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摘要：为解决水稻秸秆还田的快速腐熟问题，通过刚果红和半纤维素平板透明圈法的初筛和酶活力高低的复筛，从稻田土壤中分离筛选出纤维素降解菌X-5和半纤维素降解菌B-3，30 ℃条件下水稻秸秆7 d的降解率分别为27.4%和23.9%。
关键词：水稻秸秆降解；纤维素；半纤维素；酶活
中图分类号：S154.39 文献标识码：A 文章编号：1674-1161（2014）06-0014-02
秸秆还田能够增加土壤有机质，是土壤改良修复的有效措施之一，但我国北方秋冬季气温低，秸秆腐熟程度影响下季的生产[1]。采用微生物菌剂降解秸秆，促使秸秆高效还田，是解决该问题的有效方法之一[2]。本试验从稻田土壤中筛选降解纤维素、半纤维素的菌株，为研制秸秆降解菌剂提供试验菌株。
1 材料与方法
1.1 土壤样品
取沈阳市东陵区稻田10～20 cm深的土壤存于密封袋，置于4 ℃条件下保存。
1.2 培养基
1.2.1 筛选纤维素分解菌培养基
1） 初筛鉴别培养基[3]：梭甲基纤维素钠20.0 g，硫酸铵2.0 g，磷酸氢二钾1.0 g，七水合硫酸镁0.5 g，氯化钠0.5 g，刚果红0.4 g，琼脂20.0 g，水1 000 mL，pH自然。
2） 液体复筛培养基：60目稻秆粉10.0 g，蛋白胨5.0 g，硫酸铵5.0 g，磷酸二氢钾0.3 g，七水合硫酸镁0.3 g，二水合氯化钙0.3 g，蒸馏水1 000 mL，pH自然。
1.2.2 筛选半纤维素分解菌培养基
1） 半纤维素初筛培养基：半纤维素20.0 g，氯化钠5.0 g，酵母膏5.0 g，硝酸铵2.0 g，磷酸二氢钾2.0 g，七水合硫酸镁0.2 g，琼脂20.0 g ，水1 000 mL，pH自然。
2） 液态复筛培养基：半纤维素20.0 g，氯化钠5.0 g，酵母膏5.0 g，硝酸铵2.0 g，磷酸二氢钾2.0 g，七水合硫酸镁0.2 g，水1 000 mL，pH自然。
2 试验方法
2.1 样品处理
称取10 g土样溶于90 mL带玻璃珠的无菌水中，振荡30 min后静置15 min。
2.2 纤维素降解菌的筛选
无菌操作，移取0.5 mL土样上清液于初筛平板培养基上涂布，然后置于恒温箱30 ℃倒置培养3～5 d，选取透明圈和菌落直径比D/d值大的菌株进行划线分离[4]。将初筛得到的单菌落制成菌悬液后，接种到液体复筛培养基中，并在恒温振荡器中30 ℃，130
r/min振荡培养48 h。将发酵液以5 000 r/min离心20 min，得粗酶液，采用DNS法测其纤维素酶的活性。
2.3 半纤维素降解菌的筛选
吸取土壤样品上清液0.5 mL在初筛培养基上涂布，置于恒温箱中30 ℃倒置培养3～5 d，挑取有水解圈的菌落转接至固态复筛培养基[5]。菌落培养出后，各挑取一环分别接种到液态复筛培养基中，恒温振荡器30 ℃、130 r/min振荡培养48 h，将发酵液以5 000
r/min离心20 min，得粗酶液，采用DNS法测其半纤维素酶的活性[6]。
2.4 水稻秸秆降解试验
准确称量40目水稻秸秆粉5.0 g装入250 mL三角瓶中，分别接种两种菌液2.5 mL，30 ℃下发酵7 d，用无菌水冲洗离心，重复3次，弃去上清液，80 ℃烘干至恒重。发酵前后质量之差即为秸秆降解的质量。
3 结果与分析
3.1 纤维素降解菌的筛选结果
经过常温分离筛选，得到19株在羧甲基纤维素钠刚果红平板上有透明圈的菌株，其中D/d值大于2的有6株。将初筛得到的6株菌接种到液体产酶培养基中进行摇瓶培养3 d后测其酶活。菌落直径与透明圈直径值比及CMC酶活见表1，其中X-5酶活最高，为5.53 IU/g。X-5在刚果红培养基上的透明圈见图1。
3.2 半纤维素降解菌的筛选结果
经过常温分离筛选，得到5株在半纤维素初筛平板上有透明圈的菌株。对初筛得到的5株菌进行摇瓶发酵试验，通过测定发酵液的木聚糖酶活力，进一步考查各菌株的产酶能力，结果见表2。由表2可知，B-3菌株产生的半纤维素酶活力明显高于其他4株菌。图2为菌株B-3在初筛平板上的透明圈。
3.3 水稻秸秆降解试验
利用筛选出的两株秸秆降解菌对水稻秸秆进行实际降解。在30 ℃条件下7 d后，利用菌株X-5降解的水稻秸秆质量减少了27.4%，利用菌株B-3降解的水稻秸秆质量减少了23.9%。这就表明筛选出的菌株的确对水稻秸秆有较好的降解效果。
4 讨论
具有高产纤维素酶和半纤维素酶的菌株能提高水稻秸秆降解效率，促进秸秆还田。本试验通过透明圈法筛选和酶活测定，得到秸秆降解菌株X-5和菌株B-3，并对水稻秸秆进行实际降解试验，结果表明，在30 ℃条件下降解7 d，秸秆质量分别下降了27.4%和23.9%。接下来将对这两株菌进行分类学鉴定，并对其产酶特性及酶学性质进行深入探究。
参考文献
[1] 任俊莉，彭锋，彭新文，等.农业秸秆半纤维素分离及纯化技术研究进展[J].纤维素科学与技术，2010，18（3）：56-68.
[2] Robson LM，Chambliss GH.Cellulases of bacterial origin[J].Enzyme Microbiotechnology，1989（11）：626-644.
[3] 陈燕，周孙全，郑奇士，等.常温纤维素降解菌的分离与鉴定[J].上海交通大学学报，微生物学杂志，2005，25（3）：57-61.
[4] 郝月，杨翔华，张晶，等.秸秆纤维素分解菌的分离筛选.[J].农业生物技术科学，2005，21（7）：58-60.
[5] 万先凯.一株高活力纤维素分解菌的筛选及酶学性质研究[D].天津：天津大学，2004.
[6] 董国强，张孟白，林开江.半纤维素酶的DNS液显色法测定[J].浙江农业科学，1989（2）：88-89.
关键词：水稻秸秆降解；纤维素；半纤维素；酶活
中图分类号：S154.39 文献标识码：A 文章编号：1674-1161（2014）06-0014-02
秸秆还田能够增加土壤有机质，是土壤改良修复的有效措施之一，但我国北方秋冬季气温低，秸秆腐熟程度影响下季的生产[1]。采用微生物菌剂降解秸秆，促使秸秆高效还田，是解决该问题的有效方法之一[2]。本试验从稻田土壤中筛选降解纤维素、半纤维素的菌株，为研制秸秆降解菌剂提供试验菌株。
1 材料与方法
1.1 土壤样品
取沈阳市东陵区稻田10～20 cm深的土壤存于密封袋，置于4 ℃条件下保存。
1.2 培养基
1.2.1 筛选纤维素分解菌培养基
1） 初筛鉴别培养基[3]：梭甲基纤维素钠20.0 g，硫酸铵2.0 g，磷酸氢二钾1.0 g，七水合硫酸镁0.5 g，氯化钠0.5 g，刚果红0.4 g，琼脂20.0 g，水1 000 mL，pH自然。
2） 液体复筛培养基：60目稻秆粉10.0 g，蛋白胨5.0 g，硫酸铵5.0 g，磷酸二氢钾0.3 g，七水合硫酸镁0.3 g，二水合氯化钙0.3 g，蒸馏水1 000 mL，pH自然。
1.2.2 筛选半纤维素分解菌培养基
1） 半纤维素初筛培养基：半纤维素20.0 g，氯化钠5.0 g，酵母膏5.0 g，硝酸铵2.0 g，磷酸二氢钾2.0 g，七水合硫酸镁0.2 g，琼脂20.0 g ，水1 000 mL，pH自然。
2） 液态复筛培养基：半纤维素20.0 g，氯化钠5.0 g，酵母膏5.0 g，硝酸铵2.0 g，磷酸二氢钾2.0 g，七水合硫酸镁0.2 g，水1 000 mL，pH自然。
2 试验方法
2.1 样品处理
称取10 g土样溶于90 mL带玻璃珠的无菌水中，振荡30 min后静置15 min。
2.2 纤维素降解菌的筛选
无菌操作，移取0.5 mL土样上清液于初筛平板培养基上涂布，然后置于恒温箱30 ℃倒置培养3～5 d，选取透明圈和菌落直径比D/d值大的菌株进行划线分离[4]。将初筛得到的单菌落制成菌悬液后，接种到液体复筛培养基中，并在恒温振荡器中30 ℃，130
r/min振荡培养48 h。将发酵液以5 000 r/min离心20 min，得粗酶液，采用DNS法测其纤维素酶的活性。
2.3 半纤维素降解菌的筛选
吸取土壤样品上清液0.5 mL在初筛培养基上涂布，置于恒温箱中30 ℃倒置培养3～5 d，挑取有水解圈的菌落转接至固态复筛培养基[5]。菌落培养出后，各挑取一环分别接种到液态复筛培养基中，恒温振荡器30 ℃、130 r/min振荡培养48 h，将发酵液以5 000
r/min离心20 min，得粗酶液，采用DNS法测其半纤维素酶的活性[6]。
2.4 水稻秸秆降解试验
准确称量40目水稻秸秆粉5.0 g装入250 mL三角瓶中，分别接种两种菌液2.5 mL，30 ℃下发酵7 d，用无菌水冲洗离心，重复3次，弃去上清液，80 ℃烘干至恒重。发酵前后质量之差即为秸秆降解的质量。
3 结果与分析
3.1 纤维素降解菌的筛选结果
经过常温分离筛选，得到19株在羧甲基纤维素钠刚果红平板上有透明圈的菌株，其中D/d值大于2的有6株。将初筛得到的6株菌接种到液体产酶培养基中进行摇瓶培养3 d后测其酶活。菌落直径与透明圈直径值比及CMC酶活见表1，其中X-5酶活最高，为5.53 IU/g。X-5在刚果红培养基上的透明圈见图1。
3.2 半纤维素降解菌的筛选结果
经过常温分离筛选，得到5株在半纤维素初筛平板上有透明圈的菌株。对初筛得到的5株菌进行摇瓶发酵试验，通过测定发酵液的木聚糖酶活力，进一步考查各菌株的产酶能力，结果见表2。由表2可知，B-3菌株产生的半纤维素酶活力明显高于其他4株菌。图2为菌株B-3在初筛平板上的透明圈。
3.3 水稻秸秆降解试验
利用筛选出的两株秸秆降解菌对水稻秸秆进行实际降解。在30 ℃条件下7 d后，利用菌株X-5降解的水稻秸秆质量减少了27.4%，利用菌株B-3降解的水稻秸秆质量减少了23.9%。这就表明筛选出的菌株的确对水稻秸秆有较好的降解效果。
4 讨论
具有高产纤维素酶和半纤维素酶的菌株能提高水稻秸秆降解效率，促进秸秆还田。本试验通过透明圈法筛选和酶活测定，得到秸秆降解菌株X-5和菌株B-3，并对水稻秸秆进行实际降解试验，结果表明，在30 ℃条件下降解7 d，秸秆质量分别下降了27.4%和23.9%。接下来将对这两株菌进行分类学鉴定，并对其产酶特性及酶学性质进行深入探究。
参考文献
[1] 任俊莉，彭锋，彭新文，等.农业秸秆半纤维素分离及纯化技术研究进展[J].纤维素科学与技术，2010，18（3）：56-68.
[2] Robson LM，Chambliss GH.Cellulases of bacterial origin[J].Enzyme Microbiotechnology，1989（11）：626-644.
[3] 陈燕，周孙全，郑奇士，等.常温纤维素降解菌的分离与鉴定[J].上海交通大学学报，微生物学杂志，2005，25（3）：57-61.
[4] 郝月，杨翔华，张晶，等.秸秆纤维素分解菌的分离筛选.[J].农业生物技术科学，2005，21（7）：58-60.
[5] 万先凯.一株高活力纤维素分解菌的筛选及酶学性质研究[D].天津：天津大学，2004.
[6] 董国强，张孟白，林开江.半纤维素酶的DNS液显色法测定[J].浙江农业科学，1989（2）：88-89.