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摘 要：为了解鄂西山区猪群中猪圆环病毒2型的感染情况，应用ELISA方法对鄂西山区2013-2015年间的1260份不同年龄段的猪血清进行PCV2抗体检测，同时检测了PRRSV、PRV gE及CSFV抗体，结果表明PCV2抗体检测平均阳性率为56.75 %（715/1260），不同猪群的检测结果表明，公猪的PCV2抗体阳性率最低为20 %（4/20），保育猪PCV2抗体阳性率最高为66.67 %（204/306）；全部未免疫PRRSV疫苗猪的PRRSV抗体平均阳性率为48.45 %（344/710），PRV gE抗体平均阳性率为23.73 %（299/1260），而CSFV免疫抗体平均阳性率仅为71.35 %。同时发现PCV2抗体感染率高的猪场PRRSV、PRV的感染率也相对较高，而CSFV的免疫抗体阳性率则相对较低。本研究结果表明PCV2感染在鄂西山区猪群中普遍存在，且与PRRSV、PRV的感染具有一定的相关性。
关键词：PCV2；抗体；ELISA；混合感染
中图分类号：S855.3 文献标识码：A 文章编号：1001-0769（2016）10-0033-04
猪圆环病毒（Porcine Circovirus， PCV）在病毒分类上属于圆环病毒科（Circoviridae）圆环病毒属（Circovirus），是一种环状、无囊膜的单股DNA病毒[1]，包括猪圆环病毒1型（PCV1）和猪圆环病毒2型（PCV2）两个基因型，其中PCV1对猪无致病性，PCV2是严重危害全球养猪业的重要病原之一[2]。PCV2主要感染6～12周龄猪，临床表现为体质下降、消瘦、皮肤发白、腹泻、呼吸困难，有的猪有黄疸。PCV2感染一般不会直接引起猪的死亡，主要是引起猪体的免疫抑制[3，4]。由于PCV2能破坏猪体的免疫系统，造成免疫抑制，因而本病常与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪肺炎支原体、多杀性巴氏杆菌和链球菌等混合或继发感染[5]。PCV2及其相关联的猪病已在全世界范围内发生和流行，死亡率10 %～30 %不等。较严重的地区，猪场在暴发本病时死淘率高达40 %左右，其危害和造成的重大经济损失显而易见，现已被公认为世界重要的猪传染病[6，7]。
近年来，PCV2的发生呈上升趋势，其危害除自身引起的免疫抑制以外，还容易继发、并发其他一系列疾病，给我国乃至世界养猪业造成了巨大损失。为了解鄂西山区PCV2的感染及与其他疫病的混合感染情况，本研究利用ELISA方法对2013年～2015年间采自鄂西山区不同养殖场的1 260份猪血清进行了PCV2抗体检测，并对该猪瘟抗体、猪繁殖与呼吸综合征抗体及猪伪狂犬病抗体进行了检测，旨在了解鄂西山区PCV2的感染及其他疫病的感染与免疫情况，为鄂西山区PCV2的综合防控提供理论依据，为进一步促进鄂西山区养猪业的健康可持续发展提供技术支持。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 猪血清样本的收集
本研究于2013年～2015年间，在鄂西山区鄂西山区随机选择20个猪场（均未免疫商品化猪圆环病毒疫苗），按5 %的比例随机采集不同年龄段猪的血液样品。血液采自猪耳静脉或前腔静脉，分离血清，4 ℃保存备用或立即进行ELISA检测。
1.1.2 检测所用试剂盒
PCV2抗体检测试剂盒为本实验室利用原核表达的PCV2 cap蛋白作为抗原包被酶标板制备的试剂盒；猪伪狂犬病gE抗体检测试剂盒、猪瘟病毒抗体检测试剂盒、猪繁殖与呼吸综合征抗体检测试剂盒均为美国IDEXX公司产品，购于北京爱德士元亨生物科技有限公司。
1.2 检测方法
PCV2抗体检测按如下步骤进行：
（1）样品处理：将全血样品4 000 rpm离心 10 min，取上清备用；
（2）样品稀释：在血清稀释板中按1∶2的体积稀释待检血清样品（100 ?L样品稀释液中加 50 ?L待检血清样品）；
（3）对照稀释：在血清稀释板中按1∶2分别稀释阳性对照和阴性对照（100 ?L样品稀释液中加50 ?L对照血清）；
（4）取抗原包被板（根据样品多少，可拆开分多次使用），分别将稀释好的待检血清样品和对照血清各取100 ?L加入到抗原包被板孔中。同时设2孔阴性对照、2孔阳性对照，轻轻混匀孔中样品（勿溢出），置37 ℃下孵育90 min；
（5）弃去孔中的液体，每孔加入200 ?L洗涤液，每次静置3 min，弃去洗涤液，并在吸水纸上拍干，共计洗板5次；
（6）每孔加酶标记物100 ?L，置37 ℃下孵育20 min，洗涤5次；
（7）每孔加底物液A和底物液B各1滴（约 50 ?L），混匀，室温（20 ℃～25 ℃）避光显色 15 min；
（8）每孔加终止液1滴（约50 ?L），混匀后10 min内测定结果。
结果判定：在酶标仪上测各孔OD630值。试验成立的条件是阴性对照孔平均OD630值与阳性对照平均OD630值之差≥0.3；确定样品OD630≥0.45时，判定为阳性，OD630<0.45时，判定为阴性。
猪伪狂犬病gE抗体、猪瘟病毒抗体和猪繁殖与呼吸综合征抗体的检测均按试剂盒说明书进行。
2 结果
2.1 不同猪场的PCV2抗体检测结果
对2013年～2015年采自鄂西山区20个猪场的1 260份血清样品进行PCV2抗体检测，结果发现所有被检猪场均存在PCV2感染，猪场的抗体阳性率为100 %（20/20），全部猪的PCV2抗体平均阳性率为56.75 %（715/1 260），其中PCV2抗体阳性率最高的达77.97 %（46/59），最低的为35 %（21/60），见表1。 2.2 不同猪群的PCV2抗体检测结果
不同猪群的PCV2抗体阳性率检测结果表明，公猪的阳性率为20 %（4/20），母猪为21.67 %（26/120），育肥猪为53.46 %（139/260），保育猪为66.67 %（204/306），哺乳仔猪为61.73 %（342/554）（表2）。由此可知，鄂西山区保育猪和哺乳仔猪PCV2感染率较高，分别达66.67 %和61.73 %。
2.3 不同猪场的PRRSV抗体检测结果
对2013年～2015年采自鄂西山区20个猪场中未免疫PRRSV疫苗的11个猪场的710份血清进行了PRRSV抗体检测，结果发现所有被检猪场均存在PRRSV感染，猪场的抗体阳性率为 100 %（11/11），全部猪的PRRSV抗体平均阳性率为48.45 %（344/710），其中PRRSV抗体阳性率最高的达71.67 %（43/60），最低的为32.31 %（21/65），见表3。
2.4 不同猪场的PRV gE抗体检测结果
对2013年～2015年采自鄂西山区20个猪场的1 260份血清样品进行PRV gE抗体检测，结果发现20个被检猪场有13个猪场存在PRV野毒感染，猪场PRV野毒感染率达65 %（13/20）；全部猪的PRV gE抗体平均阳性率为23.73 %（299/1 260），其中PRV gE抗体阳性率最高的达48.28 %（28/58），见表4。
2.5 不同猪场的CSFV抗体检测结果
对2013年～2015年采自鄂西山区20个猪场的1 260份血清样品进行CSFV抗体检测，所检20个猪场均进行了CSFV疫苗的免疫，结果发现20个被检猪场CSFV抗体平均阳性率为71.35 %，其中CSFV抗体阳性率最高的达93.33 %（56/60），最低的仅有50 %（28/56），见表5。
3 讨论
近年来，我国部分地区动物流行病学监测结果显示，猪圆环病毒2型的感染率及其引起的猪圆环病毒病的暴发次数都有上升的趋势，且常与猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪瘟病毒（CSFV）等混合感染，表现出较高的病死率，给养猪业造成了严重的经济损失[8，9]。本研究中被检测猪场均存在PCV2感染，其抗体平均阳性率为56.75 %（715/1 260），比郎洪武等[10]报道的全国7个养猪大省42.9 %的阳性率高出近14个百分点，比赵东升[11]等报道的全国2002年～2007年PCV2血清抗体平均阳性率38.47 %高18.28个百分点，而比徐廷川[6]等报道的广东省2002年～2007年PCV2血清抗体平均阳性率61.91 %要低5.16个百分点，说明鄂西山区的PCV2感染已经非常普遍，这可能与近几年频繁到外地引种且引种时没有严格检测相关疫病，饲养管理水平低下等原因有关。
对于不同猪群PCV2的血清抗体检测结果表明，受检猪群哺乳仔猪、保育猪及育肥猪的PCV2感染阳性率较高，这与郎洪武等[10]、吴瑗等[12]报道的后备母猪、经产母猪和种公猪的PCV2感染阳性率较高有所不同。
近年来，随着养殖规模的不断壮大，在猪群中普遍存在PCV2、PRRSV及其他病原的感染的现象，对养猪业造成的危害也日益加剧[13]。本研究对所有20个猪场均进行了PRV gE抗体、CSFV抗体的检测，对其中未免疫PRRSV疫苗的11个猪场进行了PRRSV抗体检测，结果发现PCV2抗体感染率高的猪场PRRSV、PRV的感染率也相对较高，而CSFV的免疫抗体阳性率则相对较低，具有一定的相关性，这可能与PCV2感染后导致的免疫抑制有关。
PCV2能够破坏猪的免疫系统，造成免疫抑制，从而引起多种疾病混合感染的发生，另外还造成对疫苗的免疫失败或对治疗无应答的现象。因此，该病对猪的健康和养猪业健康可持续发展的威胁日益增大。本次检测的20个养殖场均未进行PCV2免疫，这应引起广大养殖场（户）和动物疫病防控部门的高度重视。
本研究通过对采自鄂西山区的猪血清样本进行PCV2感染抗体的检测及其他病原抗体的检测，系统分析了PCV2在猪群中的感染及流行情况，为进一步开展PCV2的诊断与防控研究提供了理论依据。
参考文献：（13篇，略）
关键词：PCV2；抗体；ELISA；混合感染
中图分类号：S855.3 文献标识码：A 文章编号：1001-0769（2016）10-0033-04
猪圆环病毒（Porcine Circovirus， PCV）在病毒分类上属于圆环病毒科（Circoviridae）圆环病毒属（Circovirus），是一种环状、无囊膜的单股DNA病毒[1]，包括猪圆环病毒1型（PCV1）和猪圆环病毒2型（PCV2）两个基因型，其中PCV1对猪无致病性，PCV2是严重危害全球养猪业的重要病原之一[2]。PCV2主要感染6～12周龄猪，临床表现为体质下降、消瘦、皮肤发白、腹泻、呼吸困难，有的猪有黄疸。PCV2感染一般不会直接引起猪的死亡，主要是引起猪体的免疫抑制[3，4]。由于PCV2能破坏猪体的免疫系统，造成免疫抑制，因而本病常与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪肺炎支原体、多杀性巴氏杆菌和链球菌等混合或继发感染[5]。PCV2及其相关联的猪病已在全世界范围内发生和流行，死亡率10 %～30 %不等。较严重的地区，猪场在暴发本病时死淘率高达40 %左右，其危害和造成的重大经济损失显而易见，现已被公认为世界重要的猪传染病[6，7]。
近年来，PCV2的发生呈上升趋势，其危害除自身引起的免疫抑制以外，还容易继发、并发其他一系列疾病，给我国乃至世界养猪业造成了巨大损失。为了解鄂西山区PCV2的感染及与其他疫病的混合感染情况，本研究利用ELISA方法对2013年～2015年间采自鄂西山区不同养殖场的1 260份猪血清进行了PCV2抗体检测，并对该猪瘟抗体、猪繁殖与呼吸综合征抗体及猪伪狂犬病抗体进行了检测，旨在了解鄂西山区PCV2的感染及其他疫病的感染与免疫情况，为鄂西山区PCV2的综合防控提供理论依据，为进一步促进鄂西山区养猪业的健康可持续发展提供技术支持。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 猪血清样本的收集
本研究于2013年～2015年间，在鄂西山区鄂西山区随机选择20个猪场（均未免疫商品化猪圆环病毒疫苗），按5 %的比例随机采集不同年龄段猪的血液样品。血液采自猪耳静脉或前腔静脉，分离血清，4 ℃保存备用或立即进行ELISA检测。
1.1.2 检测所用试剂盒
PCV2抗体检测试剂盒为本实验室利用原核表达的PCV2 cap蛋白作为抗原包被酶标板制备的试剂盒；猪伪狂犬病gE抗体检测试剂盒、猪瘟病毒抗体检测试剂盒、猪繁殖与呼吸综合征抗体检测试剂盒均为美国IDEXX公司产品，购于北京爱德士元亨生物科技有限公司。
1.2 检测方法
PCV2抗体检测按如下步骤进行：
（1）样品处理：将全血样品4 000 rpm离心 10 min，取上清备用；
（2）样品稀释：在血清稀释板中按1∶2的体积稀释待检血清样品（100 ?L样品稀释液中加 50 ?L待检血清样品）；
（3）对照稀释：在血清稀释板中按1∶2分别稀释阳性对照和阴性对照（100 ?L样品稀释液中加50 ?L对照血清）；
（4）取抗原包被板（根据样品多少，可拆开分多次使用），分别将稀释好的待检血清样品和对照血清各取100 ?L加入到抗原包被板孔中。同时设2孔阴性对照、2孔阳性对照，轻轻混匀孔中样品（勿溢出），置37 ℃下孵育90 min；
（5）弃去孔中的液体，每孔加入200 ?L洗涤液，每次静置3 min，弃去洗涤液，并在吸水纸上拍干，共计洗板5次；
（6）每孔加酶标记物100 ?L，置37 ℃下孵育20 min，洗涤5次；
（7）每孔加底物液A和底物液B各1滴（约 50 ?L），混匀，室温（20 ℃～25 ℃）避光显色 15 min；
（8）每孔加终止液1滴（约50 ?L），混匀后10 min内测定结果。
结果判定：在酶标仪上测各孔OD630值。试验成立的条件是阴性对照孔平均OD630值与阳性对照平均OD630值之差≥0.3；确定样品OD630≥0.45时，判定为阳性，OD630<0.45时，判定为阴性。
猪伪狂犬病gE抗体、猪瘟病毒抗体和猪繁殖与呼吸综合征抗体的检测均按试剂盒说明书进行。
2 结果
2.1 不同猪场的PCV2抗体检测结果
对2013年～2015年采自鄂西山区20个猪场的1 260份血清样品进行PCV2抗体检测，结果发现所有被检猪场均存在PCV2感染，猪场的抗体阳性率为100 %（20/20），全部猪的PCV2抗体平均阳性率为56.75 %（715/1 260），其中PCV2抗体阳性率最高的达77.97 %（46/59），最低的为35 %（21/60），见表1。 2.2 不同猪群的PCV2抗体检测结果
不同猪群的PCV2抗体阳性率检测结果表明，公猪的阳性率为20 %（4/20），母猪为21.67 %（26/120），育肥猪为53.46 %（139/260），保育猪为66.67 %（204/306），哺乳仔猪为61.73 %（342/554）（表2）。由此可知，鄂西山区保育猪和哺乳仔猪PCV2感染率较高，分别达66.67 %和61.73 %。
2.3 不同猪场的PRRSV抗体检测结果
对2013年～2015年采自鄂西山区20个猪场中未免疫PRRSV疫苗的11个猪场的710份血清进行了PRRSV抗体检测，结果发现所有被检猪场均存在PRRSV感染，猪场的抗体阳性率为 100 %（11/11），全部猪的PRRSV抗体平均阳性率为48.45 %（344/710），其中PRRSV抗体阳性率最高的达71.67 %（43/60），最低的为32.31 %（21/65），见表3。
2.4 不同猪场的PRV gE抗体检测结果
对2013年～2015年采自鄂西山区20个猪场的1 260份血清样品进行PRV gE抗体检测，结果发现20个被检猪场有13个猪场存在PRV野毒感染，猪场PRV野毒感染率达65 %（13/20）；全部猪的PRV gE抗体平均阳性率为23.73 %（299/1 260），其中PRV gE抗体阳性率最高的达48.28 %（28/58），见表4。
2.5 不同猪场的CSFV抗体检测结果
对2013年～2015年采自鄂西山区20个猪场的1 260份血清样品进行CSFV抗体检测，所检20个猪场均进行了CSFV疫苗的免疫，结果发现20个被检猪场CSFV抗体平均阳性率为71.35 %，其中CSFV抗体阳性率最高的达93.33 %（56/60），最低的仅有50 %（28/56），见表5。
3 讨论
近年来，我国部分地区动物流行病学监测结果显示，猪圆环病毒2型的感染率及其引起的猪圆环病毒病的暴发次数都有上升的趋势，且常与猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪瘟病毒（CSFV）等混合感染，表现出较高的病死率，给养猪业造成了严重的经济损失[8，9]。本研究中被检测猪场均存在PCV2感染，其抗体平均阳性率为56.75 %（715/1 260），比郎洪武等[10]报道的全国7个养猪大省42.9 %的阳性率高出近14个百分点，比赵东升[11]等报道的全国2002年～2007年PCV2血清抗体平均阳性率38.47 %高18.28个百分点，而比徐廷川[6]等报道的广东省2002年～2007年PCV2血清抗体平均阳性率61.91 %要低5.16个百分点，说明鄂西山区的PCV2感染已经非常普遍，这可能与近几年频繁到外地引种且引种时没有严格检测相关疫病，饲养管理水平低下等原因有关。
对于不同猪群PCV2的血清抗体检测结果表明，受检猪群哺乳仔猪、保育猪及育肥猪的PCV2感染阳性率较高，这与郎洪武等[10]、吴瑗等[12]报道的后备母猪、经产母猪和种公猪的PCV2感染阳性率较高有所不同。
近年来，随着养殖规模的不断壮大，在猪群中普遍存在PCV2、PRRSV及其他病原的感染的现象，对养猪业造成的危害也日益加剧[13]。本研究对所有20个猪场均进行了PRV gE抗体、CSFV抗体的检测，对其中未免疫PRRSV疫苗的11个猪场进行了PRRSV抗体检测，结果发现PCV2抗体感染率高的猪场PRRSV、PRV的感染率也相对较高，而CSFV的免疫抗体阳性率则相对较低，具有一定的相关性，这可能与PCV2感染后导致的免疫抑制有关。
PCV2能够破坏猪的免疫系统，造成免疫抑制，从而引起多种疾病混合感染的发生，另外还造成对疫苗的免疫失败或对治疗无应答的现象。因此，该病对猪的健康和养猪业健康可持续发展的威胁日益增大。本次检测的20个养殖场均未进行PCV2免疫，这应引起广大养殖场（户）和动物疫病防控部门的高度重视。
本研究通过对采自鄂西山区的猪血清样本进行PCV2感染抗体的检测及其他病原抗体的检测，系统分析了PCV2在猪群中的感染及流行情况，为进一步开展PCV2的诊断与防控研究提供了理论依据。
参考文献：（13篇，略）