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摘要：【目的】利用葉绿体基因组（cpDNA）的间隔区序列（trnL-trnF、trnH-psbA和trnT-trnL）对甘薯种质进行遗传多样性分析，为其种质保护及开发利用提供理论依据。【方法】以从我国12个省份收集的52份甘薯种质为材料，从10个cpDNA间隔区序列的引物中筛选出能扩增单一、清晰明亮且稳定的序列引物，利用其PCR扩增筛选出间隔区序列，并进行测序及序列拼接。利用DnaSP 5.0进行序列特征分析，采用MEGA X计算52份甘薯种质材料的遗传距离，并构建系统发育进化树。【结果】筛选获得7对扩增结果较理想的引物，其PCR扩增产物经测序分析，共获得3个有效标记（trnL-trnF、trnH-psbA和trnT-trnL）。三者的拼接序列长度为2239 bp，共有7个变异位点，2个单一突变位点，5个简约信息位点，11个插入/缺失位点。在52份甘薯种质材料中，trnL-trnF、trnH-psbA和trnT-trnL序列的变异位点数量（Vs）分别为1、1和5个，单倍型数目（H）分别为2、4和5个，拼接序列的单倍型数目为10个;核苷酸多样性（π）和单倍型多样性（Hd）最高的序列分别为trnT-trnL（π=0.00052）和trnH-psbA（Hd=0.535）。trnL-trnF、trnH-psbA和trnT-trnL序列的Tajima’s D、Fu and Li’s D*和Fu and Li’s F*均无显著差异（P>0.05），符合中性进化模式。基于拼接序列构建的系统发育进化树显示，52份甘薯种质材料的遗传距离为0～1.1848，平均遗传距离0.1018，其分为五大类，其中第Ⅰ类～Ⅳ类仅含有少量种质，其余41份种质归为第Ⅴ类。【结论】52份甘薯种质材料的遗传变异较为丰富，但种质材料间的遗传多样性低，与cpDNA特性和甘薯遗传背景狭窄有关。基于trnL-trnF、trnH-psbA和trnT-trnL的拼接序列更能准确分析甘薯种质的遗传多样性，且有效划分不同类群，为甘薯集团育种提供候选材料。
关键词： 甘薯;叶绿体基因组（cpDNA）;trnL-trnF;trnH-psbA;trnT-trnL;遗传多样性;系统发育进化树
Abstract：【Objective】Genetic diversity of sweet potato germplasm was analyzed based on chloroplast genome DNA spacer sequences（trnL-trnF， trnH-psbA and trnT-trnL），to provide theoretical basis for the protection，development and utilization of sweet potato germplasm. 【Method】Taking 52 sweet potato materials from 12 different regions in China as the research object. From 10 primers of cpDNA spacer sequence， single， clear， bright and stable sequence primers were selected， and the selected spacer sequences were amplified by PCR， and sequenced and sequence spliced. The sequence features were analyzed by DnaSP 5.0 software. Using MEGA X software to calculate the genetic distance of 52 sweet potato germplasms and build phylogenetic tree. 【Result】Seven pairs of primers with ideal amplification results were screened. The PCR amplified products were sequenced and analyzed， and a total of three effective markers（trnL-trnF，trnH-psbA and trnT-trnL） were obtained. The splicing sequence length of the three was 2239 bp， which contained 7 mutation sites，2 singleton variable sites，5 parsimony information sites，and 11 insertion/deletion sites. Among the 52 sweet potato materials，the number of variable sites（Vs） of trnL-trnF，trnH-psbA，and trnT-trnL sequences were 1，1 and 5，respectively. The number of haplotypes（H） for the three were 2，4 and 5，respectively. The number of haplotypes were 10 after three sequences being merged. The sequences with the highest nucleotide diversity（π） and haplotype diversity（Hd） were trnT-trnL（π=0.00052） and trnH-psbA（Hd=0.535）. Tajima’s D and Fu and Li’s D*， Fu and Li’s F* values of trnL-trnF，trnH-psbA and trnT-trnL sequences did not reached the level of significant difference（P>0.05），respectively，which indicated that variation of those chloroplast regions followed neutral theory of molecular evolution. Phylogenetic tree constructed based on combination sequences showed that genetic distance of 52 sweet potato varieties was 0-1.1848，and the average genetic distance was 0.1018. The combination sequences divided the test sweet potato varieties into 5 categories.There are only a small amount of germplasms in Type I to Type IV， and the remaining 41 germplasms were classified as Type V. 【Conclusion】The genetic variation of 52 sweet potato germplasm materials is relatively rich， but the genetic diversity among germplasm materials is low， which is related to the cpDNA characteristics and the narrow genetic background of sweet potato. The trnL-trnF，trnH-psbA and trnT-trnL combination sequences can be used for sweet potato genetic diversity analysis，and the combination of the three sequences can distinguish the test materials into different groups and provide candidate materials for the next group breeding. Key words： Ipomoea batatas（L.）Lam.; chloroplast genome（cpDNA）; trnL-trnF; trnH-psbA; trnT-trnL; genetic diversity; phylogenetic tree
0 引言
【研究意义】甘薯[Ipomoea batatas（L.） Lam.]为旋花科（Convolvulaceae）番薯属（Ipomoea）双子叶植物，具有极高的营养价值和经济效益，是全球第七大重要粮食作物、中国第五大重要糧食作物（Mohanraj and Sivasankar，2014;Shekhar et al.，2015;Wang et al.，2016;Drapal et al.，2019）。甘薯是同源六倍体（2n=6x=90），染色体数目多，遗传背景复杂，给甘薯品种选育带来了巨大挑战（Yang et al.，2017a）。我国的甘薯种质资源丰富，但遗传背景狭窄，亲缘关系近，育成品种之间的血缘关系较近，接近94%甘薯品种具有南瑞苕和胜利百号的血缘，亟需拓宽甘薯的遗传背景及种质资源的收集保护（李强等，2008;王连军等，2018）。甘薯是无性繁殖作物，其主要育种手段是集团杂交。植物细胞质遗传是集团杂交育种的基础，其与叶绿体基因组（Chloroplast DNA，cpDNA）和线粒体基因组（Mitochondrial DNA，mt-DNA）密切有关（王连军等，2015）。cpDNA大多数编码蛋白除参与植物光合作用外，还参与其他的生化过程，如淀粉合成、色素合成和氮代谢，以及免疫反应等（Dunn et al.，2008;Ma et al.，2013;Martin et al.，2013）。cpDNA是植物体内的三大遗传系统之一，与核基因组相比，cpDNA具有分子量小、序列保守、进化缓慢、结构简单和单亲遗传等特点，且不易受外界环境的干扰（高连明等，2012）。因此，基于cpDNA分子水平进行甘薯品种鉴定和遗传多样性分析，对于甘薯的种质资源开发、鉴定和保护具有重要意义。【前人研究进展】基于cpDNA序列的特性，可将其用于物种的分子图谱构建、特定基因序列分析、物种鉴定、群体遗传学研究以及系统进化分析（王化坤等，2006）。目前已利用cpDNA序列对梨（常耀军等，2014;齐丹等，2019）、水稻（刘莎等，2017）、李（章秋平等，2017）等作物进行遗传多样性、系统进化和亲缘关系分析。trnL-trnF、trnH-psbA和trnT-trnL序列分别是cpDNA的非编码区，其进化速率快，片段两端存在保守序列，具有易于设计通用引物、稳定性好等特点，已在白杨（崔彬彬等，2006）、苹果（朱元娣等，2014）、茶树（刘振等，2018）、蒙古沙冬青（沈奇等，2019）、草莓（杨俊誉等，2020）等作物的分子鉴定和亲缘关系分析中广泛应用。吴小培等（2016）利用trnL-trnF序列对7份青藏扁蓿豆种质和3份内蒙古扁蓿豆种质进行遗传多样性和群体结构分析，结果表明群体间存在一定程度的历史基因交流，遗传多样性与气候环境密切相关。Fragoso-Martínez等（2017）使用ITS、trnL-trnF和psbA-trnH序列对鼠尾草进行分子鉴定，共鉴定出17个鼠尾草亚类，并从侧面验证了南美洲鼠尾草的多起源学说。Yang等（2017b）利用多个cpDNA间隔区序列对中国橡木进行进化分析和亲缘关系鉴定，结果发现psbA-trnH等序列对中国橡木具有较好的鉴别能力。许子欣等（2018）利用ITS序列和psbA-trnH序列对巴戟天居群进行分析，结果显示巴戟天的遗传结构与地理分布存在相关性。Appelhans和Wen（2020）研究发现，ITS和trnL-trnF序列结合可准确分析芸香的起源和进化关系。【本研究切入点】目前基于trnL-trnF、trnH-psbA和trnT-trnL序列对甘薯种质进行遗传多样性及亲缘关系分析的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】从我国12个省收集的52份甘薯种质为材料，PCR扩增其cpDNA间隔区序列（trnL-trnF、trnH-psbA和trnT-trnL等），双向测序后再拼接序列，基于合并序列进行遗传多样性及亲缘关系分析，为甘薯种质保护和亲本选配提供理论参考。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
供试甘薯种质材料52份，包括湖北省6份，江苏省10份，安徽省5份，山东省6份，河北省4份，河南省5份，浙江省5份，四川省3份，广东省3份，湖南省2份，福建省2份，台湾省1份（表1）。将上述种质材料种植于湖北省农业科学院粮食作物研究所，待长出新鲜叶片时进行取样。主要试剂：EasyTaq DNA聚合酶、10×EasyTaq Buffer for PAGE和dNTPs等均购自武汉全式金生物技术有限公司。主要仪器设备：离心机（Eppendorf，德国）、NanoDrop 2000分光光度计（Thermo，美国）、PCR仪（Bio-Rad，美国）和凝胶成像仪（Bio-Rad，美国）。
1. 2 DNA提取
采集甘薯新鲜幼嫩叶片，参照Yang等（2015）的改良CTAB方法提取甘薯叶片的基因组DNA。使用NanoDrop 2000分光光度计测定DNA浓度，用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。将供试样品DNA稀释到50～60 ng/μL，置于-20 ℃保存备用。
1. 3 PCR扩增
选择10对在其他物种中扩增效果良好的cpDNA间隔区序列（trnL-trnF、trnH-psbA和trnT-trnL等）通用引物（表2），由武汉天一辉远生物科技有限公司合成，利用其对供试材料进行PCR扩增。反应体系：10×PAGE Buffer（Mg2+）2.5 μL，dNTPs（10 mmol/L）2.0 μL，正、反向引物（10 mmol/L）各1.0 μL，基因组DNA（50～60 ng/uL）1.0 μL，EasyTaq DNA聚合酶0.5 μL，ddH2O补至25.0 μL。扩增程序：94 ℃预变性5 min;94 ℃ 30 s，54～58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共进行35个循环;72 ℃延伸5 min，4 ℃下保存5 min。PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶电泳中进行电泳，获得单一且清晰条带，将检测合格的PCR产物送到武汉天一辉远生物科技有限公司进行双向测序。 1. 4 统计分析
基于双向测序结果，使用DNAStar对cpDNA间隔区序列进行手动校对，删除序列两端不可靠的碱基序列，将正向序列和反向序列进行拼接（Burland，2000）。利用MEGA X对拼接序列进行序列长度、核苷酸构成及变异位点等序列特征分析，并基于MEGA X中的Kimura-2-parameter（K2P）模型、最大简约法（Maximum parsimony，MP）构建系统发育进化树（Kumar et al.，2018）。利用DnaSP 5.0計算变异位点数（Variable site，Vs）、单一突变位点数（Singleton variable site，Ss）、简约信息位点数（Parsimony informative site，Ps）、插入/缺失位点数（Insertion/deletion gaps，Is）、核苷酸多样性（Nucleotide diversity，π）、平均核苷酸差异（Average number of nucleotide difference，k）、单倍型数目（Number of haplotype，H）、单倍型多样性（Haplotype diversity，Hd）、单倍型多样性方差（Variance of haplotype diversity，Vh）和单倍型多样性标准差（Standard deviation of haplotype diversity，Sh），最后计算Tajiam’s D、Fu and Li’s D*及Fu and Li’s F*进行中性检验（Neutrality tests）（Librado and Rozas，2009）。
2 结果分析
2. 1 cpDNA间隔区序列扩增结果
用10对cpDNA间隔区序列引物对甘薯种质材料进行PCR扩增，结果发现有7对引物（390F/1326R、rbcL、psbC-trnS、trnM-rbcL、trnL-trnF、trnH-psbA和trnT-trnL）能扩增出单一、清晰明亮且稳定的特异性条带，其他3对引物扩增出非特异性条带、扩增条带模糊或无扩增条带。对扩增结果良好的7对引物扩增产物测序结果进行分析，共获得3个有效标记，分别是trnL-trnF、trnH-psbA和trnT-trnL（图1）。
2. 2 trnL-trnF、trnH-psbA和trnT-trnL序列特征分析结果
利用筛选获得的3对通用引物对52份甘薯种质材料进行PCR扩增，结果显示trnL-trnF、trnH-psbA和trnT-trnL序列在52份甘薯种质材料中的扩增产物长度分别为843～881 bp、642～669 bp和861～883 bp，将各区域对位排列后的片段长度分别为792、604和843 bp，三者的拼接序列总长度为2239 bp。核苷酸构成分析结果显示，trnL-trnF、trnH-psbA和trnT-trnL序列富含AT，其含量分别为62.23%～63.09%、64.86%～65.59%和73.48%～74.15%，GC含量分别为36.91%～37.77%、34.41%～35.14%和25.85%～26.52%;三者的拼接序列GC含量32.23%～32.70%，AT含量67.30%～67.77%。多态性分析结果（表2）显示，trnL-trnF序列含有1个简约信息位点，0个单一突变位点，0个插入/缺失位点;trnH-psbA序列多态性最高，含有1个简约信息位点，8个插入/缺失位点，0个单一突变位点;trnT-trnL序列多态性最低，含有3个简约信息位点。
52份甘薯种质材料的3个cpDNA间隔区拼接序列共含有变异位点7个，单一突变位点2个，简约信息位点5个，插入/缺失位点11个。其中trnL-trnF、trnH-psbA和trnT-trnL序列的变异位点分别为1、1和5个。trnL-trnF、trnH-psbA和trnT-trnL序列的核苷酸多样性（π）和平均核苷酸差异（k）分别为0.00022、0.00030、0.00036和0.177、0.177、0.440。三者的拼接序列核苷酸多样性（π）和平均核苷酸差异（k）分别为0.00036和0.795（表2）。
2. 3 trnL-trnF、trnH-psbA和trnT-trnL单倍型多样性分析结果
由表3可知，rnL-trnF、trnH-psbA和trnT-trnL序列单倍型数目（H）分别为2、4和5个，其中，trnT-trnL序列的单倍型多样性（Hd）最高，为0.184;trnL-trnF、trnH-psbA和trnT-trnL序列的单倍型多样性方差（Vh）和单倍型多样性标准差（Sh）分别为0.00438、0.00505、0.00515和0.066、0.067、0.072;三者的拼接序列单倍型数目（H）、单倍型多样性（Hd）、单倍型多样性方差（Vh）和单倍型多样性标准差（Sh）分别为10、0.575、0.00684和0.083。
2. 4 基于trnL-trnF、trnH-psbA和trnT-trnL序列的中性检验结果
由表4可知，trnL-trnF、trnH-psbA和trnT-trnL序列的Tajima’s D分别为-0.26487、-0.26487和-1.44693;Fu and Li’s D*分别为0.53980、0.53980和-0.84887;Fu and Li’s F*分别为0.35578、0.35578和-1.20944。trnH-psbA、trnL-trnF和trnT-trnL序列的Tajima’s D、Fu and Li’s D*和Fu and Li’s F*间均无显著差异（P>0.05），符合中性进化模式。
2. 5 基于trnL-trnF、trnH-psbA和trnT-trnL序列的甘薯种质亲缘关系分析结果 采用MEGA X的最大簡约法基于trnL-trnF、trnH-psbA和trnT-trnL的拼接序列构建系统发育进化树。使用自展法（Bootstrap）进行1000次检测以确保获得真实的系统发育进化树（自展值75%～100%表示强支持，50%～74%表示弱支持，小于50%表示不支持）。由图2可知，52份甘薯种质材料间的遗传距离为0～1.1848，平均遗传距离0.1018，其分为五大类：第Ⅰ类仅包括1个品种，即浙紫薯3号;第Ⅱ类包括鄂薯6号、川菜薯211、济农51和广菜薯6号;第Ⅲ类包括阜甜1号和皖薯7号;第Ⅳ类包括浙薯70、烟薯18、苏薯24和莆薯53;其余41份甘薯种质归为第Ⅴ类，该类中的自展值最低（小于50%），说明种质间的序列较一致，进化程度低。
3 讨论
随着越来越多植物的cpDNA序列测序完成，cpDNA已被广泛用于种质资源鉴定、物种群体分类及系统进化分析等（Sabater，2018）。由于集团杂交是甘薯育种的主要手段，基于cpDNA序列进行甘薯遗传多样性分析及品种鉴定具有重要意义。本研究选取cpDNA的间隔区序列（trnL-trnF、trnH-psbA和trnT-trnL）对52份甘薯种质材料开展遗传多样性研究，是因为单一序列提供的信息量较有限（辛雅儒，2018），3个序列可提供不同的信息，与所选的基因功能和位置有关，trnH-psbA序列所受的选择压强较强，相较于其他2个序列更保守，结合3个序列获得的结果则更准确。本研究发现，3个cpDNA间隔区序列中，trnT-trnL序列的变异位点（Vs）和简约信息位点（Ps）均高于trnL-trnF和trnH-psbA序列，表明trnT-trnL序列能提供更多的变异信息;核苷酸多样性（π）和单倍型多样性（Hd）最高的序列分别为trnT-trnL（π=0.00052）和trnH-psbA（Hd=0.535），与高源等（2020）采用cpDNA间隔区序列对楸子遗传多样性的研究结果（π=0.00949，Hd=0.854）基本一致。与兰花科植物的研究结果（π=0.00750，Hd=0.252）（Jin et al.，2017）相比，本研究中甘薯的遗传多样性低，其可能原因是本研究所用甘薯品种具有相同或相似的遗传信息，还可能与本研究所用的3个cpDNA间隔区序列的进化速率有关，研究表明trnL-trnF、trnH-psbA和trnT-trnL间隔序列相对保守，需要更加精准的结果时则需要结合其他cpDNA间隔区序列（Katayama et al.，2011）。
cpDNA属于母系遗传，基因重组少，基因突变类型主要表现为点突变、碱基插入/缺失等（Na et al.，2014）。本研究发现，核苷酸序列的变异中，插入/缺失位点总数最多，插入/缺失位点数（Is）和变异位点数（Vs）最多的序列分别为trnH-psbA（Is=8）和trnT-trnL（Vs=5）。3个cpDNA间隔区序列拼接后，单一突变位点（Ss）2个，简约信息位点（Ps）5个，插入/缺失位点（Is）11个，与单一序列分析相比，拼接序列更能准确反映序列的多态性信息。中性检验结果显示，trnH-psbA、trnL-trnF和trnT-trnL序列的Tajima’s D、Fu and Li’s D*和Fu and Li’s F*间均无显著差异，符合中性进化模式，暗示甘薯在进化过程中基因频率的进化速率不按照一定方向进行，存在不同方向突变，并且不存在选择压力，而是中性地保存下来。
甘薯种质资源遗传多样性分析是甘薯种质创新利用及保护研究的重要环节。随着育成品种的增多，基于形态特征来判断种质间的差异越来越难，近年来结合形态特征和基因序列特征等方法，如Roullier等（2011）利用cpDNA开发的SSR分子标记对甘薯不同品种间的亲缘关系和遗传多样性进行分析。本研究基于trnL-trnF、trnH-psbA和trnT-trnL序列对52份甘薯种质材料进行遗传多样性分析，将这3个序列拼接后共产生了10个单倍型，远高于梨（常耀军等，2014）、茶树（刘振等，2018）、刺山柑（程波等，2019）等单倍型数目，甘薯的遗传多样性较低，一方面与甘薯是同源六倍体，杂交不亲和有关;另一方面是经过长期的引种驯化和人类定向选择，导致甘薯的遗传多样性程度越来越低。本研究所用的52份甘薯种质材料的遗传距离为0～1.1848，平均遗传距离0.1018，表明52份甘薯种质的整体遗传距离较近;基于拼接序列将所有材料分为五大类，其中鄂薯6号、川菜薯211、济农51和广菜薯6号均聚为第Ⅱ类，表明4个甘薯品种在trnL-trnF、trnH-psbA和trnT-trnL序列基本保持一致，经序列比对分析发现，鄂薯6号与川菜薯211的拼接序列一致，济农51和广菜薯6号与鄂薯6号和川菜薯211相比，存在碱基缺失;第Ⅴ类的自展值小于50%，经序列比对分析发现，该类种质的拼接序列一致，可能原因是该类种质间具有相同的遗传背景;浙紫薯3号被单独聚类，表明与其他甘薯种质的核苷酸序列差异较大，具有单独的进化路线，在选择甘薯育种亲本时，鄂薯6号、川菜薯211、济农51和浙紫薯3号等可优先考虑。可见，cpDNA间隔区序列可用于分析甘薯遗传多样性和系统进化分析，若要更加准确地分析甘薯的亲缘关系和遗传多样性，还需要结合核基因和线粒体基因标记等方法。
4 结论
52份甘薯种质材料的遗传变异较为丰富，但种质材料间的遗传多样性低，与cpDNA特性和甘薯遗传背景狭窄有关。基于trnL-trnF、trnH-psbA和trnT-trnL的拼接序列更能准确分析甘薯种质的遗传多样性，且有效划分不同类群，为甘薯集团育种提供候选材料。
参考文献：
常耀军，曹玉芬，张金梅，田路明，董星光，张莹，齐丹，郑迎春. 2014. 基于叶绿体DNA分析的辽宁省梨属种质遗传多样性研究[J]. 园艺学报，41（7）：1307-1316. doi：10. 16420/j.issn.0513-353x.2014.07.005. [Chang Y J，Cao Y F，Zhang J M，Tian L M，Dong X G，Zhang Y，Qi D，Zheng Y C. 2014. Studies on genetic diversity of pear germplasm resources in Liaoning Province of China based on chloroplast DNA analysis[J]. Acta Horticulturae Sinica，41（7）：1307-1316.] 程波，楊伟俊，刘欢欢，何江. 2019. 基于叶绿体psbA-trnH基因间隔区序列鉴别维吾尔药刺山柑[J]. 中国药学杂志，54（12）：965-970. doi：10.11669/cpj.2019.12.007. [Cheng B，Yang W J，Liu H H，He J. 2019. Identification of uygur herb Capparis spinose based on sequences of the plastid psbA-trnH[J]. Chinese Pharmaceutical Journal，54（12）：965-970.]
崔彬彬，李云，金晓洁，冯慧. 2006. 白杨叶绿体和线粒体DNA的多态性及遗传性分析[J]. 北京林业大学学报，28（6）：9-14. doi：10.3321/j.issn：1000-1522.2006.06.002. [Cui B B，Li Y，Jin X J，Feng H. 2006. Genetic characters and polymorphism of chloroplast and mitochondrial DNA in white poplars[J]. Journal of Beijing Forestry University，28（6）：9-14.]
高连明，刘杰，蔡杰，杨俊波，张挺，李德铢. 2012. 关于植物DNA条形码研究技术规范[J]. 植物分类与资源学报，34（6）：592-606. doi：10.3724/SP.J.1143.2012.12138. [Gao L M，L J，Cai J，Yang J B，Zhang T，Li D Z. 2012. A sy-nopsis of technical notes on the standards for plant DNA barcoding[J]. Plant Diversity and Resources，34（6）：592-606.]
高源，王大江，王昆，丛佩华，张彩霞，李连文，朴继成. 2020. 基于叶绿体DNA分析的楸子种质遗传多样性研究[J]. 园艺学报，47（5）：853-863. doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2019-0609. [Gao Y，Wang D J，Wang K，Cong P H，Zhang C X，Li L W，Piao J C. 2020. Genetic diversity of Malus prunifolia germplasms based on chloroplast DNA analysis[J]. Acta Horticulturae Sinica，47（5）：853-863.]
李强，刘庆昌，翟红，马代夫，王欣，李雪琴，王玉萍. 2008. 中国甘薯主要亲本遗传多样性的ISSR分析[J]. 作物学报，34（6）：972-977. doi：10.3724/SP.J.1006.2008.00972. [Li Q，Liu Q C，Zhai H，Ma D F，Wang X，Li X Q，Wang Y P. 2008. Genetic diversity in main parents of sweetpotato in China as revealed by ISSR marker[J]. Acta Agronomica Sinica，34（6）：972-977.]
刘莎，郑晓明，冯雳，乔卫华，王君瑞，公婷婷，苏龙，丁膺宾，许睿，张丽芳，程云连，梁新霞，杨庆文，齐兰. 2017. 水稻长日抑制基因PhyB的多样性及区域适应性初探[J]. 植物资源遗传学报，18（2）：283-289. doi：10.13430/j.cnki.jpgr.2017.02.014. [Liu S，Zheng X M，Feng L，Qiao W H，Wang J R，Gong T T，Su L，Ding Y B，Xu R，Zhang L F，Cheng Y L，Liang X X，Yang Q W，Qi L. 2017. Genetic diversity and regional adaptability of long-day suppression gene（PhyB） in rice[J]. Journal of Plant Genetic Resources，18（2）：283-289.]
刘振，成杨，赵洋，杨培迪，杨阳. 2018. 基于叶绿体rbcL和trnH-psbA序列的湖南茶树资源遗传多样性与亲缘关系研究[J]. 热带作物学报，39（1）：40-45. doi：10.3969/j.issn.1000-2561.2018.01.007. [Liu Z，Cheng Y，Zhao Y，Yang P D，Yang Y. 2018. Genetic diversity and relationship study of Hunan tea germplasm resources based on chloroplast rbcL and trnH-psbA sequence[J]. Chinese Jour-nal of Tropical Crops，39（1）：40-45.]
齐丹，曹玉芬，胡红菊，王超，常耀军，田路明，董星光，张莹，霍宏亮，徐家玉，刘超，詹俊宇. 2019. 基于叶绿体DNA accD-psbI序列分析的广西梨地方品种遗传多样性研[J]. 中国南方果树，48（3）：91-94. doi：10.13938/j.issn.1007-1431.20190031. [Qi D，Cao Y F，Hu H J，Wang C，Chang Y J，Tian L M，Dong X G，Zhang Y，Huo H L，Xu J Y，Liu C，Zhan J Y. 2019. Genetic diversity of pear landraces in Guangxi based on DNA accD-psaI sequen-ces of chloroplast[J]. South China Fruits，48（3）：91-94.] 沈奇，潘月云，臧春鑫，赵志平，关潇，张银东. 2019. 基于叶绿体DNA单倍型的蒙古沙冬青遗传多样性格局探究[J]. 分子植物育种，17（4）：1378-1384. doi：10.13271/j.mpb. 017.001378. [Shen Q，Pan Y Y，Zang C X，Zhao Z P，Guan X，Zhang Y D. 2019. Study on distribution pa-ttern of genetic diversity of Ammopiptanthus mongolicus based on the haplotype of chloroplast DNA[J]. Molecular Plant Breeding，17（4）：1378-1384.]
王化坤，娄晓鸣，章镇. 2006. 叶绿体微卫星在植物种质资源研究中的应用[J]. 分子植物育种，4（3S）：92-98. [Wang H K，Lou X M，Zhang Z. 2006. Application in germplasm resource research using chloroplast simple sequence repeat[J]. Molecular Plant Breeding，4（3S）：92-98.]
王连军，雷剑，苏文瑾，柴沙沙，杨新笋. 2015. 2005─2014年甘薯品种国家鉴定情况分析[J]. 湖北农业科学，54（12）：2844-2847. doi：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.12. 08. [Wang L J，Lei J，Su W J，Chai S S，Yang X S. 2015. Analysis on registered sweet potato varieties of China from 2005 to 2014[J]. Hubei Agricultural Sciences，54（12）：2844-2847.]
王連军，雷剑，苏文瑾，柴沙沙，杨新笋. 2018. 甘薯优良种质徐薯18的育种价值分析[J]. 湖北农业科学，57（4）：11-14. doi：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.04.003. [Wang L J，Lei J，Su W J，Chai S S，Yang X S. 2018. Breeding value of the sweetpotato germplasm collection Xushu 18[J]. Hubei Agricultural Sciences，57（4）：11-14.]
吴小培，沈迎芳，王海庆. 2016. 基于trnL-trnF序列的扁蓿豆和青藏扁蓿豆遗传多样性及其群体遗传结构分析[J]. 草业科学，33（6）：1136-1146. doi：10.11829/j.issn.1001-0629.2015-0529. [Wu X P，Shen Y F，Wang H Q. 2016. Analysis of genetic diversity and population genetic structure of Medicago archiducis-nolai and Medicago archiducis-nolai and Medicago ruthenica populations based on cpDNA trnL-trnF sequences[J]. Pratacultural Science，33（6）：1136-1146.]
辛雅儒. 2018. 基于叶绿体基因trnL-F和psbA-trnH序列对老芒麦居群的遗传多样性研究[D]. 雅安：四川农业大学. [Xin Y R. 2018. Genetic diversity analysis of Elymus sibiricus.L based on chloroplast trnL-F and psbA-trnH sequences[D]. Ya’an：Sichuan Agricultural University.]
许子欣，冉志芳，杨小彤，郝庆秀，余意，周洁，郭兰萍. 2018. 基于psbA-trnH和rDNA ITS序列的不同地理居群巴戟天聚类分析[J]. 南方农业学报，49（12）：2364-2370. doi：10.3969/j.issn.2095-1191.2018.12.03. [Xu Z X，Ran Z F，Yang X T，Hao Q X，Yu Y，Zhou J，Guo L P. 2018. Cluster analysis of Morinda officinalis How in different geographical populations based on psbA-trnH and rDNA ITS sequences[J]. Journal of Southern Agriculture，49（12）：2364-2370.]
杨俊誉，魏世杰，苏代发，陈杉艳，罗志伟，沈雪梅，Arslan J，童江云，崔晓龙. 2020. 云南黄毛草莓的nrDNA ITS和cpDNA psbA-trnH序列分子鉴定及进化特征分析[J]. 南方农业学报，51（4）：748-757. doi：10.3969/j.issn.2095-1191. 2020.04.003. [Yang J Y，Wei S J，Su D F，Chen S Y，Luo Z W，Shen X M，Arslan J，Tong J Y，Cui X L. 2020. Molecular identification and evolutionary characteristics of Fragaria nilgerrensis in Yunnan based on nrDNA ITS and cpDNA psbA-trnH sequence analysis[J]. Journal of Southern Agriculture，51（4）：748-757.] 章秋平，魏瀟，刘威生，董文轩，刘宁，张玉萍，徐铭，刘硕，张玉君，马小雪. 2017. 基于叶绿体DNA序列trnL-F分析李亚属植物的系统发育关系[J]. 果树学报，34（10）：1249-1257. doi：10.13925/j.cnki.gsxb.20170098. [Zhang Q P，Wei X，Liu W S，Dong W X，Liu N，Zhang Y P，Xu M，Liu S，Zhang Y J，Ma X X. 2017. Phylogenetic relationship in the plants of subgenus Prunophora（Rosaceae） inferred from the chloroplast DNA region，trnL-F[J]. Journal of Fruit Science，34（10）：1249-1257.]
朱元娣，曹敏格，许正，王昆，张文. 2014. 基于ITS和matK序列探讨新疆野苹果与中国苹果的系统演化关系[J]. 园艺学报，41（2）：227-239. doi：10.3969/j.issn.0513-353X. 2014.02.003. [Zhu Y D，Cao M G，Xu Z，Wang K，Zhang W. 2014. Phylogenetic relationship between Xin-jiang wild apple（Malus sieversii Roem.） and Chinese apple（Malus×domestica subsp. chinesnsis）based on ITS and matK sequences[J]. Acta Horticulturae Sinica，41（2）：227-239.]
Appelhans M S，Wen J. 2020. Phylogenetic placement of Ivodea and biogeographic affinities of Malagasy Rutaceae[J]. Plant Systematics and Evolution，306（1）：1-14. doi：10.1007/s00606-020-01633-3.
Burland T G. 2000. Methods in molecular biology[M]. Totowa：Humana Press. doi：10.1385/1-59259-192-2：71.
Demesure B，Sodzi N，Petit R J. 1995. A set of universal primers for amplification of polymorphic non-coding regions of mitochondrial and chloroplast DNA in plants[J]. Molecular Ecology，41（1）：129-134. doi：10.1111/j. 1365-294X.1995.tb00201.x.
Dong W P，Liu J，Yu J，Wang L，Zhou S L. 2012. Highly variable chloroplast markers for evaluating plant phylogeny at low taxonomic levels and for DNA barcoding[J]. PLoS One，7（4）：e35071. doi：10.1371/journal.pone.0035071.
Drapal M，Rossel G，Heider B，Fraser P D. 2019. Metabolic diversity in sweet potato（Ipomoea batatas，Lam.） leaves and storage roots[J]. Horticulture Research，6（2）：1-9. doi：10.1038/s41438-018-0075-5.
Dunn C W，Hejnol A，Matus D Q，Pang K，Browne W E，Smith S A，Seaver E，Rouse G W，Obst M，Edgecombe G D，S?rensen M V，Haddock S H D，Schmidt-Rhaesa A，Okusu A，Kristensen R M，Wheeler W C，Martindale M Q，Giribet G. 2008. Broad phylogenomic sampling improves resolution of the animal tree of life[J]. Nature，452（7188）：745-749. doi：10.1038/nature06614.
Fragoso-Martínez I，Martínez-Gordillo M，Salazar G A，Sazatornil F，Jenks A A，García Pe?a M d R，Barrera-Aveleida G，Benitez-Vieyra S，Magallón S，Cornejo-Tenorio G，Mendoza C G. 2017. Phylogeny of the Neotropical sages（Salvia subg. Calosphace;Lamiaceae） and insights into pollinator and area shifts[J]. Plant Systematics and Evolution，304（1）：43-55. doi：10.1007/s00606-017-1445-4.
Jin W T，Schuiteman A，Chase M W，Li J W，Chung S W，Hsu T C，Jin X H. 2017. Phylogenetics of subtribe Orchidinae s.l（Orchidaceae;Orchidoideae） based on seven markers（plastid matK，psaB，rbcL，trnL-F，trnH-psba，and nuclear nrITS，Xdh）：Implications for generic delimitation[J]. BMC Plant Biology，17（1）：1-14. doi：10.1186/s12870- 017-1160-x. Jordan W C，Courtney M W，Neigel J E. 1996. Low levels of intraspecific genetic variation at a rapidly evolving chloroplast DNA locus in north American duckweeds（Lemnaceae）[J]. American Journal of Botany，83（4）：430-439. doi：10.2307/2446212.
Katayama H，Tachibana M，Iketani H，Zhang S L，Uematsu C. 2011. Phylogenetic utility of structural alterations found in the chloroplast genome of pear：Hypervariable regions in a highly conserved genome[J]. Tree Genetics and Genomes，8（2）：313-326. doi：10.1007/s11295-011-0442-y.
Kumar S，Stecher G，Li M，Knyaz C，Tamura K. 2018. MEGA X：Molecular evolutionary genetics analysis across computing platforms[J]. Molecular Biology and Evolution，35（6）：1547-1549. doi：10.1093/molbev/msy096.
Librado P，Rozas J. 2009. DnaSP v5：A software for comprehensive analysis of DNA polymorphism data[J]. Bioinformatics，25（11）：1451-1452. doi：10.1093/bioinformatics/btp187.
Ma J，Yang B X，Zhu W，Sun L L，Tian J K，Wang X M. 2013. The complete chloroplast genome sequence of Mahonia bealei（Berberidaceae）：Reveals a significant expansion of the inverted repeat and phylogenetic relationship with other angiosperms[J]. Gene，528（3）：120-131. doi：10.1016/j.gene.2013.07.037.
Martin G，Baurens F C，Cardi C，Aury J M，D’Hont A. 2013. The complete chloroplast genome of banana（Musa acumi-nata，Zingiberales）：Insight into plastid monocotyledon evolution[J]. PLoS One，8（6）：e67350. doi：10.1371/journal.pone.0067350.
Mohanraj R，Sivasankar S. 2014. Sweet potato（Ipomoea batatas[L.] Lam）─A valuable medicinal food：A rievew[J]. Journal of Medicinal Food，17（7）：733-741. doi：10.1089/jmf.2013.2818.
Na Y W，Jeong H J，Lee S Y，Choi H G，Kim S H，Rho I R. 2014. Chlorophyll fluorescence as a diagnostic tool for abiotic stress tolerance in wild and cultivated strawberry species[J]. Horticulture，Environment，and Biotechnology，55（4）：280-286. doi：10.1007/s13580-014-0006-9.
Parani M，Lakshmi M，Ziegenhagen B，Fladung M，Senthilkumar P，Parida A. 2000. Molecular phylogeny of mangroves VII. PCR-RFLP of trnS-psbC and rbcL gene regions in 24 mangrove and mangrove-associate species[J]. Theoretical and Applied Genetics，100：454-460. doi：10.1007/s001220050059.
Roullier C，Rossel G，Tay D，McKey D，Lebot V. 2011. Combining chloroplast and nuclear microsatellites to investigate origin and dispersal of New World sweet potato landraces[J]. Molecular Ecology，20（19）：3963-3977. doi：10.1111/j.1365-294X.2011.05229.x.
Sabater B. 2018. Chloroplast[M]. Basel：MDPI. Sang T，Crawford D J，Stuessy T F. 1997. Chloroplast DNA phylogeny，reticulate evolution，and biogeography of Paeo-nia（Paeoniaceae）[J]. American Journal of Botany，84（8）：1120-1136. doi：10.2307/2446155.
Shaw J，Lickey E，Schilling E，Small R L. 2007. Comparison of whole chloroplast genome sequences to choose noncoding regions for phylogenetic studies in angiosperms：The tortoise and the hare Ⅲ[J]. American Journal of Bo-tany，94（3）：275-288. doi：10.3732/ajb.94.3.275.
Shekhar S，Mishra D，Buragohain A K，Chakraborty S，Chakraborty N. 2015. Comparative analysis of phytochemicals and nutrient availability in two contrasting cultivars of sweet potato（Ipomoea batatas L.）[J]. Food Che-mistry，173：957-965. doi：10.1016/j.foodchem.2014.09. 172.
Taberlet P，Gielly L，Pautou G，Bouvet J. 1991. Universal primers for amplification of three non-coding regions of chloroplast DNA[J]. Plant Molecular Biology，17：1105-1109. doi：10.1007/BF00037152.
Wang S N，Nie S P，Zhu F. 2016. Chemical constituents and health effects of sweet potato[J]. Food Research International，8989（Pt1）：90-116. doi：10.1007/BF00037152.
Yang J，Moeinzadeh M H，Kuhl H，Helmuth J，Xiao P，Haas S，Liu G L，Zheng J L，Sun Z，Fan W J，Deng G F，Wang H X，Hu F H，Zhao S S，Fernie A R，Boerno S，Timmermann B，Zhang P，Vingron M. 2017a. Haplotype-resolved sweet potato genome traces back its hexaploidization history[J]. Nature Plants，3（9）：696-703. doi：10.1038/s41477- 017-0002-z.
Yang J，Vázquez L，Chen X D，Li H M，Zhang H，Liu Z L，Zhao G F. 2017b. Development of chloroplast and nuclear DNA markers for Chinese Oaks（Quercus Subgenus Quercus） and assessment of their utility as DNA barcodes[J]. Frontiers in Plant Science，8：1-17. doi：10.3389/fpls.2017. 00816.
Yang X S，Su W J，Wang L J，Lei J，Chai S S，Liu Q C. 2015. Molecular diversity and genetic structure of 380 sweetpotato accessions as revealed by SSR markers[J]. Journal of Integrative Agricultural，14（4）：633-641. doi：10.1016/S2095-3119（14）60794-2.
（責任编辑 陈 燕）
关键词： 甘薯;叶绿体基因组（cpDNA）;trnL-trnF;trnH-psbA;trnT-trnL;遗传多样性;系统发育进化树
Abstract：【Objective】Genetic diversity of sweet potato germplasm was analyzed based on chloroplast genome DNA spacer sequences（trnL-trnF， trnH-psbA and trnT-trnL），to provide theoretical basis for the protection，development and utilization of sweet potato germplasm. 【Method】Taking 52 sweet potato materials from 12 different regions in China as the research object. From 10 primers of cpDNA spacer sequence， single， clear， bright and stable sequence primers were selected， and the selected spacer sequences were amplified by PCR， and sequenced and sequence spliced. The sequence features were analyzed by DnaSP 5.0 software. Using MEGA X software to calculate the genetic distance of 52 sweet potato germplasms and build phylogenetic tree. 【Result】Seven pairs of primers with ideal amplification results were screened. The PCR amplified products were sequenced and analyzed， and a total of three effective markers（trnL-trnF，trnH-psbA and trnT-trnL） were obtained. The splicing sequence length of the three was 2239 bp， which contained 7 mutation sites，2 singleton variable sites，5 parsimony information sites，and 11 insertion/deletion sites. Among the 52 sweet potato materials，the number of variable sites（Vs） of trnL-trnF，trnH-psbA，and trnT-trnL sequences were 1，1 and 5，respectively. The number of haplotypes（H） for the three were 2，4 and 5，respectively. The number of haplotypes were 10 after three sequences being merged. The sequences with the highest nucleotide diversity（π） and haplotype diversity（Hd） were trnT-trnL（π=0.00052） and trnH-psbA（Hd=0.535）. Tajima’s D and Fu and Li’s D*， Fu and Li’s F* values of trnL-trnF，trnH-psbA and trnT-trnL sequences did not reached the level of significant difference（P>0.05），respectively，which indicated that variation of those chloroplast regions followed neutral theory of molecular evolution. Phylogenetic tree constructed based on combination sequences showed that genetic distance of 52 sweet potato varieties was 0-1.1848，and the average genetic distance was 0.1018. The combination sequences divided the test sweet potato varieties into 5 categories.There are only a small amount of germplasms in Type I to Type IV， and the remaining 41 germplasms were classified as Type V. 【Conclusion】The genetic variation of 52 sweet potato germplasm materials is relatively rich， but the genetic diversity among germplasm materials is low， which is related to the cpDNA characteristics and the narrow genetic background of sweet potato. The trnL-trnF，trnH-psbA and trnT-trnL combination sequences can be used for sweet potato genetic diversity analysis，and the combination of the three sequences can distinguish the test materials into different groups and provide candidate materials for the next group breeding. Key words： Ipomoea batatas（L.）Lam.; chloroplast genome（cpDNA）; trnL-trnF; trnH-psbA; trnT-trnL; genetic diversity; phylogenetic tree
0 引言
【研究意义】甘薯[Ipomoea batatas（L.） Lam.]为旋花科（Convolvulaceae）番薯属（Ipomoea）双子叶植物，具有极高的营养价值和经济效益，是全球第七大重要粮食作物、中国第五大重要糧食作物（Mohanraj and Sivasankar，2014;Shekhar et al.，2015;Wang et al.，2016;Drapal et al.，2019）。甘薯是同源六倍体（2n=6x=90），染色体数目多，遗传背景复杂，给甘薯品种选育带来了巨大挑战（Yang et al.，2017a）。我国的甘薯种质资源丰富，但遗传背景狭窄，亲缘关系近，育成品种之间的血缘关系较近，接近94%甘薯品种具有南瑞苕和胜利百号的血缘，亟需拓宽甘薯的遗传背景及种质资源的收集保护（李强等，2008;王连军等，2018）。甘薯是无性繁殖作物，其主要育种手段是集团杂交。植物细胞质遗传是集团杂交育种的基础，其与叶绿体基因组（Chloroplast DNA，cpDNA）和线粒体基因组（Mitochondrial DNA，mt-DNA）密切有关（王连军等，2015）。cpDNA大多数编码蛋白除参与植物光合作用外，还参与其他的生化过程，如淀粉合成、色素合成和氮代谢，以及免疫反应等（Dunn et al.，2008;Ma et al.，2013;Martin et al.，2013）。cpDNA是植物体内的三大遗传系统之一，与核基因组相比，cpDNA具有分子量小、序列保守、进化缓慢、结构简单和单亲遗传等特点，且不易受外界环境的干扰（高连明等，2012）。因此，基于cpDNA分子水平进行甘薯品种鉴定和遗传多样性分析，对于甘薯的种质资源开发、鉴定和保护具有重要意义。【前人研究进展】基于cpDNA序列的特性，可将其用于物种的分子图谱构建、特定基因序列分析、物种鉴定、群体遗传学研究以及系统进化分析（王化坤等，2006）。目前已利用cpDNA序列对梨（常耀军等，2014;齐丹等，2019）、水稻（刘莎等，2017）、李（章秋平等，2017）等作物进行遗传多样性、系统进化和亲缘关系分析。trnL-trnF、trnH-psbA和trnT-trnL序列分别是cpDNA的非编码区，其进化速率快，片段两端存在保守序列，具有易于设计通用引物、稳定性好等特点，已在白杨（崔彬彬等，2006）、苹果（朱元娣等，2014）、茶树（刘振等，2018）、蒙古沙冬青（沈奇等，2019）、草莓（杨俊誉等，2020）等作物的分子鉴定和亲缘关系分析中广泛应用。吴小培等（2016）利用trnL-trnF序列对7份青藏扁蓿豆种质和3份内蒙古扁蓿豆种质进行遗传多样性和群体结构分析，结果表明群体间存在一定程度的历史基因交流，遗传多样性与气候环境密切相关。Fragoso-Martínez等（2017）使用ITS、trnL-trnF和psbA-trnH序列对鼠尾草进行分子鉴定，共鉴定出17个鼠尾草亚类，并从侧面验证了南美洲鼠尾草的多起源学说。Yang等（2017b）利用多个cpDNA间隔区序列对中国橡木进行进化分析和亲缘关系鉴定，结果发现psbA-trnH等序列对中国橡木具有较好的鉴别能力。许子欣等（2018）利用ITS序列和psbA-trnH序列对巴戟天居群进行分析，结果显示巴戟天的遗传结构与地理分布存在相关性。Appelhans和Wen（2020）研究发现，ITS和trnL-trnF序列结合可准确分析芸香的起源和进化关系。【本研究切入点】目前基于trnL-trnF、trnH-psbA和trnT-trnL序列对甘薯种质进行遗传多样性及亲缘关系分析的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】从我国12个省收集的52份甘薯种质为材料，PCR扩增其cpDNA间隔区序列（trnL-trnF、trnH-psbA和trnT-trnL等），双向测序后再拼接序列，基于合并序列进行遗传多样性及亲缘关系分析，为甘薯种质保护和亲本选配提供理论参考。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
供试甘薯种质材料52份，包括湖北省6份，江苏省10份，安徽省5份，山东省6份，河北省4份，河南省5份，浙江省5份，四川省3份，广东省3份，湖南省2份，福建省2份，台湾省1份（表1）。将上述种质材料种植于湖北省农业科学院粮食作物研究所，待长出新鲜叶片时进行取样。主要试剂：EasyTaq DNA聚合酶、10×EasyTaq Buffer for PAGE和dNTPs等均购自武汉全式金生物技术有限公司。主要仪器设备：离心机（Eppendorf，德国）、NanoDrop 2000分光光度计（Thermo，美国）、PCR仪（Bio-Rad，美国）和凝胶成像仪（Bio-Rad，美国）。
1. 2 DNA提取
采集甘薯新鲜幼嫩叶片，参照Yang等（2015）的改良CTAB方法提取甘薯叶片的基因组DNA。使用NanoDrop 2000分光光度计测定DNA浓度，用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。将供试样品DNA稀释到50～60 ng/μL，置于-20 ℃保存备用。
1. 3 PCR扩增
选择10对在其他物种中扩增效果良好的cpDNA间隔区序列（trnL-trnF、trnH-psbA和trnT-trnL等）通用引物（表2），由武汉天一辉远生物科技有限公司合成，利用其对供试材料进行PCR扩增。反应体系：10×PAGE Buffer（Mg2+）2.5 μL，dNTPs（10 mmol/L）2.0 μL，正、反向引物（10 mmol/L）各1.0 μL，基因组DNA（50～60 ng/uL）1.0 μL，EasyTaq DNA聚合酶0.5 μL，ddH2O补至25.0 μL。扩增程序：94 ℃预变性5 min;94 ℃ 30 s，54～58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共进行35个循环;72 ℃延伸5 min，4 ℃下保存5 min。PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶电泳中进行电泳，获得单一且清晰条带，将检测合格的PCR产物送到武汉天一辉远生物科技有限公司进行双向测序。 1. 4 统计分析
基于双向测序结果，使用DNAStar对cpDNA间隔区序列进行手动校对，删除序列两端不可靠的碱基序列，将正向序列和反向序列进行拼接（Burland，2000）。利用MEGA X对拼接序列进行序列长度、核苷酸构成及变异位点等序列特征分析，并基于MEGA X中的Kimura-2-parameter（K2P）模型、最大简约法（Maximum parsimony，MP）构建系统发育进化树（Kumar et al.，2018）。利用DnaSP 5.0計算变异位点数（Variable site，Vs）、单一突变位点数（Singleton variable site，Ss）、简约信息位点数（Parsimony informative site，Ps）、插入/缺失位点数（Insertion/deletion gaps，Is）、核苷酸多样性（Nucleotide diversity，π）、平均核苷酸差异（Average number of nucleotide difference，k）、单倍型数目（Number of haplotype，H）、单倍型多样性（Haplotype diversity，Hd）、单倍型多样性方差（Variance of haplotype diversity，Vh）和单倍型多样性标准差（Standard deviation of haplotype diversity，Sh），最后计算Tajiam’s D、Fu and Li’s D*及Fu and Li’s F*进行中性检验（Neutrality tests）（Librado and Rozas，2009）。
2 结果分析
2. 1 cpDNA间隔区序列扩增结果
用10对cpDNA间隔区序列引物对甘薯种质材料进行PCR扩增，结果发现有7对引物（390F/1326R、rbcL、psbC-trnS、trnM-rbcL、trnL-trnF、trnH-psbA和trnT-trnL）能扩增出单一、清晰明亮且稳定的特异性条带，其他3对引物扩增出非特异性条带、扩增条带模糊或无扩增条带。对扩增结果良好的7对引物扩增产物测序结果进行分析，共获得3个有效标记，分别是trnL-trnF、trnH-psbA和trnT-trnL（图1）。
2. 2 trnL-trnF、trnH-psbA和trnT-trnL序列特征分析结果
利用筛选获得的3对通用引物对52份甘薯种质材料进行PCR扩增，结果显示trnL-trnF、trnH-psbA和trnT-trnL序列在52份甘薯种质材料中的扩增产物长度分别为843～881 bp、642～669 bp和861～883 bp，将各区域对位排列后的片段长度分别为792、604和843 bp，三者的拼接序列总长度为2239 bp。核苷酸构成分析结果显示，trnL-trnF、trnH-psbA和trnT-trnL序列富含AT，其含量分别为62.23%～63.09%、64.86%～65.59%和73.48%～74.15%，GC含量分别为36.91%～37.77%、34.41%～35.14%和25.85%～26.52%;三者的拼接序列GC含量32.23%～32.70%，AT含量67.30%～67.77%。多态性分析结果（表2）显示，trnL-trnF序列含有1个简约信息位点，0个单一突变位点，0个插入/缺失位点;trnH-psbA序列多态性最高，含有1个简约信息位点，8个插入/缺失位点，0个单一突变位点;trnT-trnL序列多态性最低，含有3个简约信息位点。
52份甘薯种质材料的3个cpDNA间隔区拼接序列共含有变异位点7个，单一突变位点2个，简约信息位点5个，插入/缺失位点11个。其中trnL-trnF、trnH-psbA和trnT-trnL序列的变异位点分别为1、1和5个。trnL-trnF、trnH-psbA和trnT-trnL序列的核苷酸多样性（π）和平均核苷酸差异（k）分别为0.00022、0.00030、0.00036和0.177、0.177、0.440。三者的拼接序列核苷酸多样性（π）和平均核苷酸差异（k）分别为0.00036和0.795（表2）。
2. 3 trnL-trnF、trnH-psbA和trnT-trnL单倍型多样性分析结果
由表3可知，rnL-trnF、trnH-psbA和trnT-trnL序列单倍型数目（H）分别为2、4和5个，其中，trnT-trnL序列的单倍型多样性（Hd）最高，为0.184;trnL-trnF、trnH-psbA和trnT-trnL序列的单倍型多样性方差（Vh）和单倍型多样性标准差（Sh）分别为0.00438、0.00505、0.00515和0.066、0.067、0.072;三者的拼接序列单倍型数目（H）、单倍型多样性（Hd）、单倍型多样性方差（Vh）和单倍型多样性标准差（Sh）分别为10、0.575、0.00684和0.083。
2. 4 基于trnL-trnF、trnH-psbA和trnT-trnL序列的中性检验结果
由表4可知，trnL-trnF、trnH-psbA和trnT-trnL序列的Tajima’s D分别为-0.26487、-0.26487和-1.44693;Fu and Li’s D*分别为0.53980、0.53980和-0.84887;Fu and Li’s F*分别为0.35578、0.35578和-1.20944。trnH-psbA、trnL-trnF和trnT-trnL序列的Tajima’s D、Fu and Li’s D*和Fu and Li’s F*间均无显著差异（P>0.05），符合中性进化模式。
2. 5 基于trnL-trnF、trnH-psbA和trnT-trnL序列的甘薯种质亲缘关系分析结果 采用MEGA X的最大簡约法基于trnL-trnF、trnH-psbA和trnT-trnL的拼接序列构建系统发育进化树。使用自展法（Bootstrap）进行1000次检测以确保获得真实的系统发育进化树（自展值75%～100%表示强支持，50%～74%表示弱支持，小于50%表示不支持）。由图2可知，52份甘薯种质材料间的遗传距离为0～1.1848，平均遗传距离0.1018，其分为五大类：第Ⅰ类仅包括1个品种，即浙紫薯3号;第Ⅱ类包括鄂薯6号、川菜薯211、济农51和广菜薯6号;第Ⅲ类包括阜甜1号和皖薯7号;第Ⅳ类包括浙薯70、烟薯18、苏薯24和莆薯53;其余41份甘薯种质归为第Ⅴ类，该类中的自展值最低（小于50%），说明种质间的序列较一致，进化程度低。
3 讨论
随着越来越多植物的cpDNA序列测序完成，cpDNA已被广泛用于种质资源鉴定、物种群体分类及系统进化分析等（Sabater，2018）。由于集团杂交是甘薯育种的主要手段，基于cpDNA序列进行甘薯遗传多样性分析及品种鉴定具有重要意义。本研究选取cpDNA的间隔区序列（trnL-trnF、trnH-psbA和trnT-trnL）对52份甘薯种质材料开展遗传多样性研究，是因为单一序列提供的信息量较有限（辛雅儒，2018），3个序列可提供不同的信息，与所选的基因功能和位置有关，trnH-psbA序列所受的选择压强较强，相较于其他2个序列更保守，结合3个序列获得的结果则更准确。本研究发现，3个cpDNA间隔区序列中，trnT-trnL序列的变异位点（Vs）和简约信息位点（Ps）均高于trnL-trnF和trnH-psbA序列，表明trnT-trnL序列能提供更多的变异信息;核苷酸多样性（π）和单倍型多样性（Hd）最高的序列分别为trnT-trnL（π=0.00052）和trnH-psbA（Hd=0.535），与高源等（2020）采用cpDNA间隔区序列对楸子遗传多样性的研究结果（π=0.00949，Hd=0.854）基本一致。与兰花科植物的研究结果（π=0.00750，Hd=0.252）（Jin et al.，2017）相比，本研究中甘薯的遗传多样性低，其可能原因是本研究所用甘薯品种具有相同或相似的遗传信息，还可能与本研究所用的3个cpDNA间隔区序列的进化速率有关，研究表明trnL-trnF、trnH-psbA和trnT-trnL间隔序列相对保守，需要更加精准的结果时则需要结合其他cpDNA间隔区序列（Katayama et al.，2011）。
cpDNA属于母系遗传，基因重组少，基因突变类型主要表现为点突变、碱基插入/缺失等（Na et al.，2014）。本研究发现，核苷酸序列的变异中，插入/缺失位点总数最多，插入/缺失位点数（Is）和变异位点数（Vs）最多的序列分别为trnH-psbA（Is=8）和trnT-trnL（Vs=5）。3个cpDNA间隔区序列拼接后，单一突变位点（Ss）2个，简约信息位点（Ps）5个，插入/缺失位点（Is）11个，与单一序列分析相比，拼接序列更能准确反映序列的多态性信息。中性检验结果显示，trnH-psbA、trnL-trnF和trnT-trnL序列的Tajima’s D、Fu and Li’s D*和Fu and Li’s F*间均无显著差异，符合中性进化模式，暗示甘薯在进化过程中基因频率的进化速率不按照一定方向进行，存在不同方向突变，并且不存在选择压力，而是中性地保存下来。
甘薯种质资源遗传多样性分析是甘薯种质创新利用及保护研究的重要环节。随着育成品种的增多，基于形态特征来判断种质间的差异越来越难，近年来结合形态特征和基因序列特征等方法，如Roullier等（2011）利用cpDNA开发的SSR分子标记对甘薯不同品种间的亲缘关系和遗传多样性进行分析。本研究基于trnL-trnF、trnH-psbA和trnT-trnL序列对52份甘薯种质材料进行遗传多样性分析，将这3个序列拼接后共产生了10个单倍型，远高于梨（常耀军等，2014）、茶树（刘振等，2018）、刺山柑（程波等，2019）等单倍型数目，甘薯的遗传多样性较低，一方面与甘薯是同源六倍体，杂交不亲和有关;另一方面是经过长期的引种驯化和人类定向选择，导致甘薯的遗传多样性程度越来越低。本研究所用的52份甘薯种质材料的遗传距离为0～1.1848，平均遗传距离0.1018，表明52份甘薯种质的整体遗传距离较近;基于拼接序列将所有材料分为五大类，其中鄂薯6号、川菜薯211、济农51和广菜薯6号均聚为第Ⅱ类，表明4个甘薯品种在trnL-trnF、trnH-psbA和trnT-trnL序列基本保持一致，经序列比对分析发现，鄂薯6号与川菜薯211的拼接序列一致，济农51和广菜薯6号与鄂薯6号和川菜薯211相比，存在碱基缺失;第Ⅴ类的自展值小于50%，经序列比对分析发现，该类种质的拼接序列一致，可能原因是该类种质间具有相同的遗传背景;浙紫薯3号被单独聚类，表明与其他甘薯种质的核苷酸序列差异较大，具有单独的进化路线，在选择甘薯育种亲本时，鄂薯6号、川菜薯211、济农51和浙紫薯3号等可优先考虑。可见，cpDNA间隔区序列可用于分析甘薯遗传多样性和系统进化分析，若要更加准确地分析甘薯的亲缘关系和遗传多样性，还需要结合核基因和线粒体基因标记等方法。
4 结论
52份甘薯种质材料的遗传变异较为丰富，但种质材料间的遗传多样性低，与cpDNA特性和甘薯遗传背景狭窄有关。基于trnL-trnF、trnH-psbA和trnT-trnL的拼接序列更能准确分析甘薯种质的遗传多样性，且有效划分不同类群，为甘薯集团育种提供候选材料。
参考文献：
常耀军，曹玉芬，张金梅，田路明，董星光，张莹，齐丹，郑迎春. 2014. 基于叶绿体DNA分析的辽宁省梨属种质遗传多样性研究[J]. 园艺学报，41（7）：1307-1316. doi：10. 16420/j.issn.0513-353x.2014.07.005. [Chang Y J，Cao Y F，Zhang J M，Tian L M，Dong X G，Zhang Y，Qi D，Zheng Y C. 2014. Studies on genetic diversity of pear germplasm resources in Liaoning Province of China based on chloroplast DNA analysis[J]. Acta Horticulturae Sinica，41（7）：1307-1316.] 程波，楊伟俊，刘欢欢，何江. 2019. 基于叶绿体psbA-trnH基因间隔区序列鉴别维吾尔药刺山柑[J]. 中国药学杂志，54（12）：965-970. doi：10.11669/cpj.2019.12.007. [Cheng B，Yang W J，Liu H H，He J. 2019. Identification of uygur herb Capparis spinose based on sequences of the plastid psbA-trnH[J]. Chinese Pharmaceutical Journal，54（12）：965-970.]
崔彬彬，李云，金晓洁，冯慧. 2006. 白杨叶绿体和线粒体DNA的多态性及遗传性分析[J]. 北京林业大学学报，28（6）：9-14. doi：10.3321/j.issn：1000-1522.2006.06.002. [Cui B B，Li Y，Jin X J，Feng H. 2006. Genetic characters and polymorphism of chloroplast and mitochondrial DNA in white poplars[J]. Journal of Beijing Forestry University，28（6）：9-14.]
高连明，刘杰，蔡杰，杨俊波，张挺，李德铢. 2012. 关于植物DNA条形码研究技术规范[J]. 植物分类与资源学报，34（6）：592-606. doi：10.3724/SP.J.1143.2012.12138. [Gao L M，L J，Cai J，Yang J B，Zhang T，Li D Z. 2012. A sy-nopsis of technical notes on the standards for plant DNA barcoding[J]. Plant Diversity and Resources，34（6）：592-606.]
高源，王大江，王昆，丛佩华，张彩霞，李连文，朴继成. 2020. 基于叶绿体DNA分析的楸子种质遗传多样性研究[J]. 园艺学报，47（5）：853-863. doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2019-0609. [Gao Y，Wang D J，Wang K，Cong P H，Zhang C X，Li L W，Piao J C. 2020. Genetic diversity of Malus prunifolia germplasms based on chloroplast DNA analysis[J]. Acta Horticulturae Sinica，47（5）：853-863.]
李强，刘庆昌，翟红，马代夫，王欣，李雪琴，王玉萍. 2008. 中国甘薯主要亲本遗传多样性的ISSR分析[J]. 作物学报，34（6）：972-977. doi：10.3724/SP.J.1006.2008.00972. [Li Q，Liu Q C，Zhai H，Ma D F，Wang X，Li X Q，Wang Y P. 2008. Genetic diversity in main parents of sweetpotato in China as revealed by ISSR marker[J]. Acta Agronomica Sinica，34（6）：972-977.]
刘莎，郑晓明，冯雳，乔卫华，王君瑞，公婷婷，苏龙，丁膺宾，许睿，张丽芳，程云连，梁新霞，杨庆文，齐兰. 2017. 水稻长日抑制基因PhyB的多样性及区域适应性初探[J]. 植物资源遗传学报，18（2）：283-289. doi：10.13430/j.cnki.jpgr.2017.02.014. [Liu S，Zheng X M，Feng L，Qiao W H，Wang J R，Gong T T，Su L，Ding Y B，Xu R，Zhang L F，Cheng Y L，Liang X X，Yang Q W，Qi L. 2017. Genetic diversity and regional adaptability of long-day suppression gene（PhyB） in rice[J]. Journal of Plant Genetic Resources，18（2）：283-289.]
刘振，成杨，赵洋，杨培迪，杨阳. 2018. 基于叶绿体rbcL和trnH-psbA序列的湖南茶树资源遗传多样性与亲缘关系研究[J]. 热带作物学报，39（1）：40-45. doi：10.3969/j.issn.1000-2561.2018.01.007. [Liu Z，Cheng Y，Zhao Y，Yang P D，Yang Y. 2018. Genetic diversity and relationship study of Hunan tea germplasm resources based on chloroplast rbcL and trnH-psbA sequence[J]. Chinese Jour-nal of Tropical Crops，39（1）：40-45.]
齐丹，曹玉芬，胡红菊，王超，常耀军，田路明，董星光，张莹，霍宏亮，徐家玉，刘超，詹俊宇. 2019. 基于叶绿体DNA accD-psbI序列分析的广西梨地方品种遗传多样性研[J]. 中国南方果树，48（3）：91-94. doi：10.13938/j.issn.1007-1431.20190031. [Qi D，Cao Y F，Hu H J，Wang C，Chang Y J，Tian L M，Dong X G，Zhang Y，Huo H L，Xu J Y，Liu C，Zhan J Y. 2019. Genetic diversity of pear landraces in Guangxi based on DNA accD-psaI sequen-ces of chloroplast[J]. South China Fruits，48（3）：91-94.] 沈奇，潘月云，臧春鑫，赵志平，关潇，张银东. 2019. 基于叶绿体DNA单倍型的蒙古沙冬青遗传多样性格局探究[J]. 分子植物育种，17（4）：1378-1384. doi：10.13271/j.mpb. 017.001378. [Shen Q，Pan Y Y，Zang C X，Zhao Z P，Guan X，Zhang Y D. 2019. Study on distribution pa-ttern of genetic diversity of Ammopiptanthus mongolicus based on the haplotype of chloroplast DNA[J]. Molecular Plant Breeding，17（4）：1378-1384.]
王化坤，娄晓鸣，章镇. 2006. 叶绿体微卫星在植物种质资源研究中的应用[J]. 分子植物育种，4（3S）：92-98. [Wang H K，Lou X M，Zhang Z. 2006. Application in germplasm resource research using chloroplast simple sequence repeat[J]. Molecular Plant Breeding，4（3S）：92-98.]
王连军，雷剑，苏文瑾，柴沙沙，杨新笋. 2015. 2005─2014年甘薯品种国家鉴定情况分析[J]. 湖北农业科学，54（12）：2844-2847. doi：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.12. 08. [Wang L J，Lei J，Su W J，Chai S S，Yang X S. 2015. Analysis on registered sweet potato varieties of China from 2005 to 2014[J]. Hubei Agricultural Sciences，54（12）：2844-2847.]
王連军，雷剑，苏文瑾，柴沙沙，杨新笋. 2018. 甘薯优良种质徐薯18的育种价值分析[J]. 湖北农业科学，57（4）：11-14. doi：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.04.003. [Wang L J，Lei J，Su W J，Chai S S，Yang X S. 2018. Breeding value of the sweetpotato germplasm collection Xushu 18[J]. Hubei Agricultural Sciences，57（4）：11-14.]
吴小培，沈迎芳，王海庆. 2016. 基于trnL-trnF序列的扁蓿豆和青藏扁蓿豆遗传多样性及其群体遗传结构分析[J]. 草业科学，33（6）：1136-1146. doi：10.11829/j.issn.1001-0629.2015-0529. [Wu X P，Shen Y F，Wang H Q. 2016. Analysis of genetic diversity and population genetic structure of Medicago archiducis-nolai and Medicago archiducis-nolai and Medicago ruthenica populations based on cpDNA trnL-trnF sequences[J]. Pratacultural Science，33（6）：1136-1146.]
辛雅儒. 2018. 基于叶绿体基因trnL-F和psbA-trnH序列对老芒麦居群的遗传多样性研究[D]. 雅安：四川农业大学. [Xin Y R. 2018. Genetic diversity analysis of Elymus sibiricus.L based on chloroplast trnL-F and psbA-trnH sequences[D]. Ya’an：Sichuan Agricultural University.]
许子欣，冉志芳，杨小彤，郝庆秀，余意，周洁，郭兰萍. 2018. 基于psbA-trnH和rDNA ITS序列的不同地理居群巴戟天聚类分析[J]. 南方农业学报，49（12）：2364-2370. doi：10.3969/j.issn.2095-1191.2018.12.03. [Xu Z X，Ran Z F，Yang X T，Hao Q X，Yu Y，Zhou J，Guo L P. 2018. Cluster analysis of Morinda officinalis How in different geographical populations based on psbA-trnH and rDNA ITS sequences[J]. Journal of Southern Agriculture，49（12）：2364-2370.]
杨俊誉，魏世杰，苏代发，陈杉艳，罗志伟，沈雪梅，Arslan J，童江云，崔晓龙. 2020. 云南黄毛草莓的nrDNA ITS和cpDNA psbA-trnH序列分子鉴定及进化特征分析[J]. 南方农业学报，51（4）：748-757. doi：10.3969/j.issn.2095-1191. 2020.04.003. [Yang J Y，Wei S J，Su D F，Chen S Y，Luo Z W，Shen X M，Arslan J，Tong J Y，Cui X L. 2020. Molecular identification and evolutionary characteristics of Fragaria nilgerrensis in Yunnan based on nrDNA ITS and cpDNA psbA-trnH sequence analysis[J]. Journal of Southern Agriculture，51（4）：748-757.] 章秋平，魏瀟，刘威生，董文轩，刘宁，张玉萍，徐铭，刘硕，张玉君，马小雪. 2017. 基于叶绿体DNA序列trnL-F分析李亚属植物的系统发育关系[J]. 果树学报，34（10）：1249-1257. doi：10.13925/j.cnki.gsxb.20170098. [Zhang Q P，Wei X，Liu W S，Dong W X，Liu N，Zhang Y P，Xu M，Liu S，Zhang Y J，Ma X X. 2017. Phylogenetic relationship in the plants of subgenus Prunophora（Rosaceae） inferred from the chloroplast DNA region，trnL-F[J]. Journal of Fruit Science，34（10）：1249-1257.]
朱元娣，曹敏格，许正，王昆，张文. 2014. 基于ITS和matK序列探讨新疆野苹果与中国苹果的系统演化关系[J]. 园艺学报，41（2）：227-239. doi：10.3969/j.issn.0513-353X. 2014.02.003. [Zhu Y D，Cao M G，Xu Z，Wang K，Zhang W. 2014. Phylogenetic relationship between Xin-jiang wild apple（Malus sieversii Roem.） and Chinese apple（Malus×domestica subsp. chinesnsis）based on ITS and matK sequences[J]. Acta Horticulturae Sinica，41（2）：227-239.]
Appelhans M S，Wen J. 2020. Phylogenetic placement of Ivodea and biogeographic affinities of Malagasy Rutaceae[J]. Plant Systematics and Evolution，306（1）：1-14. doi：10.1007/s00606-020-01633-3.
Burland T G. 2000. Methods in molecular biology[M]. Totowa：Humana Press. doi：10.1385/1-59259-192-2：71.
Demesure B，Sodzi N，Petit R J. 1995. A set of universal primers for amplification of polymorphic non-coding regions of mitochondrial and chloroplast DNA in plants[J]. Molecular Ecology，41（1）：129-134. doi：10.1111/j. 1365-294X.1995.tb00201.x.
Dong W P，Liu J，Yu J，Wang L，Zhou S L. 2012. Highly variable chloroplast markers for evaluating plant phylogeny at low taxonomic levels and for DNA barcoding[J]. PLoS One，7（4）：e35071. doi：10.1371/journal.pone.0035071.
Drapal M，Rossel G，Heider B，Fraser P D. 2019. Metabolic diversity in sweet potato（Ipomoea batatas，Lam.） leaves and storage roots[J]. Horticulture Research，6（2）：1-9. doi：10.1038/s41438-018-0075-5.
Dunn C W，Hejnol A，Matus D Q，Pang K，Browne W E，Smith S A，Seaver E，Rouse G W，Obst M，Edgecombe G D，S?rensen M V，Haddock S H D，Schmidt-Rhaesa A，Okusu A，Kristensen R M，Wheeler W C，Martindale M Q，Giribet G. 2008. Broad phylogenomic sampling improves resolution of the animal tree of life[J]. Nature，452（7188）：745-749. doi：10.1038/nature06614.
Fragoso-Martínez I，Martínez-Gordillo M，Salazar G A，Sazatornil F，Jenks A A，García Pe?a M d R，Barrera-Aveleida G，Benitez-Vieyra S，Magallón S，Cornejo-Tenorio G，Mendoza C G. 2017. Phylogeny of the Neotropical sages（Salvia subg. Calosphace;Lamiaceae） and insights into pollinator and area shifts[J]. Plant Systematics and Evolution，304（1）：43-55. doi：10.1007/s00606-017-1445-4.
Jin W T，Schuiteman A，Chase M W，Li J W，Chung S W，Hsu T C，Jin X H. 2017. Phylogenetics of subtribe Orchidinae s.l（Orchidaceae;Orchidoideae） based on seven markers（plastid matK，psaB，rbcL，trnL-F，trnH-psba，and nuclear nrITS，Xdh）：Implications for generic delimitation[J]. BMC Plant Biology，17（1）：1-14. doi：10.1186/s12870- 017-1160-x. Jordan W C，Courtney M W，Neigel J E. 1996. Low levels of intraspecific genetic variation at a rapidly evolving chloroplast DNA locus in north American duckweeds（Lemnaceae）[J]. American Journal of Botany，83（4）：430-439. doi：10.2307/2446212.
Katayama H，Tachibana M，Iketani H，Zhang S L，Uematsu C. 2011. Phylogenetic utility of structural alterations found in the chloroplast genome of pear：Hypervariable regions in a highly conserved genome[J]. Tree Genetics and Genomes，8（2）：313-326. doi：10.1007/s11295-011-0442-y.
Kumar S，Stecher G，Li M，Knyaz C，Tamura K. 2018. MEGA X：Molecular evolutionary genetics analysis across computing platforms[J]. Molecular Biology and Evolution，35（6）：1547-1549. doi：10.1093/molbev/msy096.
Librado P，Rozas J. 2009. DnaSP v5：A software for comprehensive analysis of DNA polymorphism data[J]. Bioinformatics，25（11）：1451-1452. doi：10.1093/bioinformatics/btp187.
Ma J，Yang B X，Zhu W，Sun L L，Tian J K，Wang X M. 2013. The complete chloroplast genome sequence of Mahonia bealei（Berberidaceae）：Reveals a significant expansion of the inverted repeat and phylogenetic relationship with other angiosperms[J]. Gene，528（3）：120-131. doi：10.1016/j.gene.2013.07.037.
Martin G，Baurens F C，Cardi C，Aury J M，D’Hont A. 2013. The complete chloroplast genome of banana（Musa acumi-nata，Zingiberales）：Insight into plastid monocotyledon evolution[J]. PLoS One，8（6）：e67350. doi：10.1371/journal.pone.0067350.
Mohanraj R，Sivasankar S. 2014. Sweet potato（Ipomoea batatas[L.] Lam）─A valuable medicinal food：A rievew[J]. Journal of Medicinal Food，17（7）：733-741. doi：10.1089/jmf.2013.2818.
Na Y W，Jeong H J，Lee S Y，Choi H G，Kim S H，Rho I R. 2014. Chlorophyll fluorescence as a diagnostic tool for abiotic stress tolerance in wild and cultivated strawberry species[J]. Horticulture，Environment，and Biotechnology，55（4）：280-286. doi：10.1007/s13580-014-0006-9.
Parani M，Lakshmi M，Ziegenhagen B，Fladung M，Senthilkumar P，Parida A. 2000. Molecular phylogeny of mangroves VII. PCR-RFLP of trnS-psbC and rbcL gene regions in 24 mangrove and mangrove-associate species[J]. Theoretical and Applied Genetics，100：454-460. doi：10.1007/s001220050059.
Roullier C，Rossel G，Tay D，McKey D，Lebot V. 2011. Combining chloroplast and nuclear microsatellites to investigate origin and dispersal of New World sweet potato landraces[J]. Molecular Ecology，20（19）：3963-3977. doi：10.1111/j.1365-294X.2011.05229.x.
Sabater B. 2018. Chloroplast[M]. Basel：MDPI. Sang T，Crawford D J，Stuessy T F. 1997. Chloroplast DNA phylogeny，reticulate evolution，and biogeography of Paeo-nia（Paeoniaceae）[J]. American Journal of Botany，84（8）：1120-1136. doi：10.2307/2446155.
Shaw J，Lickey E，Schilling E，Small R L. 2007. Comparison of whole chloroplast genome sequences to choose noncoding regions for phylogenetic studies in angiosperms：The tortoise and the hare Ⅲ[J]. American Journal of Bo-tany，94（3）：275-288. doi：10.3732/ajb.94.3.275.
Shekhar S，Mishra D，Buragohain A K，Chakraborty S，Chakraborty N. 2015. Comparative analysis of phytochemicals and nutrient availability in two contrasting cultivars of sweet potato（Ipomoea batatas L.）[J]. Food Che-mistry，173：957-965. doi：10.1016/j.foodchem.2014.09. 172.
Taberlet P，Gielly L，Pautou G，Bouvet J. 1991. Universal primers for amplification of three non-coding regions of chloroplast DNA[J]. Plant Molecular Biology，17：1105-1109. doi：10.1007/BF00037152.
Wang S N，Nie S P，Zhu F. 2016. Chemical constituents and health effects of sweet potato[J]. Food Research International，8989（Pt1）：90-116. doi：10.1007/BF00037152.
Yang J，Moeinzadeh M H，Kuhl H，Helmuth J，Xiao P，Haas S，Liu G L，Zheng J L，Sun Z，Fan W J，Deng G F，Wang H X，Hu F H，Zhao S S，Fernie A R，Boerno S，Timmermann B，Zhang P，Vingron M. 2017a. Haplotype-resolved sweet potato genome traces back its hexaploidization history[J]. Nature Plants，3（9）：696-703. doi：10.1038/s41477- 017-0002-z.
Yang J，Vázquez L，Chen X D，Li H M，Zhang H，Liu Z L，Zhao G F. 2017b. Development of chloroplast and nuclear DNA markers for Chinese Oaks（Quercus Subgenus Quercus） and assessment of their utility as DNA barcodes[J]. Frontiers in Plant Science，8：1-17. doi：10.3389/fpls.2017. 00816.
Yang X S，Su W J，Wang L J，Lei J，Chai S S，Liu Q C. 2015. Molecular diversity and genetic structure of 380 sweetpotato accessions as revealed by SSR markers[J]. Journal of Integrative Agricultural，14（4）：633-641. doi：10.1016/S2095-3119（14）60794-2.
（責任编辑 陈 燕）