【摘 要】
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目的 构建人铁蛋白轻链基因的原核表达载体,并评价与探讨能在大肠埃希菌(E.coli)中过表达的人铁蛋白轻链所制备的基因rFL质控品的均匀性、稳定性和精密度以及应用价值.方法
【基金项目】
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国家高技术研究发展计划(863计划)重大专项子课题资助项目;
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目的 构建人铁蛋白轻链基因的原核表达载体,并评价与探讨能在大肠埃希菌(E.coli)中过表达的人铁蛋白轻链所制备的基因rFL质控品的均匀性、稳定性和精密度以及应用价值.方法 采用RT-PCR从人新鲜全血总RNA克隆铁蛋白轻链(ferritin L)基因,构建亚克隆质粒pGM-T/ferritin L;用测序鉴定后,将重组质粒pET-30a/ferritin L转化E.coli BL21(DE3),经异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导rFL表达;采用SDS-PAGE对rFL进行鉴定,用WB分析其抗原性,ACCESS免疫分析仪测定其浓度.同时,采用随机数表从制备的rFL质控品中抽取15支,用单因素方差分析评价质控品的均匀性;用一元线性回归分析评价质控品的稳定性,再根据评价结果计算均匀性和稳定性的不确定度,然后进行精密度评价.结果 构建的铁蛋白轻链原核表达体系经测序显示,扩增的ferritin L基因片段与GenBank中的ferritin L编码序列(NM_000146.3)一致;PCR扩增出与ferritin L DNA的527 bp相符的片段;用IPTG诱导表达后,可得到表达量高的相对分子质量为19 000的rFL,WB证明其具有良好的抗原性;用ACCESS测定rFL稀释1 000倍后的浓度为(1 115.84±38.38) ng/ml.均匀性评价结果显示,高低2个浓度基因rFL质控品样本内和样本间的差异均无统计学意义(高浓度和低浓度基因rFL质控品的F值分别为2.336、0.730,P均>0.05).稳定性结果表明,质控品样本随贮存时间(5个半月)变化的线性趋势差异无统计学意义(F=1.755,P>0.05).精密度评价为高浓度基因rFL质控品批内CV为2.06%,批间CV为2.12%,日间CV为0%,总CV为2.96%;低浓度基因rFL质控品批内CV为2.03%,批间CV为2.08%,日间CV为0%,总CV为2.90%.结论 基因rFL质控品的均匀性、稳定性及精密度符合临床检测要求,可成为具有我国自主知识产权的铁蛋白质控品,同时也为铁蛋白混合质控品的制备提供了原料.
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