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摘要 水提醇沉法提取阴地蕨多糖，以多糖得率为指标，考察提取温度、提取时间、料液比及提取次数对多糖得率的影响，通过正交试验优化提取工艺参数；采用MTT法检测阴地蕨多糖对癌细胞CT-26、K562、WEHI-3细胞作用48 h后的增殖抑制作用。试验结果表明，提取时间和温度是阴地蕨多糖提取率最主要的影响因素，优化的最佳提取条件为：温度100 ℃，料液比为1∶40（mg/mL），提取时间4 h和提取次数3次。阴地蕨多糖对3种肿瘤均有生长抑制作用，且呈现一定的浓度依赖性，抑制作用强弱为WEHI-3>K562>CT-26，半数抑制浓度IC50分别为0.85、2.13、2.52 mg/mL。
关键词 阴地蕨多糖；水提醇沉法；正交试验；MTT法；抗肿瘤活性
中图分类号 S567.239 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2016）15-0261-02
Abstract The Botrychium ternatum（Thunb） Sw. polysaccharides was extracted by water extraction-alcohol precipitation method. The extraction process was optimized by investigating polysaccharide yield as the response value of extraction time，extraction temperature，solid to solvent ratio and extraction time. Based on the results of single-factor experiments，orthogonal array experiments were carried out to determine the optimum process parameters. MTT assay was adopted to detect the inhabitation of polysaccharides with three different kinds of malignant tumor cell lines in vitro and IC50 values were calculated，respectively.The results showed that the best conditions for water extraction-alcohol precipitation were determined as follows：extraction temperature was 100 ℃；the time was 4 h；solid to liquid ratio was 1∶40（g/mL）；and the extractiontime was 3 times. The polysaccharides had antitumor effects on WEHI-3>K562>CT-26，they inhibited cell proliferation in a dose dependent manner，and the IC50 of polysaccharides on the three different kinds cell lines was 0.85，2.13，2.52 mg /mL，respectively.
Key words Botrychium ternatum（Thunb）Sw.polysaccharide；water extraction-alcohol precipitation；orthogonal array experiments；MTT assay；antitumor activity
陰地蕨[Botrychium ternatum（Thunb）Sw.]属于阴地蕨科阴地蕨属植物，阴地蕨属植物全世界有40余种，主要分布于温带的高山地区和低地森林地区，我国现有17种，分布于全国各地。该属植物具有清热解毒、利水通淋、消肿等广泛的药理活性[1]，具有很高的药用价值，民间多用阴地蕨属植物治疗肺热咳嗽、毒蛇咬伤、出血等疾病症状而受到了人们的关注[2]。其中阴地蕨，别名一朵云、小春花、四块瓦等[3]，其味淡、苦，性冷，有止咳、清肺热之功效[4]；王少明等[5]从阴地蕨中提取的木犀草素、阴地蕨素等提取物具有抗肿瘤转移作用，具体表现为抑制自发性肿瘤转移和实验性肿瘤转移；陈晓清等[6]从阴地蕨分离得到的粗多糖提取物具有抑制鱼病病原菌包括烂尾病病原菌、赤皮病病原菌和肠炎病病原菌的生物活性，所以研究多糖的提取工艺及其抗癌活性具有重要意义[6]。本研究在单因素试验基础上采用正交试验法从阴地蕨根中提取多糖，以确定出最佳提取条件。采用MTT法检测阴地蕨多糖作用48 h后对小鼠结肠癌细胞CT-26，人白血病K562细胞和小鼠白血病细胞WEHI-3的细胞毒活性，计算对3种癌细胞的增殖抑制率和半数抑制浓度IC50，为进一步对阴地蕨多糖进行研究提供基础数据参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料与仪器
1.1.1 试材。阴地蕨药材购自贵州贵阳药材市场，经贵州师范学院朱福寿教授鉴定为阴地蕨科阴地蕨属植物阴地蕨；95%乙醇溶液、苯酚、浓硫酸、葡萄糖、磷酸氢钾等试剂均为国产分析纯。
1.1.2 试验仪器。仪器包括恒温水浴锅（上海梅香仪器有限公司）、真空抽滤机（郑州长城科工贸有限公司）、电子天平（上海精密科技仪器有限公司）、冻干机（河南兄弟仪器设备有限公司）、分光光度计（上海精密科技仪器有限公司）、离心机（江苏正基仪器有限公司）、干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司）、酶标仪（美国Bio Rad3550）、CO2培养箱（美国Thermo公司）。 1.2 试验方法
1.2.1 水提醇沉提取工艺。参照杨 林等的方法[7]：阴地蕨根干粉→蒸馏水浸提→3 500 r/min离心10 min→上清→减压浓缩至原体积10%→4倍体积乙醇醇沉→3 500 r/min离心10 min→沉淀物→洗涤→阴地蕨粗多糖→脱色脱蛋白→纯化多糖。
1.2.2 多糖得率测定与计算。多糖含量以苯酚-硫酸法测定[8]。以干燥至恒质量的葡萄糖配制标准液，于490 nm波长处测得的吸光度，绘制标准曲线，得葡萄糖标准曲线方程，计算多糖得率：
提取率（%）=■×100
1.2.3 单因素试验和正交试验设计。参照陈 亮等[9]的方法设置单因素试验：考察提取温度、提取时间、料液比和提取次数对多糖提取率的影响。并对多糖提取率进行计算，每组试验重复3次。
在单因素试验的基础上，以阴地蕨多糖提取率为响应值，提取温度（A）、提取时间（B）、料液比（C）和提取次数（D）为试验因素，在4因素3水平上对阴地蕨多糖提取工艺进行优化研究（表1）。
1.2.4 多糖纯化。将阴地蕨粗多糖以活性炭脫色、saveage法脱蛋白、冷冻干燥[10-11]，即得到纯化后的热水浸提的多糖。此纯化的多糖用于后续抗癌活性评价试验。
1.2.5 抗肿瘤细胞活性。参照任 靖等的方法[12]选取对数生长期肿瘤细胞，用相应的培养基制成细胞悬浮液，用细胞计数仪计数，按各细胞的最佳铺板浓度接种90 μL于96孔细胞培养板，5% CO2，37 ℃培养。24 h后加入样品10 μL，继续培养48 h，在细胞培养结束前的4 h，每孔中加入10 μL的MTT溶液继续培养到试验结束。倒置显微镜下观察细胞形态，将上清液轻轻倒掉后，每孔中加入二甲基亚砜150 μL，在酶标仪570 nm处测量每孔的吸光值。按下式计算抑制率：
抑制率（IR，%）=（对照D570值-待测样品D570值）/（对照D570值-空白孔D570值）×100
2 结果与分析
2.1 葡萄糖标准曲线
对葡萄糖标准溶液与对应的吸光度，绘制葡萄糖标准曲线，拟合线性方程为Y=0.012X 0.006，R2=0.996，可根据方程计算多糖得率。
2.2 单因素试验
2.2.1 料液比对粗多糖提取率的影响。从图1可看出，起初随着料液比的增加，多糖的提取率随之增加，料液比到达1∶60时多糖提取率达到最高，随后随着料液比的增加，多糖提取率稍呈下降趋势。
2.2.2 温度对多糖提取率的影响。从图2可以看出，随着温度的升高，阴地蕨多糖的提取率相应增加。当温度达到90 ℃时多糖的提取率达到最高，温度再升高到100 ℃时提取率则稍有降低。
2.2.3 时间对多糖提取率的影响。从图3可以看出，随着时间延长，阴地蕨多糖的得率增加，4 h后多糖的提取率随时间延长继续增加，但是增加量不明显。
2.2.4 提取次数对多糖提取率的影响。从图4可以看出，随着提取次数的增多，多糖得率逐渐增加。但是从第3次开始，随着提取次数增多，阴地蕨多糖的提取率虽有继续增加趋势，但是增加量不明显。
2.3 正交试验优化阴地蕨多糖提取工艺
分析表2正交试验结果可知，提取时间对试验结果具有显著性影响，其次是提取次数和温度，用水量对试验结果影响较小。影响总多糖得率的因素主次顺序为B>D>A>C。通过分析4个因素的影响，最优提取工艺组合为A3B3C1D2，即浸提温度为100 ℃，料液比1∶40，浸提时间4 h，浸提次数3次。在此条件下重复进行验证试验3 次，多糖得率分别为5.67%、5.64%、5.58%，多糖的平均提取率为5.63%。说明此提取条件稳定可靠，多糖得率高。
2.4 阴地蕨多糖的抗肿瘤活性
采用MTT法对阴地蕨多糖的抗肿瘤活性进行了初步筛选，结果见表3。可以看出，阴地蕨多糖对3种肿瘤细胞都有细胞毒活性，但是对小鼠结肠癌细胞CT-26和人白血病K562细胞的毒活性较弱，1 mg/mL时抑制率分别只达到27.06%和27.31%，IC50值分别为2.52、2.13 mg/mL；对小鼠白血病细胞WEHI-3抑制率在多糖浓度为1 mg/mL时达到55.36%，IC50值为0.85 mg/mL。
3 结论与讨论
通过正交设计得出阴地蕨多糖的最佳工艺条件为提取温度100 ℃，提取时间4 h，提取次数3次，料液比1∶40，在此条件下多糖得率5.63%，该优化结果对阴地蕨多糖开发利用和生产有重要的参考价值。
通过MTT试验和形态学观察，以3种肿瘤细胞，即人白血病K562细胞、小鼠白血病细胞WEHI-3和小鼠结肠癌细胞CT-26为试验材料对阴地蕨多糖活性进行了初步筛选，检测阴地蕨多糖的细胞毒性及其作用的细胞特异性。由试验结果可知，该多糖对不同种类癌细胞的细胞毒性存在差异。从MTT试验结果的半数抑制浓度IC50可以看出：阴地蕨多糖对3种癌细胞均有不同程度的细胞毒作用，细胞增殖的抑制作用随多糖浓度的加大而增强，呈剂量依赖性，相比之下，多糖对小鼠白血病细胞WEHI-3抑制作用最强，半数抑制浓度IC50为0.85 mg/mL，远大于对其他2种癌细胞的作用。该研究结果为阴地蕨多糖的抗癌作用研究提供了一定的参考。有关阴地蕨多糖的抗癌作用还需进一步深入研究。
4 参考文献
[1] 齐建红.阴地蕨属植物研究进展[J].西安文理学院学报（自然科学版），2012（2）：48-50.
[2] 张杭，张敬杰，刘亚华.贵州苗医常用的蕨类植物[J].中国民族药学杂志，2012，7（7）：27-28.
[3] 赵俊华，赵能武，王培善，等.土家药黔产铁线蕨、阴地蕨科药用植物的种类和分布研究[J].中国民族医药杂志，2008（5）：44-46.
[4] 刘芹，黎远军，鲁宗成.阴地蕨生物学功能的研究进展[J].中国医学导报，2014，11（23）：151-153.
[5] 王少明，阮君山，庄捷，等.阴地蕨提取物在制备抗肿瘤转移药物中的应用：中国，201010203636[P].2010-10-6.
[6] 陈晓清，陈郑斌.半边旗和阴地蕨粗多糖抗鱼病病原菌活性初步研究[J].亚热带植物科学，2009（2）：48-50.
[7] 杨林，刘翠花，刘刚，等.西藏野生尊麻水溶性多糖提取工艺的优化设计[J].食品工业科技，2013，34（2）：35-37.
[8] 王文平，郭祀远，李琳，等.苯酚-硫酸法测定野木瓜中多糖含量的研究[J].食品科学，2007，28（4）：276-279.
[9] 陈亮，张炜，陈元涛，等.响应曲面法优化黑果枸杞超声提取工艺[J].食品科技，2015，40（1）：220-227.
[10] CHEN Y，XIE M Y，LI W J，et al.An effective method for deproteinization of bioactive polysaccharides extracted from lingzhi（Ganoderma atrum）[J].Food Science and Biotechnology，2012，21（1）：191-198.
[11] 郭思维，刘胜姿，李威，等.人工冬虫夏草多糖脱色脱蛋白工艺研究[J].食品科技，2013，38（5）：207-211.
[12] 任靖，冯国楠，王敏伟，等.白英乙醇提取物抗肿瘤作用初步研究[J].中国中药杂志，2006，3 1（6）：497.
关键词 阴地蕨多糖；水提醇沉法；正交试验；MTT法；抗肿瘤活性
中图分类号 S567.239 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2016）15-0261-02
Abstract The Botrychium ternatum（Thunb） Sw. polysaccharides was extracted by water extraction-alcohol precipitation method. The extraction process was optimized by investigating polysaccharide yield as the response value of extraction time，extraction temperature，solid to solvent ratio and extraction time. Based on the results of single-factor experiments，orthogonal array experiments were carried out to determine the optimum process parameters. MTT assay was adopted to detect the inhabitation of polysaccharides with three different kinds of malignant tumor cell lines in vitro and IC50 values were calculated，respectively.The results showed that the best conditions for water extraction-alcohol precipitation were determined as follows：extraction temperature was 100 ℃；the time was 4 h；solid to liquid ratio was 1∶40（g/mL）；and the extractiontime was 3 times. The polysaccharides had antitumor effects on WEHI-3>K562>CT-26，they inhibited cell proliferation in a dose dependent manner，and the IC50 of polysaccharides on the three different kinds cell lines was 0.85，2.13，2.52 mg /mL，respectively.
Key words Botrychium ternatum（Thunb）Sw.polysaccharide；water extraction-alcohol precipitation；orthogonal array experiments；MTT assay；antitumor activity
陰地蕨[Botrychium ternatum（Thunb）Sw.]属于阴地蕨科阴地蕨属植物，阴地蕨属植物全世界有40余种，主要分布于温带的高山地区和低地森林地区，我国现有17种，分布于全国各地。该属植物具有清热解毒、利水通淋、消肿等广泛的药理活性[1]，具有很高的药用价值，民间多用阴地蕨属植物治疗肺热咳嗽、毒蛇咬伤、出血等疾病症状而受到了人们的关注[2]。其中阴地蕨，别名一朵云、小春花、四块瓦等[3]，其味淡、苦，性冷，有止咳、清肺热之功效[4]；王少明等[5]从阴地蕨中提取的木犀草素、阴地蕨素等提取物具有抗肿瘤转移作用，具体表现为抑制自发性肿瘤转移和实验性肿瘤转移；陈晓清等[6]从阴地蕨分离得到的粗多糖提取物具有抑制鱼病病原菌包括烂尾病病原菌、赤皮病病原菌和肠炎病病原菌的生物活性，所以研究多糖的提取工艺及其抗癌活性具有重要意义[6]。本研究在单因素试验基础上采用正交试验法从阴地蕨根中提取多糖，以确定出最佳提取条件。采用MTT法检测阴地蕨多糖作用48 h后对小鼠结肠癌细胞CT-26，人白血病K562细胞和小鼠白血病细胞WEHI-3的细胞毒活性，计算对3种癌细胞的增殖抑制率和半数抑制浓度IC50，为进一步对阴地蕨多糖进行研究提供基础数据参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料与仪器
1.1.1 试材。阴地蕨药材购自贵州贵阳药材市场，经贵州师范学院朱福寿教授鉴定为阴地蕨科阴地蕨属植物阴地蕨；95%乙醇溶液、苯酚、浓硫酸、葡萄糖、磷酸氢钾等试剂均为国产分析纯。
1.1.2 试验仪器。仪器包括恒温水浴锅（上海梅香仪器有限公司）、真空抽滤机（郑州长城科工贸有限公司）、电子天平（上海精密科技仪器有限公司）、冻干机（河南兄弟仪器设备有限公司）、分光光度计（上海精密科技仪器有限公司）、离心机（江苏正基仪器有限公司）、干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司）、酶标仪（美国Bio Rad3550）、CO2培养箱（美国Thermo公司）。 1.2 试验方法
1.2.1 水提醇沉提取工艺。参照杨 林等的方法[7]：阴地蕨根干粉→蒸馏水浸提→3 500 r/min离心10 min→上清→减压浓缩至原体积10%→4倍体积乙醇醇沉→3 500 r/min离心10 min→沉淀物→洗涤→阴地蕨粗多糖→脱色脱蛋白→纯化多糖。
1.2.2 多糖得率测定与计算。多糖含量以苯酚-硫酸法测定[8]。以干燥至恒质量的葡萄糖配制标准液，于490 nm波长处测得的吸光度，绘制标准曲线，得葡萄糖标准曲线方程，计算多糖得率：
提取率（%）=■×100
1.2.3 单因素试验和正交试验设计。参照陈 亮等[9]的方法设置单因素试验：考察提取温度、提取时间、料液比和提取次数对多糖提取率的影响。并对多糖提取率进行计算，每组试验重复3次。
在单因素试验的基础上，以阴地蕨多糖提取率为响应值，提取温度（A）、提取时间（B）、料液比（C）和提取次数（D）为试验因素，在4因素3水平上对阴地蕨多糖提取工艺进行优化研究（表1）。
1.2.4 多糖纯化。将阴地蕨粗多糖以活性炭脫色、saveage法脱蛋白、冷冻干燥[10-11]，即得到纯化后的热水浸提的多糖。此纯化的多糖用于后续抗癌活性评价试验。
1.2.5 抗肿瘤细胞活性。参照任 靖等的方法[12]选取对数生长期肿瘤细胞，用相应的培养基制成细胞悬浮液，用细胞计数仪计数，按各细胞的最佳铺板浓度接种90 μL于96孔细胞培养板，5% CO2，37 ℃培养。24 h后加入样品10 μL，继续培养48 h，在细胞培养结束前的4 h，每孔中加入10 μL的MTT溶液继续培养到试验结束。倒置显微镜下观察细胞形态，将上清液轻轻倒掉后，每孔中加入二甲基亚砜150 μL，在酶标仪570 nm处测量每孔的吸光值。按下式计算抑制率：
抑制率（IR，%）=（对照D570值-待测样品D570值）/（对照D570值-空白孔D570值）×100
2 结果与分析
2.1 葡萄糖标准曲线
对葡萄糖标准溶液与对应的吸光度，绘制葡萄糖标准曲线，拟合线性方程为Y=0.012X 0.006，R2=0.996，可根据方程计算多糖得率。
2.2 单因素试验
2.2.1 料液比对粗多糖提取率的影响。从图1可看出，起初随着料液比的增加，多糖的提取率随之增加，料液比到达1∶60时多糖提取率达到最高，随后随着料液比的增加，多糖提取率稍呈下降趋势。
2.2.2 温度对多糖提取率的影响。从图2可以看出，随着温度的升高，阴地蕨多糖的提取率相应增加。当温度达到90 ℃时多糖的提取率达到最高，温度再升高到100 ℃时提取率则稍有降低。
2.2.3 时间对多糖提取率的影响。从图3可以看出，随着时间延长，阴地蕨多糖的得率增加，4 h后多糖的提取率随时间延长继续增加，但是增加量不明显。
2.2.4 提取次数对多糖提取率的影响。从图4可以看出，随着提取次数的增多，多糖得率逐渐增加。但是从第3次开始，随着提取次数增多，阴地蕨多糖的提取率虽有继续增加趋势，但是增加量不明显。
2.3 正交试验优化阴地蕨多糖提取工艺
分析表2正交试验结果可知，提取时间对试验结果具有显著性影响，其次是提取次数和温度，用水量对试验结果影响较小。影响总多糖得率的因素主次顺序为B>D>A>C。通过分析4个因素的影响，最优提取工艺组合为A3B3C1D2，即浸提温度为100 ℃，料液比1∶40，浸提时间4 h，浸提次数3次。在此条件下重复进行验证试验3 次，多糖得率分别为5.67%、5.64%、5.58%，多糖的平均提取率为5.63%。说明此提取条件稳定可靠，多糖得率高。
2.4 阴地蕨多糖的抗肿瘤活性
采用MTT法对阴地蕨多糖的抗肿瘤活性进行了初步筛选，结果见表3。可以看出，阴地蕨多糖对3种肿瘤细胞都有细胞毒活性，但是对小鼠结肠癌细胞CT-26和人白血病K562细胞的毒活性较弱，1 mg/mL时抑制率分别只达到27.06%和27.31%，IC50值分别为2.52、2.13 mg/mL；对小鼠白血病细胞WEHI-3抑制率在多糖浓度为1 mg/mL时达到55.36%，IC50值为0.85 mg/mL。
3 结论与讨论
通过正交设计得出阴地蕨多糖的最佳工艺条件为提取温度100 ℃，提取时间4 h，提取次数3次，料液比1∶40，在此条件下多糖得率5.63%，该优化结果对阴地蕨多糖开发利用和生产有重要的参考价值。
通过MTT试验和形态学观察，以3种肿瘤细胞，即人白血病K562细胞、小鼠白血病细胞WEHI-3和小鼠结肠癌细胞CT-26为试验材料对阴地蕨多糖活性进行了初步筛选，检测阴地蕨多糖的细胞毒性及其作用的细胞特异性。由试验结果可知，该多糖对不同种类癌细胞的细胞毒性存在差异。从MTT试验结果的半数抑制浓度IC50可以看出：阴地蕨多糖对3种癌细胞均有不同程度的细胞毒作用，细胞增殖的抑制作用随多糖浓度的加大而增强，呈剂量依赖性，相比之下，多糖对小鼠白血病细胞WEHI-3抑制作用最强，半数抑制浓度IC50为0.85 mg/mL，远大于对其他2种癌细胞的作用。该研究结果为阴地蕨多糖的抗癌作用研究提供了一定的参考。有关阴地蕨多糖的抗癌作用还需进一步深入研究。
4 参考文献
[1] 齐建红.阴地蕨属植物研究进展[J].西安文理学院学报（自然科学版），2012（2）：48-50.
[2] 张杭，张敬杰，刘亚华.贵州苗医常用的蕨类植物[J].中国民族药学杂志，2012，7（7）：27-28.
[3] 赵俊华，赵能武，王培善，等.土家药黔产铁线蕨、阴地蕨科药用植物的种类和分布研究[J].中国民族医药杂志，2008（5）：44-46.
[4] 刘芹，黎远军，鲁宗成.阴地蕨生物学功能的研究进展[J].中国医学导报，2014，11（23）：151-153.
[5] 王少明，阮君山，庄捷，等.阴地蕨提取物在制备抗肿瘤转移药物中的应用：中国，201010203636[P].2010-10-6.
[6] 陈晓清，陈郑斌.半边旗和阴地蕨粗多糖抗鱼病病原菌活性初步研究[J].亚热带植物科学，2009（2）：48-50.
[7] 杨林，刘翠花，刘刚，等.西藏野生尊麻水溶性多糖提取工艺的优化设计[J].食品工业科技，2013，34（2）：35-37.
[8] 王文平，郭祀远，李琳，等.苯酚-硫酸法测定野木瓜中多糖含量的研究[J].食品科学，2007，28（4）：276-279.
[9] 陈亮，张炜，陈元涛，等.响应曲面法优化黑果枸杞超声提取工艺[J].食品科技，2015，40（1）：220-227.
[10] CHEN Y，XIE M Y，LI W J，et al.An effective method for deproteinization of bioactive polysaccharides extracted from lingzhi（Ganoderma atrum）[J].Food Science and Biotechnology，2012，21（1）：191-198.
[11] 郭思维，刘胜姿，李威，等.人工冬虫夏草多糖脱色脱蛋白工艺研究[J].食品科技，2013，38（5）：207-211.
[12] 任靖，冯国楠，王敏伟，等.白英乙醇提取物抗肿瘤作用初步研究[J].中国中药杂志，2006，3 1（6）：497.