验浓度范围，按照等比级数设定7个浓度组，每组设3个平行， 1个对照，每个烧杯内随机放入20只I期卤虫无节幼体，实验条件与预实验条件保持一致， 24 h和48 h后解剖镜下观察死亡情况并及时清除死亡个体。实验重复一次，最终数据取平均值。
计算平均死亡率，再换算成概率单位，计算出实验药液质量浓度对数，求出概率单位与实验药液质量浓度对数的回归方程，求出各自的半数致死浓度（LC50）；安全浓度为 LC50×AF，其中AF为应用系数，对于稳定且又易于在生物体内积累的污染物，其系数多选在0.01～0.05这个范围内。本实验中重金属离子属于难分解、积累性强的物质，AF值皆取0.01。
2结果与分析
2.2分析
本试验符合对照组死亡率<10%、在所有试验中死亡率出现≤37%和≥67%的各有1组、设立5个以上的浓度组等水生生物急性毒性试验的质量控制要求，本试验每个浓度组设置了3个平行、2个重复，重复试验的毒性之比符合美国实验与材料学（ASTM）提出的“用同种稀释水，同种毒物，同种试验方法得到的2次试验结果之比均小于2”的要求[3]。
2.2.1重金属Hg2+、Cu2+、Cd2+对渤海湾卤虫无节幼体的急性毒性效应本实验在水温（18±0.5）℃、盐度27‰的环境下，研究了重金属Hg2+、Cu2+、Cd2+对渤海湾卤虫无节幼体的急性毒性效应，得出3种重金属离子24、48 h的LC50值及安全浓度。结果表明，Hg2+对渤海卤虫无节幼体24 h、48 h的LC50分别为201.01 mg/L和0.05 mg/L，安全浓度分别为2.01 mg/L和0000 5 mg/L；Cu2+对渤海湾卤虫无节幼体24 h、48 h的LC50分别为197.17 mg/L和7.50 mg/L，安全浓度分别为1.97 mg/L和0.08 mg/L；Cd2+对渤海湾卤虫无节幼体24 h、48 h的LC50分别为331.30 mg/L和8.13 mg/L，安全浓度分别为3.31 mg/L和0.08 mg/L。 2.2.2重金属Hg2+、Cu2+、Cd2+对渤海湾卤虫无节幼体的毒性差异实验结果表明，3种重金属对渤海湾卤虫无节幼体的毒性由强至弱依次为Hg2+>Cu2+>Cd2+。其中Hg2+的毒性最大，远高于Cu2+和Cd2+的毒性，48 h时分别比Cu2和Cd2+高出150倍和163倍，这与众多文献中（卤虫及贝类、小型鱼类等其它生物的毒性实验）报道的趋势结果基本一致。
但本次实验中，Cu2+的毒性与Cd2+基本相似，48 h时Cu2比Cd2+高出1.08倍，这与众多文献中报道的趋势结果虽然相同，但差异不明显。张宜奎等[4]在研究重金属离子对文蛤的急性毒性效应时，发现Cu2+对文蛤的毒性大于Cd2+，暴露96 h高出110倍；李国基等[5]在研究重金属离子对栉孔扇贝稚贝成活的影响时，发现Cu2+对栉孔扇贝稚贝的毒性远大于Cd2+；在对其他水生动物急性毒性效应上，也存在相同的规律，毒性由强至弱依次为Hg2+>Cu2+>Cd2+。李娜等[6]进行了重金属污染物对卤虫无节幼体的毒性研究，报道认为48 h时Cu2对卤虫无节幼体的毒性比Cd2+高出7.12倍，区别是李娜等人实
验时所采用的卤虫卵属于新疆艾比湖品种，实验水温为（27±0.5）℃；本次实验所采用的卤虫卵属于渤海湾品种，实验水温为（18±0.5）℃，这其中是否与毒性差异有直接关联尚有待进一步研究。
2.2.3重金属Hg2+、Cu2+、Cd2+对渤海湾卤虫无节幼体急性毒性机理的初步探讨本次实验中，渤海湾卤虫无节幼体对3种重金属离子在暴露24 h时的反应极不敏感，但在暴露48 h时却表现出极为敏感。例如在暴露Hg2+溶液24 h时，浓度48.100 mg/L的实验组无节幼体才刚刚出现死亡（死亡率5%），但暴露48 h时，浓度0599 mg/L的实验组无节幼体已全部死亡（死亡率100%）；在暴露Cu2+溶液24 h时，浓度95959 mg/L的实验组无节幼体才刚刚出现死亡（死亡率5%），但暴露48 h时，浓度12.240 mg/L的实验组无节幼体已死亡90%；Cd2+实验组的变化趋势也相类似。
分析认为出现这种情况的原因可能与卤虫无节幼体的生理特点有关。孙建华等[7]的报道认为，初孵无节幼体由于40 h才开始摄食，在此期间完全依靠卵黄维持生命活动，对水环境的变化不敏感，对药物的耐受力相对较强；等40 h后幼体开始摄食，虽然摄食量较少，但与水环境开始接触，器官开始发育，对水环境的变化开始敏感。本次实验采用孵化后2～3 h的I期卤虫无节幼体，在实验24 h时无节幼体仍处于内源性营养阶段，因此对外界环境中的重金属敏感性较差，而实验48 h时已开始器官发育，对外界环境敏感性增强，因而出现了这种现象。
参考文献：
[1] 周名江，颜天，李钧，等.黑褐新糠虾的急性毒性测试方法及在钻井液毒性评价中的作用[J].海洋环境科学，2001，20（3）：1-4
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[3] Girling AE，Pascoe D，Janssen CR，et al. Development of methods for evaluating toxicity to freshwater ecosystems[J].Ecotocicology Environmental Safet，2000，45（2）：148-176
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[6] 李娜，石玉新，齐树亭，等. 渤海主要重金属污染物对卤虫无节幼体的毒性[J].河北渔业，2006，2：14-16
[7] 孙建华，杜少波，楼峻，等.氨氮对我国不同产地卤虫的急性毒性实验[J].青岛海洋大学学报，1997，27（4）：477-482