论文部分内容阅读
摘要 以陆地棉“泗棉3号”为材料，研究了活性炭、植物凝胶和组培苗的嫁接对其茎尖培养的影响。结果表明：在凝固剂植物凝胶上生长的茎尖状况优于琼脂；活性炭显著地促进了茎尖成苗；嫁接显著提高了组培苗的成活率，优化了泗棉三号的茎尖培养体系。
关键词 泗棉3号 茎尖 植物凝胶
棉花是重要的经济作物，我国是世界上的主要产棉国家之一。随着我国棉花育种工作的进步，培育出来了很多适合我国栽培的品种，自二十世纪七十年代以来，以基因工程方法培育棉花新品种，如Bt抗虫棉花的培育品种，同时还结合生理育种、杂交育种等方式获得很多优良品种。
茎尖培养在种质资源保存、特异材料扩繁和杂种优势固定中起着十分重要的作用。利用这优点，可以建立茎尖分生组织和遗传转化结合的转化体系。棉花茎尖分生组织由分生能力很强的细胞组成，快速生长，能够长成完整植株。利用茎尖外植体作为转基因受体，可以避免用原生质体、愈伤组织等作基因受体时所遇到的植株再生频率低，再生植株后代易发生变异等障碍。
泗棉3号是江苏泗阳棉花原种场育出来的，具有高产、优质、抗病等优良特性。本文以此为材料，研究了活性炭、植物凝胶和组培苗的嫁接对其茎尖培养的影响，为泗棉3号的遗传改良，种质资源离体保存等提供技术参考。
1 材料与方法
1.1 实验材料
泗棉三号种子，购自江苏农科院明天种业公司。
泗棉3号是江苏省泗阳棉花原种场采用抗病棉品系新洋76-75作母本与优质高产品系泗阳791作父本进行配组杂交选择而育成的高产、优质、抗病棉花品种。1993年通过江苏省农作物品种审定并定名。1994年通过省农作物品种审定委员会审定。1995年被国家科委列入“国家级科技成果重点推广计划”，农业部列入“发展棉花生产专项基金项目”。1996年被国家科委和农业部联合评定为全国“八五”期间育成的10个重大农作物新品种之一，同年获得江苏省利技进步一等奖，1997年获国家科技成果转化一等奖。
泗棉3号植株高度中等，一般100厘米左右，株型疏朗呈塔形。叶片中等偏小，叶色偏淡，折褶明显，向光性强。叶片空间排列合理，层次清晰，冠层结构好，节间匀称，消光系数小，中下部叶层受光条件好，花蕾外露，通透性好。茎杆茸毛较多。果树上举，弹性较好，有效受光面积大，群体光能利用率高。铃型卵圆形，中等大小，铃壳薄，吐絮畅。
泗棉3号出苗较好，棉苗长势强，对肥水反应弹性较大，生殖生长势强，现蕾开花早，第一果枝生节位较低，开花、成铃、吐絮集中，结铃性强，衣分高，成熟早，霜前花率高。
泗棉3号丰产性突出。自育成以来，在省内外试验及大面积示范种植，均表现出良好的丰产性能，一般亩产80-100公斤，高产田块达125公斤以上。大面积丰产方，皮棉单产达150公斤。1994年在江西省都昌县万户乡唐美村种植2.6亩泗棉3号高产田，单产皮棉达204公斤，创长江流域皮棉单产量最高纪录。
泗棉3号纤维品质优。江苏省区试，纤维断长22.97千米，显著优于泗棉2号(21.09千米)，黄河流域区试鉴定：比强度20.9－麦克隆值4.6，达到国家“八五”攻关目标。
泗棉3号抗病虫性强。经中国棉花所植保室、陕西省棉花所、河北省植保所两年鉴定结果，平均枯萎病发病率为6.4％，病指为1.75，达高抗标准。抗棉铃虫性：经中国农科院植保所在地1993年抗性鉴定，泗棉3号蕾铃受害率仅8.8％，比美国抗棉铃虫对照品种“HG-BR-8”(蕾铃受害率15.32％)减退46.81％，抗性达I级高抗标准。抗蚜虫性：1996年经中国棉花所植保室鉴定，泗棉3号蚜害率对比照“非洲E40”(高抗)减退50.90％，达中抗标准。
泗棉3号适应性广。自育成以来，在省内各地种植均表现出较大的增产幅度。在江苏、安徽、江西、浙江、河南、湖南、湖北、山东、四川等省的不同棉区种植，均具有良好的适应性，并得以大面积推广应用。曾年推广面积连续两年超过1000万亩，是九十年代以来我国新育成的推广面积最大的棉花品种。至2000年累计超过5000万亩，新增社会经济效益逾50亿元。
泗棉3号是江苏省1982年以来皮棉产量首次超过泗棉2号的棉花高产品种，打破了泗棉2号皮棉产量在江苏省及长江流域区试中连年独占鳌头的局面。同时还将江苏省及长江流域抗病棉的产量水平提高到一个新的高度，改变了长期存在的高产品种不抗病或抗病品种不高产的现象，实现了棉花品种高产、抗病、抗虫兼优质相统一的目标，为我国棉花生产的发展作出了贡献。
1.2 方法
1.2.1 种子处理
一般棉花种子处理有八种方法：
1.2.1.1 晒种 晒种可杀死病菌，增强抗病能力打破棉种休眠，提高发芽率，并可提早出苗1～2天。晒种一般多在播种前20天左右进行。方法：选择晴天将精选好的棉种摊到芦席或土场上(摊放厚度3～5厘米)曝晒4～5天，每天翻动3～5次，晒至用手摇响即可。
1.2.1.2 温汤浸种 温汤浸种可杀死附着在种子外和潜伏在种子内部的病菌并起到催芽作用，同时兼有剔除未成熟种子和杀灭种子上害虫(主要是棉红铃虫)等作用。方法：将“三开一凉”60～65℃的温开水倒入缸内，放入晒选好的棉种(水和种子的比例是，搅拌均匀，浸闷30分钟后捞出晾至种毛微白即可催芽或拌药播种。为了保证缸内棉种上下受温一致，浸闷过程中隔1G钟要上下搅拌一次。温汤浸种催芽稍晾后，按浸种前3份干棉种加1份3％的呋喃丹微粒剂拌匀后再进行播种，将有效地控制苗期蚜虫危害。
1.2.1.3 多菌灵胶悬剂浸种 此法浸种对棉花炭疽病、立枯病防治效果好，对防治棉花枯、黄萎病也有一定作用。方法：40％多菌灵胶悬剂0～7公斤，兑水100公斤浸种50公斤，浸泡14小时后捞出播种。
1.2.1.4 硫酸脱绒+“402”温汤浸种此法可有效地防止枯、黄萎病发生和苗期病害，特别是外地引进的种子经此法处理后，其灭菌效果可达100％。
本实验采用硫酸脱绒法处理种子。选用硫酸脱绒后的种子，用75％的酒精洗1min，无菌水冲洗2～3次，再用20％的过氧化氢浸泡2h，然后无菌水冲洗3～4次，再放入充足的无菌水在28℃下泡24h，待露白后，换水在同样条件下泡24h。除去种皮，将种仁接种到只含1／2MS无机盐的固体培养基上，在黑暗、28℃条件下培养到子叶长出，再见光培养1～2d。
1.2.2 活性炭对茎尖的培养的影响将切好的茎尖转到下面几种浓度的活性炭(0.5g／L，10g／L，2.0g／L)的培养基中培养。在光照条件下培养，每天见光14h，光强均2000LX左右，培养温度 25±2℃，大概20天左右，统计生长情况确定哪种活性炭浓度吸收次生代谢产物效果更好，更加有利于茎尖培养成再生植株。
1.2.3 琼脂和植物凝胶(Phytagel)对茎尖的培养的影响
传统的凝固剂都是用琼脂(8g／L)作为凝固剂，这里用sigma公司生产的植物凝胶(2.2g／L)做一个对比实验，培养条件同1.2.2，大概20天左右，统计生长情况确定哪种作为凝固剂更加有利于茎尖培养成再生植株。
1.2.4 嫁接对植株成活的影响
试管苗移植于室外，常常先使试管苗生根，然后移栽于花盆。但棉花的试管苗成活率低，而且此步骤共约2个月，耗时较长。如果将试管苗嫁接于自然条件下的砧木上，不仅节省时间，而且避免与土壤(常常是蛭石)的直接接触而减少污染，提高移植的成活率。
2 结果与分析
2.1 不同浓度梯度的活性炭对茎尖再生的影响
活性炭能够吸收外植体切口渗出的酚类物质。三种浓度的活性炭中，浓度0.5g／L的活性炭处理下没有明显的促进作用，苗发育状态不好，与浓度1.0g／L处理下的苗存在一定的差异，浓度1.0g／L、2.0g／L处理下的茎尖发育的比较好，节间伸长情况良好，叶片比较绿，基本无褐化现象，株型和正常苗相似。可见其吸收次生代谢产物的效果最好。由于浓度2.0g／L的培养基比较影响对根的观察，而且1.0g／L已经达到了很好的效果，所以确定该组织培养中吸收次生代谢产物的最佳活性炭浓度是1.0g／L。
2.2 不同凝固剂对茎尖再生的影响
实验结果表明，以植物凝胶为凝固剂的培养基中植株再生情况良好，生长速度明显陕于琼脂培养基上，基本只需要15天左右就能成苗，叶片长势很好，茎节发育良好，褐化现象不明显，因此以后就以此为凝固剂，不仅缩短了实验周期而且提高了实验效果，同时我们可以看出在不加活性炭的条件下，用植物凝胶作为凝固剂，植株的褐化程度明显降低。所以植物凝胶可以取代琼脂作为该组织培养的凝固剂。
2.3 嫁接对成苗的影响
嫁接对再生植株的根系没有特殊要求，无根苗、褐根苗和一些畸形苗以及组织培养过程中产生的变异苗等均可用于嫁接。实验中削去砧木顶端，将嫁接苗对接，用塑料袋或地膜罩盖保湿。7d后解除石蜡膜和细绳，即可看到砧木和接穗已通过愈伤组织紧密地连结在一起，新的叶也已开始生长。
本实验嫁接成活率不是特别高，一般嫁接成活率可达到95％以上，嫁接时砧木与切口吻合不好，棉花苗龄过大，木质化，一些操作不规范等都会影响嫁接的成活率。
3 讨论
泗棉3号，具有农艺性状优良的特点，是长江中下游的主要推广品种，本实验以此为材料，研究了多种物质对其茎尖培养的影响。由于其次生代谢产物对茎尖再生的抑制，为了去除这些次生代谢物选择活性炭作为吸附剂，选择几个适宜的浓度，试验出最适合泗棉3号茎尖生长的浓度为0.1g／L。加入活性炭以后生长在培养基上的茎尖生长很好，根部没有发生褐化现象。
本实验采用了植株凝胶作为凝固剂，并且发现其处理下的茎尖不仅发育良好，而且周期很短，相比与琼脂作为凝固剂培养的周期大大缩短了，这样可以缩短组织培养的进程，同而且植物凝胶在实验的操作中还有更多的便利：琼脂里杂质较多，灭菌后可能会出现抑制物质。
由于直接炼苗移栽等定植方法成活率较低，缓苗时间较长，棉花属于木本植物，用此方法更困难。而嫁接能够极大地提高再生植株的定植成活率，更能缩短缓苗时间，为基因工程乃至其他生物技术能够顺利地应用于棉花遗传改良奠定了基础。
关键词 泗棉3号 茎尖 植物凝胶
棉花是重要的经济作物，我国是世界上的主要产棉国家之一。随着我国棉花育种工作的进步，培育出来了很多适合我国栽培的品种，自二十世纪七十年代以来，以基因工程方法培育棉花新品种，如Bt抗虫棉花的培育品种，同时还结合生理育种、杂交育种等方式获得很多优良品种。
茎尖培养在种质资源保存、特异材料扩繁和杂种优势固定中起着十分重要的作用。利用这优点，可以建立茎尖分生组织和遗传转化结合的转化体系。棉花茎尖分生组织由分生能力很强的细胞组成，快速生长，能够长成完整植株。利用茎尖外植体作为转基因受体，可以避免用原生质体、愈伤组织等作基因受体时所遇到的植株再生频率低，再生植株后代易发生变异等障碍。
泗棉3号是江苏泗阳棉花原种场育出来的，具有高产、优质、抗病等优良特性。本文以此为材料，研究了活性炭、植物凝胶和组培苗的嫁接对其茎尖培养的影响，为泗棉3号的遗传改良，种质资源离体保存等提供技术参考。
1 材料与方法
1.1 实验材料
泗棉三号种子，购自江苏农科院明天种业公司。
泗棉3号是江苏省泗阳棉花原种场采用抗病棉品系新洋76-75作母本与优质高产品系泗阳791作父本进行配组杂交选择而育成的高产、优质、抗病棉花品种。1993年通过江苏省农作物品种审定并定名。1994年通过省农作物品种审定委员会审定。1995年被国家科委列入“国家级科技成果重点推广计划”，农业部列入“发展棉花生产专项基金项目”。1996年被国家科委和农业部联合评定为全国“八五”期间育成的10个重大农作物新品种之一，同年获得江苏省利技进步一等奖，1997年获国家科技成果转化一等奖。
泗棉3号植株高度中等，一般100厘米左右，株型疏朗呈塔形。叶片中等偏小，叶色偏淡，折褶明显，向光性强。叶片空间排列合理，层次清晰，冠层结构好，节间匀称，消光系数小，中下部叶层受光条件好，花蕾外露，通透性好。茎杆茸毛较多。果树上举，弹性较好，有效受光面积大，群体光能利用率高。铃型卵圆形，中等大小，铃壳薄，吐絮畅。
泗棉3号出苗较好，棉苗长势强，对肥水反应弹性较大，生殖生长势强，现蕾开花早，第一果枝生节位较低，开花、成铃、吐絮集中，结铃性强，衣分高，成熟早，霜前花率高。
泗棉3号丰产性突出。自育成以来，在省内外试验及大面积示范种植，均表现出良好的丰产性能，一般亩产80-100公斤，高产田块达125公斤以上。大面积丰产方，皮棉单产达150公斤。1994年在江西省都昌县万户乡唐美村种植2.6亩泗棉3号高产田，单产皮棉达204公斤，创长江流域皮棉单产量最高纪录。
泗棉3号纤维品质优。江苏省区试，纤维断长22.97千米，显著优于泗棉2号(21.09千米)，黄河流域区试鉴定：比强度20.9－麦克隆值4.6，达到国家“八五”攻关目标。
泗棉3号抗病虫性强。经中国棉花所植保室、陕西省棉花所、河北省植保所两年鉴定结果，平均枯萎病发病率为6.4％，病指为1.75，达高抗标准。抗棉铃虫性：经中国农科院植保所在地1993年抗性鉴定，泗棉3号蕾铃受害率仅8.8％，比美国抗棉铃虫对照品种“HG-BR-8”(蕾铃受害率15.32％)减退46.81％，抗性达I级高抗标准。抗蚜虫性：1996年经中国棉花所植保室鉴定，泗棉3号蚜害率对比照“非洲E40”(高抗)减退50.90％，达中抗标准。
泗棉3号适应性广。自育成以来，在省内各地种植均表现出较大的增产幅度。在江苏、安徽、江西、浙江、河南、湖南、湖北、山东、四川等省的不同棉区种植，均具有良好的适应性，并得以大面积推广应用。曾年推广面积连续两年超过1000万亩，是九十年代以来我国新育成的推广面积最大的棉花品种。至2000年累计超过5000万亩，新增社会经济效益逾50亿元。
泗棉3号是江苏省1982年以来皮棉产量首次超过泗棉2号的棉花高产品种，打破了泗棉2号皮棉产量在江苏省及长江流域区试中连年独占鳌头的局面。同时还将江苏省及长江流域抗病棉的产量水平提高到一个新的高度，改变了长期存在的高产品种不抗病或抗病品种不高产的现象，实现了棉花品种高产、抗病、抗虫兼优质相统一的目标，为我国棉花生产的发展作出了贡献。
1.2 方法
1.2.1 种子处理
一般棉花种子处理有八种方法：
1.2.1.1 晒种 晒种可杀死病菌，增强抗病能力打破棉种休眠，提高发芽率，并可提早出苗1～2天。晒种一般多在播种前20天左右进行。方法：选择晴天将精选好的棉种摊到芦席或土场上(摊放厚度3～5厘米)曝晒4～5天，每天翻动3～5次，晒至用手摇响即可。
1.2.1.2 温汤浸种 温汤浸种可杀死附着在种子外和潜伏在种子内部的病菌并起到催芽作用，同时兼有剔除未成熟种子和杀灭种子上害虫(主要是棉红铃虫)等作用。方法：将“三开一凉”60～65℃的温开水倒入缸内，放入晒选好的棉种(水和种子的比例是，搅拌均匀，浸闷30分钟后捞出晾至种毛微白即可催芽或拌药播种。为了保证缸内棉种上下受温一致，浸闷过程中隔1G钟要上下搅拌一次。温汤浸种催芽稍晾后，按浸种前3份干棉种加1份3％的呋喃丹微粒剂拌匀后再进行播种，将有效地控制苗期蚜虫危害。
1.2.1.3 多菌灵胶悬剂浸种 此法浸种对棉花炭疽病、立枯病防治效果好，对防治棉花枯、黄萎病也有一定作用。方法：40％多菌灵胶悬剂0～7公斤，兑水100公斤浸种50公斤，浸泡14小时后捞出播种。
1.2.1.4 硫酸脱绒+“402”温汤浸种此法可有效地防止枯、黄萎病发生和苗期病害，特别是外地引进的种子经此法处理后，其灭菌效果可达100％。
本实验采用硫酸脱绒法处理种子。选用硫酸脱绒后的种子，用75％的酒精洗1min，无菌水冲洗2～3次，再用20％的过氧化氢浸泡2h，然后无菌水冲洗3～4次，再放入充足的无菌水在28℃下泡24h，待露白后，换水在同样条件下泡24h。除去种皮，将种仁接种到只含1／2MS无机盐的固体培养基上，在黑暗、28℃条件下培养到子叶长出，再见光培养1～2d。
1.2.2 活性炭对茎尖的培养的影响将切好的茎尖转到下面几种浓度的活性炭(0.5g／L，10g／L，2.0g／L)的培养基中培养。在光照条件下培养，每天见光14h，光强均2000LX左右，培养温度 25±2℃，大概20天左右，统计生长情况确定哪种活性炭浓度吸收次生代谢产物效果更好，更加有利于茎尖培养成再生植株。
1.2.3 琼脂和植物凝胶(Phytagel)对茎尖的培养的影响
传统的凝固剂都是用琼脂(8g／L)作为凝固剂，这里用sigma公司生产的植物凝胶(2.2g／L)做一个对比实验，培养条件同1.2.2，大概20天左右，统计生长情况确定哪种作为凝固剂更加有利于茎尖培养成再生植株。
1.2.4 嫁接对植株成活的影响
试管苗移植于室外，常常先使试管苗生根，然后移栽于花盆。但棉花的试管苗成活率低，而且此步骤共约2个月，耗时较长。如果将试管苗嫁接于自然条件下的砧木上，不仅节省时间，而且避免与土壤(常常是蛭石)的直接接触而减少污染，提高移植的成活率。
2 结果与分析
2.1 不同浓度梯度的活性炭对茎尖再生的影响
活性炭能够吸收外植体切口渗出的酚类物质。三种浓度的活性炭中，浓度0.5g／L的活性炭处理下没有明显的促进作用，苗发育状态不好，与浓度1.0g／L处理下的苗存在一定的差异，浓度1.0g／L、2.0g／L处理下的茎尖发育的比较好，节间伸长情况良好，叶片比较绿，基本无褐化现象，株型和正常苗相似。可见其吸收次生代谢产物的效果最好。由于浓度2.0g／L的培养基比较影响对根的观察，而且1.0g／L已经达到了很好的效果，所以确定该组织培养中吸收次生代谢产物的最佳活性炭浓度是1.0g／L。
2.2 不同凝固剂对茎尖再生的影响
实验结果表明，以植物凝胶为凝固剂的培养基中植株再生情况良好，生长速度明显陕于琼脂培养基上，基本只需要15天左右就能成苗，叶片长势很好，茎节发育良好，褐化现象不明显，因此以后就以此为凝固剂，不仅缩短了实验周期而且提高了实验效果，同时我们可以看出在不加活性炭的条件下，用植物凝胶作为凝固剂，植株的褐化程度明显降低。所以植物凝胶可以取代琼脂作为该组织培养的凝固剂。
2.3 嫁接对成苗的影响
嫁接对再生植株的根系没有特殊要求，无根苗、褐根苗和一些畸形苗以及组织培养过程中产生的变异苗等均可用于嫁接。实验中削去砧木顶端，将嫁接苗对接，用塑料袋或地膜罩盖保湿。7d后解除石蜡膜和细绳，即可看到砧木和接穗已通过愈伤组织紧密地连结在一起，新的叶也已开始生长。
本实验嫁接成活率不是特别高，一般嫁接成活率可达到95％以上，嫁接时砧木与切口吻合不好，棉花苗龄过大，木质化，一些操作不规范等都会影响嫁接的成活率。
3 讨论
泗棉3号，具有农艺性状优良的特点，是长江中下游的主要推广品种，本实验以此为材料，研究了多种物质对其茎尖培养的影响。由于其次生代谢产物对茎尖再生的抑制，为了去除这些次生代谢物选择活性炭作为吸附剂，选择几个适宜的浓度，试验出最适合泗棉3号茎尖生长的浓度为0.1g／L。加入活性炭以后生长在培养基上的茎尖生长很好，根部没有发生褐化现象。
本实验采用了植株凝胶作为凝固剂，并且发现其处理下的茎尖不仅发育良好，而且周期很短，相比与琼脂作为凝固剂培养的周期大大缩短了，这样可以缩短组织培养的进程，同而且植物凝胶在实验的操作中还有更多的便利：琼脂里杂质较多，灭菌后可能会出现抑制物质。
由于直接炼苗移栽等定植方法成活率较低，缓苗时间较长，棉花属于木本植物，用此方法更困难。而嫁接能够极大地提高再生植株的定植成活率，更能缩短缓苗时间，为基因工程乃至其他生物技术能够顺利地应用于棉花遗传改良奠定了基础。