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[目的]研究粒细胞集落刺激因子(granule cell stimulating factor,GCSF)在羊成纤维细胞体外培养中对其增殖、周期和凋亡的影响,为今后基于羊GCSF为靶标诱导全能干细胞进行分子遗传育种研究提供理论依据.[方法]将羊GCSF真核表达质粒pRTL1-GCSF和对照载体质粒pRTL1分别转染到1×105个细胞/mL的羊成纤维细胞中,培养48 h后,利用Trizol法分别提取总RNA并反转录为cDNA,通过实时荧光定量PCR检测羊GCSF在羊成纤维细胞中的瞬时表达水平.通过GCSF依赖型细胞系NFS-60,利用细胞活力检测试剂alamarBlue测定转染48 h后羊成纤维细胞培养上清中分泌表达的GCSF的生物学活性.通过HEK 293F悬浮培养细胞系真核表达分泌型羊GCSF蛋白后,用Ni-NTA凝胶对细胞表达至细胞培养基中的GCSF蛋白进行纯化,并SDS-PAGE检测.加入纯化的30 ng·mL-1 GCSF蛋白后在24和48 h时,通过alamarBlue测定羊成纤维细胞的增殖状态,利用流式细胞术检测羊成纤维细胞的细胞周期和凋亡变化.[结果]羊GCSF真核表达质粒转染羊成纤维细胞48 h,检测发现在羊成纤维细胞中GCSF表达量得到显著提高.在羊成纤维细胞中,转染了pRTL1-GCSF质粒的羊GCSF表达量是转染了pRTL1空载对照组的(50615.92±4738.83)倍(P<0.01);羊成纤维细胞瞬时分泌表达的含有GCSF蛋白的培养基上清加入到GCSF依赖型细胞系NFS-60后,试验组和阳性对照组中的NFS-60的荧光强度与阴性对照组和空白对照组相比显著升高(P0.05),结果显示羊GCSF能显著刺激NFS-60细胞的增殖,表明在羊成纤维细胞中表达的羊GCSF具有生物学活性.用HEK 293F悬浮培养细胞系真核表达分泌型羊GCSF蛋白后,纯化得到羊GCSF蛋白.在羊成纤维细胞中添加30 ng·mL-1的羊GCSF后,体外培养24和48 h,GCSF试验组与培养基稀释液对照组相比,细胞活力变化差异不显著,而细胞周期的分布出现显著改变.24 h时,与对照组相比试验组的G1期细胞比例由(55.29±1.68)％增加到(69.37±0.24)％,差异极显著(P0.05);G2/M期细胞显著增多(P<0.05),比例由(22.88±1.00)％增大到(26.76±0.82)％.表明在羊成纤维细胞中加入羊GCSF的24 h后,处于分裂状态和间期的细胞显著增多.48 h时,与对照组相比试验组G1期细胞比例由(65.96±0.37)％减少为(45.69±0.26)％,差异极显著(P<0.01);S期细胞比例由(13.45±1.33)％增加为(37.87±2.43)％,差异极显著(P0.05).表明加入GCSF的羊成纤维细胞在48 h时,处于间期的细胞显著减少,同时DNA复制状态的细胞显著增多.试验组凋亡率和对照组相比,培养24 h时对照组(Ctr)和试验组(GCSF)的凋亡率分别是(7.51±0.38)％和(9.16±0.46)％.48 h时对照组和试验组的凋亡率分别是(5.73±0.29)％和(5.39±0.27)％.72 h时对照组(Ctr)和试验组(GCSF)的凋亡率分别是(8.88±0.45)％和(5.41±0.27)％,24 h和72 h凋亡率差异极显著(P0.05),表明在GCSF添加的24 h内促进了细胞凋亡,随着时间的延长,细胞的凋亡受到抑制.[结论]羊成纤维细胞中可以瞬时过量表达羊GCSF,并具有生物学活性.GCSF不影响羊成纤维细胞的增殖,但可调控其周期,影响细胞凋亡.该结果为今后通过羊成纤维细胞介导GCSF培育具有高免疫力、高抗病性的羊进行分子遗传育种奠定了基础.