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[摘要] 目的 探讨高糖高游离脂肪酸（free fatty acids，FFAs）对内皮细胞增殖和凋亡的影响及其作用机制。 方法 原代培养大鼠主动脉内皮细胞（rat aorta endothelial cell，RAEC），采用不同浓度的葡萄糖（5.5 mmol/L，30 mmol/L）及棕榈酸（200 μmol/L、400 μmol/L、600 μmol/L）单独或联合作用于细胞24 h、48 h、72 h。免疫组织化学染色方法鉴定内皮细胞并测定IL-8、Bcl-2、BAX表达水平；MTT比色法检测细胞增殖率。 结果 FFAs及葡萄糖单独及联合应用均可导致细胞出现凋亡形态学变化，增殖呈剂量-时间依赖性（P ＜ 0.05），且联合组明显低于单独培养组（P ＜ 0.01）；干预后IL-8、BAX表达增加，Bcl-2蛋白表达逐渐减弱，Bcl-2/BAX比值逐渐减小，联合培养组表达更为明显。 结论 高浓度FFAs及高糖具有抑制内皮细胞生长、促进其凋亡的作用，其作用机制可能是通过葡萄糖及棕榈酸酯参与PI3K/AKT等途径激活氧化应激诱导细胞凋亡。
[关键词] 糖尿病；游离脂肪酸；内皮细胞；bcl-2；BAX；PI3K/AKT
[中图分类号] R34[文献标识码] A[文章编号] 1673-9701（2012）10-0004-04
Influence and mechanism of free fatty acid and glucose on endothelial cell of rat aorta
GUO Hailian1 LIU Xiaoling2 LI Pengcui3 HAN Le2 WANG Dongqing1
1.Graduate School of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China; 2.Department of Endocrinology, the Second Affiliated Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001，China； 3.Department of Orthopaedic Laboratory, the Second Affiliated Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China
[Abstract] Objective To explore the influence and mechanism of free fatty acid（FFAs） and glucose on endothelial cell proliferation and apoptosis. Methods Rat aorta endothelial cell （RAEC）were cultured in vitro, glucose(5.5 mmol/L, 30 mmol/L) and palmitic acid (200 μmol/L、400 μmol/L、600 μmol/L) in different concentration were applied，alone and together, to RAEC for 24 h， 48 h， 72 h. Immunohistochemistry were used to determine CD31-related antigen and detectedIL-8, Bcl-2, BAX protein expression changes; Applied four methyl azo thiazole blue (determined by MTT) colorimetric detection different environment RAEC proliferation capacity. Results Glucose and FFAs, alone and together, can lead to apoptotic morphological changes in RAEC； FFAs and glucose display strong growth inhibitory effect in a-time and does-development manner against RAEC (P < 0.05), and the combination group was significantly lower than the proliferation of cultured alone group (P < 0.01). After intervention, IL-8, BAX expression were increased, Bcl-2 protein expression were gradually decreased, Bcl-2/BAX ratio wrere decreased, and more obvirous expression of the combination group. Conclusion High FFAs and high glucose can inhibit the growth of RAEC and promote their apoptosis, its mechanism may be involved by glucose and palmitate PI3K/AKT pathway activation oxidative stress-induced apoptosis.
[Key words] Diabetes mellit; Free fatty acid; Endothelial cell; bcl-2; BAX; PI3K/AKT
糖尿病血管病变是糖尿病的主要并发症之一，也是糖尿病患者致残和致死的主要并发症，其中血管内皮细胞的损伤在血管并发症中起着关键作用[1]。2001年美国糖尿病学会年会上，BANTING科学奖得主McGarry JD 教授提出，脂代谢障碍是2型糖尿病及其并发症的基本病理生理改变[2]。伴随着葡萄糖利用和代谢障碍，脂肪的合成代谢障碍而分解代谢异常增高，血液中FFAs含量增多，而FFAs在一定程度上可反映2型糖尿病患者体内脂代谢异常状况。FFAs尤其是棕榈酸（palmitic acid，PA）可导致内皮细胞功能障碍,是糖尿病血管病变的关键因素。因此，探讨脂毒性对糖尿病血管病变的影响及可能的机制对临床具有一定的指导意义。本实验观察高糖状态下不同浓度的棕榈酸对大鼠主动脉内皮细胞的影响，并探讨其可能的作用机制，为糖尿病血管病变的防治提供新的思路。
1 材料与方法
1.1 主要材料和试剂
SD大鼠（山西医科大学实验动物中心），软脂酸（Gibco，USA），RPMI 1640（武汉博士德），胎牛血清（Cyagen Biosciences，USA），大鼠内皮细胞生长因子（VEGF）（Prospec，USA），胰蛋白酶（TRYPSIN 1：250）（Solarbio），去脂牛血清白蛋白（d-BSA）、四甲基偶氮唑蓝（MTT）（sigma，USA），即用型兔抗大鼠CD31单克隆一抗试剂盒（武汉博士德）、即用型兔抗大鼠bcl-2单克隆一抗试剂盒（武汉博士德）、即用型兔抗大鼠BAX单克隆一抗试剂盒（武汉博士德）、即用型SABC免疫组织化学染色试剂盒（武汉博士德），DAB显色液（武汉博士德）。
1.2 主动脉内皮细胞的培养与鉴定
颈椎脱臼处死SD雌性大鼠，碘伏酒精消毒后，逐层剖开胸腹腔，于脊柱旁暴露主动脉，游离主动脉周围筋膜及结缔组织，分离后取主动脉弓至髂总动脉段，剪下放入无菌PBS液中漂洗去除附壁血细胞后，放入1640培养液中，使用眼科镊将主动脉内膜翻转朝外，并剪成1～2 mm宽动脉环，平均摆放入25 cm2培养瓶中，37 ℃、5%CO2培养箱中静置1 h后，加入配制好的大鼠专用内皮细胞培养液（RPMI1640、20%胎牛血清、大鼠内皮生长因子、肝素、青链霉素），静置68 h以上。每3天更换培养液一次，待细胞生长单层融合后，0.25%胰酶消化传代，实验使用3～5代细胞。采用形态学、倒置显微镜及抗CD31抗体免疫组化染色法行内皮细胞鉴定。
1.3 实验分组
试验共设置7组：（1）游离脂肪酸干预组设3组：以去脂牛血清白蛋白（d-BSA）为溶解软脂酸的载体，以加入培养液中软脂酸浓度的不同分为200 μmol/L、400 μmol/L、600 μmol/L（各组载体d-BSA含量为0.2%、0.4%、0.6%）；（2）葡萄糖干预组，30 mmol/L GLU；（3）联合培养组：30 mmol/L GLU 400 μmol/L PA；（4）对照组：①正常培养液组（含5.5mmol/L GLU），②0.5% d-BSA 正常培养液组。
1.4 形态学观察
以每孔1×104个细胞接种于6孔板中，细胞贴壁后加入PA及葡萄糖。设正常培养液组和0.5%d-BSA 正常培养液组为对照，于5%CO2、37℃温箱中孵育48 h，在倒置显微镜下观察并照相。
1.5 生长曲线的测定
取90%单层融合的鼠主动脉内皮细胞P3代细胞消化成单细胞悬液，调整细胞浓度为3×104/mL，接种至24孔培养板中，每孔1 mL，每三孔为1组，共8组。每隔24 h抽查一组，用血球计数板数细胞数目，以时间为横坐标，培养细胞数对数为纵坐标绘制生长曲线。细胞倍增时间以以下公式计算：TD =T×log2/（log Nt-log No），T为培养时间，Nt和No分别代表接种后及培养T小时后的细胞数。
1.6 主动脉内皮细胞生存率的检测（MTT比色法）
将细胞培养至单层融合时，换无血清RPMI1640培养液同步化细胞24 h，分别给于不同浓度的干预液，共同孵育24 h、48 h、72 h终点时，每孔依次加入MTT溶液20 μL（5 mg/mL），避光继续培养4 h，弃培养上清液；每孔加入DMSO 150 μL，置37℃水浴摇床均匀震荡10 min，室温放置10 min，使结晶物充分溶解；用酶标仪在492 nm波长处测定其吸光度（A）值。
1.7 免疫化学染色法测定IL-8、Bcl-2/BAX表达水平
常规消化，收集主动脉内皮细胞，按照每孔1×105接种于放有盖玻片的6孔板内，每孔加入2 mL 1640内皮细胞培养液，置于37℃、5%CO2孵育箱细胞爬片24 h，换无血清培养液培养24 h同步化细胞后加入不同浓度的棕榈酸及葡萄糖继续培养48 h，在48 h终点进行试验：先用PBS洗两次，加入4%多聚甲醛室温固定30 min，PBS洗两次，灭活酶室温30 min，蒸馏水洗2次，胰酶37℃修复10 min，PBS洗2次，山羊血清37℃封闭30 min，按操作说明滴加抗体，苏木素复染，脱水透明风干后封片，每次试验均以PBS代替一抗作为阴性对照组，以胞质出现棕黄色颗粒为阳性。采用Image-Pro Plus（IPP）分析免疫组化图片。
1.8 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件，实验数据以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较显著性检验采用方差分析（ANOVA），两两比较用q检验，P ＜ 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 主动脉内皮细胞形态
原代细胞在培养5～7 d后，在主动脉贴壁附近可见少量游出的内皮细胞，呈多角形或短梭形；培养到12～13 d，可见迁移出的细胞呈片生长，70%～80%单层融合，分布密度不均。见图1。大鼠主动脉内皮细胞在传代接种2 h后开始贴壁，24 h后90%细胞贴壁生长，24～48 h间细胞量有所减少，48 h后可见新长出的细胞为单层、互不重叠，呈梭形或鹅卵石状，边界清晰，胞浆丰富，核清晰，呈多角形。第3～5天，可见细胞呈小片状集落生长，细胞涨势增快，第5～7天细胞生长融合成片，中间排列紧密，部分可见典型的“铺路石”状排列的单层细胞。培养至7～8代后，细胞变瘦小，分泌物增多，可见细胞分化，成老化状态。
图1 原代大鼠主动脉内皮细胞100×
2.2 CD31相关抗原免疫组化鉴定结果
可见细胞呈圆形、梭形或多边形，细胞胞浆内可见棕黄色颗粒（图2a）,而对照组内未见着色（图2b）。证实培养的细胞为大鼠主动脉内皮细胞。
2.3 各组细胞（MTT）增殖状况
不同剂量的棕榈酸、葡萄糖及联合培养组处理内皮细胞24 h、48 h、72 h后，与正常培养液组及d-BSA对照组相比差异有统计学意义（P ＜ 0.05），其中24 h低剂量PA组与对照组相比，差异无统计学意义（P ＞ 0.05），说明短时间低浓度的棕榈酸酯对内皮细胞的损害较小；相同浓度时，24 h与72 h组内比较，高糖组、高、中、低剂量棕榈酸组差异有高度统计学意义（P ＜ 0.01），联合培养组不同时间段差异均有高度统计学意义（P ＜ 0.01）；高糖组、中、高剂量棕榈酸组48 h与72 h组内比较，24 h与48 h组内比较差异有统计学意义（P ＜ 0.05），低剂量组24 h与48 h，48 h与72 h组内比较差异无统计学意义（P ＞ 0.05）。正常培养液组与d-BSA组相比无统计学意义（P ＞ 0.05），见表1。说明棕榈酸及高糖抑制大鼠主动脉内皮细胞增殖，并具有时间-剂量依赖趋势；高糖及高脂联合培养组具有协同抑制作用，且具有时间依赖趋势。见图3。
注：横坐标（X轴）代表分组：①1640组为正常对照组（含GLU5.5 mmol/L）；②d-BSA组为0.5%d-BSA 1640对照组（含GLU5.5 mmol/L）；③高糖组为30 mmol/L GLU组；④联合组为30 mmol/L GLU 400 μmol/L PA；⑤低浓度PA为200 μmol/LPA组；⑥中浓度PA为400 μmol/L PA组；⑦高浓度PA为600 μmol/L PA组；纵坐标（Y轴）代表增殖率
图3 FFAs及葡萄糖对RAEC增殖的影响
2.4 细胞生长曲线
大鼠主动脉内皮细胞在传代接种2 h后开始贴壁，24 h后90%细胞贴壁生长，24～48 h间细胞量有所减少，48 h后可见新长出的细胞为单层、互不重叠，传代细胞增殖速率较原代细胞增长稍快，第4～7天为对数生长期，第8～9天为平台期。细胞生长曲线呈“S”型。见图4。
图4 大鼠主动脉内皮细胞生长曲线
2.5 细胞免疫组化法检测结果
正常对照组、d-BSA对照组培养内皮细胞48 h后，IL-8、BAX几乎不表达或弱表达，两个对照组之间差异无统计学意义（P ＞ 0.05）。不同浓度FFAs、高糖及联合培养组处理细胞后，细胞IL-8表达明显增高，且具有剂量-时间依赖关系，与对照组相比，差异均具有统计学意义（P ＜ 0.05）；细胞Bcl-2表达随时间延长及浓度的增高表达逐渐减弱，与正常对照组及d-BSA对照组相比，差异有统计学意义（P ＜ 0.05）；而细胞BAX表达则随时间的延长及浓度的增加表达亦增强，与正常对照组及d-BSA组比较，差异有统计学意义（P ＜ 0.05）。Bcl-2/BAX比值随葡萄糖及棕榈酸浓度增高逐渐减低，联合培养组为甚。见表2。
3 讨论
糖尿病血管病变是糖尿病特异的病理生理改变，是糖尿病多种并发症的共同病理生理基础（糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变、糖尿病心血管病变）。2型糖尿病患者常伴有血脂代谢异常，血清游离脂肪酸浓度随着血糖的增高而发生改变，伴随空腹血糖水平的升高而升高[3]。血管内皮细胞裱衬在整个心血管系统的内表面，是血管壁与血液之间的分界细胞，是形成心血管封闭管道系统的形态基础。血管内皮细胞不仅是炎症反应的中介物，也是受损靶器官，通过一系列复杂的机制从而影响炎症反应的进展和结局。内皮细胞的存活和细胞的程序性死亡在维护血管结构及血管生成中是极其重要的[4]。
bcl-2基因（即B细胞淋巴瘤/白血病-2基因）是一种原癌基因，具有抑制凋亡的作用。bax基因属于bcl-2基因家族，编码的BAX蛋白可与Bcl-2形成异二聚体，对Bcl-2产生阻抑作用。bax与bcl-2相互制约，在正常情况下二者保持一种平衡状态。研究发现Bax/Bcl-2两蛋白之间的比例关系是决定对细胞凋亡抑制作用强弱的关键因素，因此认为，bax是极重要的促细胞凋亡基因之一。BAX主要位于细胞质中，当凋亡发生时，BAX即刻转移到线粒体并与线粒体膜相结合，通过加速线粒体内细胞色素C的释放和增加Caspases的活性来促进细胞凋亡。目前国内外大多数学者把细胞Bcl-2/BAX值作为判断细胞凋亡是否被抑制或加强的主要标志之一[5]。
高血糖能通过减少Akt活性抑制葡萄糖转运子4（GLUT-4）介导葡萄糖转运，导致2型糖尿病。高葡萄糖可明显引起内皮细胞的早期凋亡，而不影响细胞的坏死，其形成可能与Akt酶活性下降有关。可能是通过PI3K-Akt信号途径抑制内皮细胞增殖，Akt的308位点苏氨酸磷酸化是葡萄糖影响内皮细胞增殖信号级联中的敏感元件[6]。PI3K-Akt信号途径在葡萄糖对内皮细胞增殖和凋亡过程中起了重要的作用[7]。因此，严格控制血糖是有效防治糖尿病血管并发症的措施。
IL-8由多种细胞产生，包括外周血淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞等，近来发现内皮细胞及肾小管上皮细胞也可产生。IL-8参与多种炎症疾患的发病过程，其自分泌和旁分泌功能已被证实在血管新生、肿瘤生长和转移中起重要作用[8，9]。Tashiro等发现，糖尿病患者尿中IL-8水平与HbA1c水平有显著联系，提示高血糖可能刺激IL-8的合成和分泌[10]。我们的实验证实，在高糖条件下，与对照组相比，IL-8表达增加，与Tashiro所观察到的反应一致；而在FFAs干预下，实验组中呈阳性表达，在正常对照组细胞内呈阴性表达，由此推测，在FFAs的诱导下，IL-8的上调，进一步介导炎性反应，在联合组中，高糖及高脂具有协同作用，参与了糖尿病血管病变的发展和恶化。
本实验研究证实大鼠主动脉内皮细胞在葡萄糖及FFAs干预下，细胞凋亡增加，并具有浓度-剂量依赖趋势。在高糖环境下，FFAs引起Akt快速激活，并导致PI3K受体激活，增加了细胞内活性氧水平，通过氧化应激使细胞内IL-8表达增加，同时激活PKC通路，使其转位，引起其下游Bcl-2蛋白表达减弱，BAX表达增强，因此，Bcl-2/BAX比值减小。FFAs诱导内皮细胞凋亡可能部分通过bcl-2改变线粒体膜的功能，并释放细胞色素C，部分通过调整Bcl-2/BAX的比率引起细胞凋亡。因此，Bcl-2可抑制线粒体介导的细胞死亡[11]。高糖环境下，高棕榈酸酯可激活细胞凋亡的机制导致内皮细胞凋亡，PI3K-Akt信号缺陷参与了糖尿病血管病变的发生发展，从而引起2型糖尿病患者心血管并发症。
本研究结果显示，糖尿病患者血浆中升高的FFAs通过影响内皮细胞的功能，损伤内皮细胞的完整性，从而在糖尿病血管病变中扮演一个非常重要的角色。FFAs引起的脂毒性在糖尿病血管病变中有重要的发病学意义，深入研究其发病机制及其作用机制，对预防及延缓糖尿病血管病变的发生发展具有广阔的前景和重要的临床价值。
[参考文献]
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[3]杨治芳，毛季萍，汤佳珍. 2型糖尿病患者游离脂肪酸与大血管病变的相关性研究[J]. 中华糖尿病杂志，2004，12（2）：100-103.
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[5]Lee JU，Hosotani R，Wada M，et al. Role of Bcl-2 family proteins（Bax，Bcl-2 and Bcl-X）on cellular susceptibility to radiation pancreatic cancer cells[J]. Eur J Cancer，1999，35（9）：1374-1380.
[6]于佩，于德民，齐建成，等. 高糖对PI3K-Akt信号传导途径及内皮细胞增殖的影响[J]. 天津医药，2007，35（11）：807-810.
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[8]Harada A，Sekido N，Akahoshi T，et al. Essential involvement of interleukin-8（IL-8）in acute inflammation[J]. J Leukoc Biol，1994，56（5）：559-564.
[9]Su BH，Chiu HY，Lin TW，et al. Interleukin-8 in bronchoalveolar lavage fluid of premature infants at risk of chronic lung disease[J]. J Formos Med Assoc，2005，104（4）：244-248.
[10]Tashiro K，Koyanagi I，Saitoh A，et al. Urinary levels of monocyte chemoattractant protein-1（MCP-1）and interleukin-8（IL-8），and renal injuries in patients with type 2 diabetic nephropathy[J]. J Clin Lab Anal，2002，16（1）：1-4.
[11]Timothy SK，Yunpeng D，Casey MM，et al. Levin Overexpression of Bcl-2 in vascular endothelium inhibits the microvascular lesions of diabetic retinopathy[J]. Am J Pathol，2010，176：2550-2558.
（收稿日期：2012-01-16）
[关键词] 糖尿病；游离脂肪酸；内皮细胞；bcl-2；BAX；PI3K/AKT
[中图分类号] R34[文献标识码] A[文章编号] 1673-9701（2012）10-0004-04
Influence and mechanism of free fatty acid and glucose on endothelial cell of rat aorta
GUO Hailian1 LIU Xiaoling2 LI Pengcui3 HAN Le2 WANG Dongqing1
1.Graduate School of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China; 2.Department of Endocrinology, the Second Affiliated Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001，China； 3.Department of Orthopaedic Laboratory, the Second Affiliated Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China
[Abstract] Objective To explore the influence and mechanism of free fatty acid（FFAs） and glucose on endothelial cell proliferation and apoptosis. Methods Rat aorta endothelial cell （RAEC）were cultured in vitro, glucose(5.5 mmol/L, 30 mmol/L) and palmitic acid (200 μmol/L、400 μmol/L、600 μmol/L) in different concentration were applied，alone and together, to RAEC for 24 h， 48 h， 72 h. Immunohistochemistry were used to determine CD31-related antigen and detectedIL-8, Bcl-2, BAX protein expression changes; Applied four methyl azo thiazole blue (determined by MTT) colorimetric detection different environment RAEC proliferation capacity. Results Glucose and FFAs, alone and together, can lead to apoptotic morphological changes in RAEC； FFAs and glucose display strong growth inhibitory effect in a-time and does-development manner against RAEC (P < 0.05), and the combination group was significantly lower than the proliferation of cultured alone group (P < 0.01). After intervention, IL-8, BAX expression were increased, Bcl-2 protein expression were gradually decreased, Bcl-2/BAX ratio wrere decreased, and more obvirous expression of the combination group. Conclusion High FFAs and high glucose can inhibit the growth of RAEC and promote their apoptosis, its mechanism may be involved by glucose and palmitate PI3K/AKT pathway activation oxidative stress-induced apoptosis.
[Key words] Diabetes mellit; Free fatty acid; Endothelial cell; bcl-2; BAX; PI3K/AKT
糖尿病血管病变是糖尿病的主要并发症之一，也是糖尿病患者致残和致死的主要并发症，其中血管内皮细胞的损伤在血管并发症中起着关键作用[1]。2001年美国糖尿病学会年会上，BANTING科学奖得主McGarry JD 教授提出，脂代谢障碍是2型糖尿病及其并发症的基本病理生理改变[2]。伴随着葡萄糖利用和代谢障碍，脂肪的合成代谢障碍而分解代谢异常增高，血液中FFAs含量增多，而FFAs在一定程度上可反映2型糖尿病患者体内脂代谢异常状况。FFAs尤其是棕榈酸（palmitic acid，PA）可导致内皮细胞功能障碍,是糖尿病血管病变的关键因素。因此，探讨脂毒性对糖尿病血管病变的影响及可能的机制对临床具有一定的指导意义。本实验观察高糖状态下不同浓度的棕榈酸对大鼠主动脉内皮细胞的影响，并探讨其可能的作用机制，为糖尿病血管病变的防治提供新的思路。
1 材料与方法
1.1 主要材料和试剂
SD大鼠（山西医科大学实验动物中心），软脂酸（Gibco，USA），RPMI 1640（武汉博士德），胎牛血清（Cyagen Biosciences，USA），大鼠内皮细胞生长因子（VEGF）（Prospec，USA），胰蛋白酶（TRYPSIN 1：250）（Solarbio），去脂牛血清白蛋白（d-BSA）、四甲基偶氮唑蓝（MTT）（sigma，USA），即用型兔抗大鼠CD31单克隆一抗试剂盒（武汉博士德）、即用型兔抗大鼠bcl-2单克隆一抗试剂盒（武汉博士德）、即用型兔抗大鼠BAX单克隆一抗试剂盒（武汉博士德）、即用型SABC免疫组织化学染色试剂盒（武汉博士德），DAB显色液（武汉博士德）。
1.2 主动脉内皮细胞的培养与鉴定
颈椎脱臼处死SD雌性大鼠，碘伏酒精消毒后，逐层剖开胸腹腔，于脊柱旁暴露主动脉，游离主动脉周围筋膜及结缔组织，分离后取主动脉弓至髂总动脉段，剪下放入无菌PBS液中漂洗去除附壁血细胞后，放入1640培养液中，使用眼科镊将主动脉内膜翻转朝外，并剪成1～2 mm宽动脉环，平均摆放入25 cm2培养瓶中，37 ℃、5%CO2培养箱中静置1 h后，加入配制好的大鼠专用内皮细胞培养液（RPMI1640、20%胎牛血清、大鼠内皮生长因子、肝素、青链霉素），静置68 h以上。每3天更换培养液一次，待细胞生长单层融合后，0.25%胰酶消化传代，实验使用3～5代细胞。采用形态学、倒置显微镜及抗CD31抗体免疫组化染色法行内皮细胞鉴定。
1.3 实验分组
试验共设置7组：（1）游离脂肪酸干预组设3组：以去脂牛血清白蛋白（d-BSA）为溶解软脂酸的载体，以加入培养液中软脂酸浓度的不同分为200 μmol/L、400 μmol/L、600 μmol/L（各组载体d-BSA含量为0.2%、0.4%、0.6%）；（2）葡萄糖干预组，30 mmol/L GLU；（3）联合培养组：30 mmol/L GLU 400 μmol/L PA；（4）对照组：①正常培养液组（含5.5mmol/L GLU），②0.5% d-BSA 正常培养液组。
1.4 形态学观察
以每孔1×104个细胞接种于6孔板中，细胞贴壁后加入PA及葡萄糖。设正常培养液组和0.5%d-BSA 正常培养液组为对照，于5%CO2、37℃温箱中孵育48 h，在倒置显微镜下观察并照相。
1.5 生长曲线的测定
取90%单层融合的鼠主动脉内皮细胞P3代细胞消化成单细胞悬液，调整细胞浓度为3×104/mL，接种至24孔培养板中，每孔1 mL，每三孔为1组，共8组。每隔24 h抽查一组，用血球计数板数细胞数目，以时间为横坐标，培养细胞数对数为纵坐标绘制生长曲线。细胞倍增时间以以下公式计算：TD =T×log2/（log Nt-log No），T为培养时间，Nt和No分别代表接种后及培养T小时后的细胞数。
1.6 主动脉内皮细胞生存率的检测（MTT比色法）
将细胞培养至单层融合时，换无血清RPMI1640培养液同步化细胞24 h，分别给于不同浓度的干预液，共同孵育24 h、48 h、72 h终点时，每孔依次加入MTT溶液20 μL（5 mg/mL），避光继续培养4 h，弃培养上清液；每孔加入DMSO 150 μL，置37℃水浴摇床均匀震荡10 min，室温放置10 min，使结晶物充分溶解；用酶标仪在492 nm波长处测定其吸光度（A）值。
1.7 免疫化学染色法测定IL-8、Bcl-2/BAX表达水平
常规消化，收集主动脉内皮细胞，按照每孔1×105接种于放有盖玻片的6孔板内，每孔加入2 mL 1640内皮细胞培养液，置于37℃、5%CO2孵育箱细胞爬片24 h，换无血清培养液培养24 h同步化细胞后加入不同浓度的棕榈酸及葡萄糖继续培养48 h，在48 h终点进行试验：先用PBS洗两次，加入4%多聚甲醛室温固定30 min，PBS洗两次，灭活酶室温30 min，蒸馏水洗2次，胰酶37℃修复10 min，PBS洗2次，山羊血清37℃封闭30 min，按操作说明滴加抗体，苏木素复染，脱水透明风干后封片，每次试验均以PBS代替一抗作为阴性对照组，以胞质出现棕黄色颗粒为阳性。采用Image-Pro Plus（IPP）分析免疫组化图片。
1.8 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件，实验数据以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较显著性检验采用方差分析（ANOVA），两两比较用q检验，P ＜ 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 主动脉内皮细胞形态
原代细胞在培养5～7 d后，在主动脉贴壁附近可见少量游出的内皮细胞，呈多角形或短梭形；培养到12～13 d，可见迁移出的细胞呈片生长，70%～80%单层融合，分布密度不均。见图1。大鼠主动脉内皮细胞在传代接种2 h后开始贴壁，24 h后90%细胞贴壁生长，24～48 h间细胞量有所减少，48 h后可见新长出的细胞为单层、互不重叠，呈梭形或鹅卵石状，边界清晰，胞浆丰富，核清晰，呈多角形。第3～5天，可见细胞呈小片状集落生长，细胞涨势增快，第5～7天细胞生长融合成片，中间排列紧密，部分可见典型的“铺路石”状排列的单层细胞。培养至7～8代后，细胞变瘦小，分泌物增多，可见细胞分化，成老化状态。
图1 原代大鼠主动脉内皮细胞100×
2.2 CD31相关抗原免疫组化鉴定结果
可见细胞呈圆形、梭形或多边形，细胞胞浆内可见棕黄色颗粒（图2a）,而对照组内未见着色（图2b）。证实培养的细胞为大鼠主动脉内皮细胞。
2.3 各组细胞（MTT）增殖状况
不同剂量的棕榈酸、葡萄糖及联合培养组处理内皮细胞24 h、48 h、72 h后，与正常培养液组及d-BSA对照组相比差异有统计学意义（P ＜ 0.05），其中24 h低剂量PA组与对照组相比，差异无统计学意义（P ＞ 0.05），说明短时间低浓度的棕榈酸酯对内皮细胞的损害较小；相同浓度时，24 h与72 h组内比较，高糖组、高、中、低剂量棕榈酸组差异有高度统计学意义（P ＜ 0.01），联合培养组不同时间段差异均有高度统计学意义（P ＜ 0.01）；高糖组、中、高剂量棕榈酸组48 h与72 h组内比较，24 h与48 h组内比较差异有统计学意义（P ＜ 0.05），低剂量组24 h与48 h，48 h与72 h组内比较差异无统计学意义（P ＞ 0.05）。正常培养液组与d-BSA组相比无统计学意义（P ＞ 0.05），见表1。说明棕榈酸及高糖抑制大鼠主动脉内皮细胞增殖，并具有时间-剂量依赖趋势；高糖及高脂联合培养组具有协同抑制作用，且具有时间依赖趋势。见图3。
注：横坐标（X轴）代表分组：①1640组为正常对照组（含GLU5.5 mmol/L）；②d-BSA组为0.5%d-BSA 1640对照组（含GLU5.5 mmol/L）；③高糖组为30 mmol/L GLU组；④联合组为30 mmol/L GLU 400 μmol/L PA；⑤低浓度PA为200 μmol/LPA组；⑥中浓度PA为400 μmol/L PA组；⑦高浓度PA为600 μmol/L PA组；纵坐标（Y轴）代表增殖率
图3 FFAs及葡萄糖对RAEC增殖的影响
2.4 细胞生长曲线
大鼠主动脉内皮细胞在传代接种2 h后开始贴壁，24 h后90%细胞贴壁生长，24～48 h间细胞量有所减少，48 h后可见新长出的细胞为单层、互不重叠，传代细胞增殖速率较原代细胞增长稍快，第4～7天为对数生长期，第8～9天为平台期。细胞生长曲线呈“S”型。见图4。
图4 大鼠主动脉内皮细胞生长曲线
2.5 细胞免疫组化法检测结果
正常对照组、d-BSA对照组培养内皮细胞48 h后，IL-8、BAX几乎不表达或弱表达，两个对照组之间差异无统计学意义（P ＞ 0.05）。不同浓度FFAs、高糖及联合培养组处理细胞后，细胞IL-8表达明显增高，且具有剂量-时间依赖关系，与对照组相比，差异均具有统计学意义（P ＜ 0.05）；细胞Bcl-2表达随时间延长及浓度的增高表达逐渐减弱，与正常对照组及d-BSA对照组相比，差异有统计学意义（P ＜ 0.05）；而细胞BAX表达则随时间的延长及浓度的增加表达亦增强，与正常对照组及d-BSA组比较，差异有统计学意义（P ＜ 0.05）。Bcl-2/BAX比值随葡萄糖及棕榈酸浓度增高逐渐减低，联合培养组为甚。见表2。
3 讨论
糖尿病血管病变是糖尿病特异的病理生理改变，是糖尿病多种并发症的共同病理生理基础（糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变、糖尿病心血管病变）。2型糖尿病患者常伴有血脂代谢异常，血清游离脂肪酸浓度随着血糖的增高而发生改变，伴随空腹血糖水平的升高而升高[3]。血管内皮细胞裱衬在整个心血管系统的内表面，是血管壁与血液之间的分界细胞，是形成心血管封闭管道系统的形态基础。血管内皮细胞不仅是炎症反应的中介物，也是受损靶器官，通过一系列复杂的机制从而影响炎症反应的进展和结局。内皮细胞的存活和细胞的程序性死亡在维护血管结构及血管生成中是极其重要的[4]。
bcl-2基因（即B细胞淋巴瘤/白血病-2基因）是一种原癌基因，具有抑制凋亡的作用。bax基因属于bcl-2基因家族，编码的BAX蛋白可与Bcl-2形成异二聚体，对Bcl-2产生阻抑作用。bax与bcl-2相互制约，在正常情况下二者保持一种平衡状态。研究发现Bax/Bcl-2两蛋白之间的比例关系是决定对细胞凋亡抑制作用强弱的关键因素，因此认为，bax是极重要的促细胞凋亡基因之一。BAX主要位于细胞质中，当凋亡发生时，BAX即刻转移到线粒体并与线粒体膜相结合，通过加速线粒体内细胞色素C的释放和增加Caspases的活性来促进细胞凋亡。目前国内外大多数学者把细胞Bcl-2/BAX值作为判断细胞凋亡是否被抑制或加强的主要标志之一[5]。
高血糖能通过减少Akt活性抑制葡萄糖转运子4（GLUT-4）介导葡萄糖转运，导致2型糖尿病。高葡萄糖可明显引起内皮细胞的早期凋亡，而不影响细胞的坏死，其形成可能与Akt酶活性下降有关。可能是通过PI3K-Akt信号途径抑制内皮细胞增殖，Akt的308位点苏氨酸磷酸化是葡萄糖影响内皮细胞增殖信号级联中的敏感元件[6]。PI3K-Akt信号途径在葡萄糖对内皮细胞增殖和凋亡过程中起了重要的作用[7]。因此，严格控制血糖是有效防治糖尿病血管并发症的措施。
IL-8由多种细胞产生，包括外周血淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞等，近来发现内皮细胞及肾小管上皮细胞也可产生。IL-8参与多种炎症疾患的发病过程，其自分泌和旁分泌功能已被证实在血管新生、肿瘤生长和转移中起重要作用[8，9]。Tashiro等发现，糖尿病患者尿中IL-8水平与HbA1c水平有显著联系，提示高血糖可能刺激IL-8的合成和分泌[10]。我们的实验证实，在高糖条件下，与对照组相比，IL-8表达增加，与Tashiro所观察到的反应一致；而在FFAs干预下，实验组中呈阳性表达，在正常对照组细胞内呈阴性表达，由此推测，在FFAs的诱导下，IL-8的上调，进一步介导炎性反应，在联合组中，高糖及高脂具有协同作用，参与了糖尿病血管病变的发展和恶化。
本实验研究证实大鼠主动脉内皮细胞在葡萄糖及FFAs干预下，细胞凋亡增加，并具有浓度-剂量依赖趋势。在高糖环境下，FFAs引起Akt快速激活，并导致PI3K受体激活，增加了细胞内活性氧水平，通过氧化应激使细胞内IL-8表达增加，同时激活PKC通路，使其转位，引起其下游Bcl-2蛋白表达减弱，BAX表达增强，因此，Bcl-2/BAX比值减小。FFAs诱导内皮细胞凋亡可能部分通过bcl-2改变线粒体膜的功能，并释放细胞色素C，部分通过调整Bcl-2/BAX的比率引起细胞凋亡。因此，Bcl-2可抑制线粒体介导的细胞死亡[11]。高糖环境下，高棕榈酸酯可激活细胞凋亡的机制导致内皮细胞凋亡，PI3K-Akt信号缺陷参与了糖尿病血管病变的发生发展，从而引起2型糖尿病患者心血管并发症。
本研究结果显示，糖尿病患者血浆中升高的FFAs通过影响内皮细胞的功能，损伤内皮细胞的完整性，从而在糖尿病血管病变中扮演一个非常重要的角色。FFAs引起的脂毒性在糖尿病血管病变中有重要的发病学意义，深入研究其发病机制及其作用机制，对预防及延缓糖尿病血管病变的发生发展具有广阔的前景和重要的临床价值。
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（收稿日期：2012-01-16）