【摘 要】
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B7-2蛋白为免疫球蛋白超家族(IGSF)成员之一.采用PCR法从分泌鼠抗人B7-2抗体的杂交瘤细胞株克隆出该单克隆抗体的重链(VH)和轻链(VL)可变区基因,通过重叠延伸PCR(SOE-PCR)方
【机 构】
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苏州大学基础医学与生物科学学院,苏州大学医学生物技术研究所,江苏大学生命科学研究院,浙江大学动物科学学院
【基金项目】
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国家科技重大专项项目;江苏省自然科学基金
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B7-2蛋白为免疫球蛋白超家族(IGSF)成员之一.采用PCR法从分泌鼠抗人B7-2抗体的杂交瘤细胞株克隆出该单克隆抗体的重链(VH)和轻链(VL)可变区基因,通过重叠延伸PCR(SOE-PCR)方法,在VH和VL可变区基因间引入连接肽(Gly4Ser)3编码序列,体外构建抗人B7-2的鼠源单链抗体基因B7-2-ScFv.利用新型杂交病毒HyNPV的Bac-to-Bac表达系统,将B7-2-ScFv基因克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTa中,获得重组转移载体pFastBacHTa-B7-2-ScFv,转化大肠杆菌DH10Bac,获得重组杆粒Bacmid-B7-2-ScFv.将此重组杆粒的DNA转染Sf9细胞,获得重组病毒HyNPV-ScFv.感染该重组病毒的BmN细胞经SDS-PAGE和Western blotting分析表明,至感染24 h时目的蛋白已有表达,96 h达到最高表达水平,表达产物的分子质量约31 kD.用该重组病毒感染家蚕5龄起蚕,感染后96 h蚕体表现出明显的发病症状.RT-PCR结果表明,5龄起蚕感染后48 h,在脂肪体内已有目的基因转录,一直持续到感染后120 h;SDS-PAGE和Western blotting分析表明,5龄起蚕感染96 h后方可在脂肪体中检测到目的蛋白表达.构建并在家蚕中成功表达鼠抗人B7-2单链抗体,为深入研究和开发该抗体奠定了基础.
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