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摘 要：甘肃某养鸡场饲养的鸡群突然发病，经流行病学调查和病理解剖观察，初步分析诊断为鸡新城疫。然后采集病死鸡脑组织，提取总RNA，针对新城疫F基因全序列设计引物，进行RT-PCR诊断，结果为新城疫阳性，对F0位点的氨基酸序列分析，符合新城疫强毒序列特点，确定鸡场为新城疫感染。
关键词：鸡新城疫；诊断；RT-PCR
中图分类号：S855 文献标识码：A 文章编号：1001-0769（2014）12-0054-02
鸡新城疫（Newcastle Disease，ND）又称亚洲鸡瘟或伪鸡瘟，是由新城疫病毒引起的一种急性病毒性传染病。剖检特征为败血症变化、消化道黏膜出血和溃疡。死亡率高，对养鸡业危害严重。本病首先发现于印度尼西亚，不久又在英国新城发现，世界各国均有流行记载。有强毒株和弱毒株两类。病毒分为低毒力型（即缓发型）、中等毒力型（即中发型）和强毒力型（即速发型）三型。多数高强度毒力株常属嗜内脏型新城疫病毒。鸡科动物都可患本病。家鸡最易感，雏鸡比成年鸡易感性更高。珠鸡、火鸡、雉、孔雀也能感染。鸭、鹅对本病有抵抗力。哺乳动物对本病有强大抵抗力，但人偶有感染而患结膜炎。健康鸡与病鸡（包括隐形感染和潜伏期的鸡）接触是本病传播的主要途径。病毒可通过口腔、鼻、眼结膜和泄殖腔等部黏膜及皮肤创伤侵入机体而感染，发病率和死亡率均较高。
2013年8月，甘肃某养鸡场饲养的鸡发病，根据临床症状并结合病理学检查结果，初步确定为新城疫，经采样实验室PCR诊断，确定为新城疫，现将结果报告如下。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 病料
甘肃某养鸡场的病死鸡。
1.1.2 器械、菌株及载体
常用剖解器械，E.coli DH5α菌株、BL21（DE3）菌购自天根生化科技有限公司，pMD-18T载体购自宝生物工程大连有限公司。PGEX-4T-1原核表达载体由中国农业科学院兰州兽医研究所惠赠。
1.1.3 试剂
T4 DNA连接酶、RNAiso Plus提取试剂、一步法反转录试剂盒、rTaq聚合酶、dNTP Mix、DNA Marker均购自大连宝生物工程有限公司，小型质粒提取试剂盒、DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒购自北京博大泰克公司，其他常规试剂均为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 疫情调查
按照流行病学调查方法，调查发病情况，发病后的表现，鸡群饲养管理状况，发病后的处理办法以及周边环境鸡场有无相应的疫情等。
1.2.2 病理检查
按照家禽尸体剖检技术进行病理学检查。
1.2.3 RT-PCR诊断
1.2.3.1 引物设计
根据GeneBank NDV-F的基因序列，利用DNASTAR软件设计两对引物用于扩增鸽Ⅰ型副粘病毒F基因，其中P1、P2用于RT-PCR扩增F基因，预期扩增大小为1 662 bp。
P1：5’-ATGGGCTCCAAACCTTCTAC-3’
P2：5’-TCATGCTCTTGTAGTGG-3’
1.2.3.2 RT-PCR扩增F基因
无菌采集四只病死鸡的脑组织，参照RNAiso Plus提取试剂说明书提取新城疫的RNA，以P1和P2为引物，按照PrimeScript? One Step RT-PCR Kit Ver.2试剂盒说明书进行RT-PCR扩增，PCR程序为：50 ℃30 min；94 ℃2 min；94 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃2 min，共30个循环；反应结束后，取PCR产物5 μL～10 μL于10 g/L琼脂糖凝胶中进行电泳检测。
1.2.3.3 F基因的克隆
将F基因PCR产物电泳切胶回收，取PCR产物4 μL，pMD-18T载体0.5 μL，Solution I4.5 μL，混匀，16 ℃连接4 h。连接产物热激转化DH5α感受态细菌，并在含有氨苄青霉素的LB培养基中培养，挑取阳性菌落进行PCR鉴定并测序。
2 结果
2.1 临床症状
个别鸡没有表现出明显的临床症状就突然死亡。大多数病鸡表现明显的临床症状，病初，病鸡精神萎靡、羽毛粗乱，垂头、双翅下垂、双眼微闭、似昏睡状；鸡冠和肉髯呈紫红色；以后出现水样腹泻、粪便呈黄绿色、常带有血液；体温升高到44 ℃、口渴、食欲减退或废绝；随着病情的发展，出现咳嗽、呼吸困难、鼻孔周围可见粘液性分泌物、常有伸颈和张口呼吸症状、并有喘鸣和尖叫声；口角也可见粘性分泌物，病鸡表现出摇头、张口和吞咽动作；嗉囊内充满液体内容物，倒提时常有大了量酸臭液体从口内流出；多于发病后1 d～2 d内死亡；耐过者常表现出神经症状，如四肢麻痹、共济失调、肌肉震颤、痉挛和转圈等。
2.2 病理剖检变化
个别突然死亡的病例，剖检往往见不到任何眼观病变，有时仅见浆膜下、腹膜、胸骨部浆膜、肠系膜附着处及呼吸道黏膜有少数针尖大出血点。
症状明显的病例主要表现为全身浆膜、黏膜及组织内均有出血点，以呼吸道和消化道最为明显。其中心外膜尤其冠状沟部、腺胃浆膜、软骨浆膜多呈喷洒状出血点，消化道黏膜从口腔到泄殖腔普遍有较严重的出血，多呈点状或弥漫性出血，脑膜有时也见出血点。
大多数鸡嗉囊充满酸臭的稀薄液体。
腺胃的特征变化是出血和溃疡。胃腔空虚，黏膜表面覆有多量透明或脓性粘液，腺胃乳头间黏膜上有小型点状出血，有的形成溃疡，隆起于黏膜表面，表面覆以米粒大的黄白色病灶，小溃疡表面覆有金黄色或褐色撒康样痂。
小肠除了黏膜有严重出血外，还可见大小不等的局灶性坏死和溃疡。切开肠管的病变部位，有明显的溃疡，表面呈白、灰、褐色样的结节样病变。大肠的大溃疡发生于盲肠扁桃体，特征是盲肠扁桃体出血及溃疡。两侧的盲肠病变相对称。从浆膜面便可看到该部肠壁呈纺锤形隆起，大如黄豆，黏膜深部的出血坏死灶也隐约可见。切开肠腔检查，其病变与小肠基本一致。直肠病变也比较明显，轻者通常呈卡他性炎症，黏膜肿胀充血，表面附有粘液。重者则有出血点和坏死灶。这种坏死灶与盲肠中的小坏死灶相仿，但有时也可相互融合成为较大溃疡。 鼻腔、喉头、气管和支气管中常蓄积多量污黄色黏液，喉头或气管黏膜见有小出血点。
2.3 RT-PCR检测
2.3.1 F基因的RT-PCR扩增
以提取的病死鸡脑组织总RNA为模板，以P1和P2为引物，PCR扩增后电泳检测，可见约1 662 bp的片段，与预期目的片段大小相符（图1）。
2.3.2 F基因的克隆与测序
将RT-PCR扩增的F基因与pMD-18T载体连接，转化DH5α感受态细胞，菌落PCR筛选阳性菌落提取质粒，将含F基因的重组质粒送上海英俊生物科技有限公司测序鉴定。测序结果表明：扩增的F基因的大小为1 662 bp，该片段与预期结果完全相符，为完整的F基因序列。对F基因112～117F0蛋白裂解位点的氨基酸序列进行分析，结果F0蛋白裂解位点的氨基酸序列组成为：112R-R-R-K-R-F117，与强毒株序列相符，表明鸡场为新城疫强毒株感染。
3 讨论
鸡新城疫的病理变化依病程经过不同而表现各异，可分为最急性型、急性型、亚急性型和慢性型，唯典型病变只见于急性型，其他各型缺乏特征病性变化。最急性型病例往往未及时发现症状就突然死亡，剖检往往见不到任何病变。急性新城疫剖检特征为败血症变化，消化道黏膜出血和溃疡。亚急性经过时，败血症变化和消化道变化很轻微甚至缺乏，常见头、颈、胸等部位的皮下和咽喉头周围的结缔组织水肿，以及纤维素性胸膜炎和心包炎。慢性经过的新城疫缺乏败血症变化和消化道变化，而中枢神经系统发生明显的非化脓性脑脊髓炎，临床上常呈现腿或翅膀麻痹、头颈歪斜等神经症状，有时发生支气管炎或支气管肺炎。临床上应注意新城疫与禽流感、鸡霍乱等疫病的鉴别诊断。鸡新城疫、禽流感和鸡霍乱都是急性传染病，临床症状和剖检变化方面有某些相似，急性新城疫不同于禽流感和鸡霍乱的最突出的特点在于消化道从口腔到泄殖腔黏膜都有出血，腺胃锥状突起的坏死灶和环状出血，肠粘膜有规律的大溃疡灶和无规律的小溃疡坏死灶，并伴有非化脓性脑脊髓炎；禽流感时表现为鸡冠、眼睑、肉髯水肿，边缘出现紫黑色坏死斑点，腿部鳞片有紫黑色出血斑，十二指肠及小肠黏膜有片状或条状出血，卵泡充出血，紫黑色，卵泡变形，破裂，卵黄液流入腹腔，导致卵黄性腹膜炎。鸡霍乱时肺脏往往有明显变化，如肺充血、水肿、纤维素性肺炎、胸膜腔和心包腔有浆液纤维性渗出物，肝有坏死点等变化。新城疫一般通过临床症状和剖检病变可作出初步诊断，单要确诊，则需要进一步的方法，对于新城疫的诊断方法目前大体可分为两种：血清学方法和分子生物学方法。在本起鸡场的疑似新城疫病例中，我们采集病死鸡的脑组织提取总RNA，根据F基因序列设计一对引物，用RT-PCR方法进行确诊，并把F基因进行克隆，测序。
新城疫病毒为副粘病毒科腮腺炎病毒属禽副粘病毒Ⅰ型的唯一成员，为有囊膜的负链RNA病毒，为单股负链RNA病毒，病毒离子含有六个基因编码6个主要结构蛋白，其中融合蛋白（F）和血凝素-神经氨酸酶（HN）构成囊膜外表面的纤突、是新城疫的功能性糖蛋白，在致病和免疫应答过程中起重要作用。尤其是F基因的遗传变异与新城疫的变异和流行密切相关，F基因是病毒毒力强弱和免疫原性的主要决定因素，是新城疫分子流行病学研究的首选基因。F蛋白裂解位点（112-117位的氨基酸）的氨基酸顺序是决定新城疫病毒毒力的关键。强毒株的切割顺序一般为112RQRK/RRF117；而弱毒株的通常为112GRK/QGRL117。这起鸡场感染的新城疫F蛋白裂解位点的氨基酸序列为：112R-R-R-K-R-F117，与强毒株序列相符。
新城疫的预防工作是一项综合性工程，饲养管理，防疫，消毒，免疫及检测五个环节缺一不可。不能单纯依赖疫苗来控制疾病。家强饲养管理和兽医卫生，注意饲料营养，减少应激，提高鸡群的整体健康水平，特别要加强全进全出的封闭式饲养制，提倡育雏、育成和成年鸡分场饲养方式。严格防疫消毒制度，杜绝强毒污染和入侵。建立科学的适合于本场的免疫程序，充分考虑母源抗体水平，疫苗种类及毒力，最佳剂量和接种途径，鸡种和年龄。坚持定期免疫检测，随时调整免疫计划，使鸡群始终保持有效的抗体水平。一旦发生非典型性鸡新城疫，应立即隔离和淘汰早期病鸡，全群紧急接种LoSota（Ⅳ系）活毒疫苗，必要时也可考虑注射Ⅰ系活毒疫苗。如果把Ⅳ系活苗与ND油乳剂灭活苗同时应用，效果更好。对发病鸡群投服多维和适当抗生素，可增加抵抗力，控制细菌感染。
关键词：鸡新城疫；诊断；RT-PCR
中图分类号：S855 文献标识码：A 文章编号：1001-0769（2014）12-0054-02
鸡新城疫（Newcastle Disease，ND）又称亚洲鸡瘟或伪鸡瘟，是由新城疫病毒引起的一种急性病毒性传染病。剖检特征为败血症变化、消化道黏膜出血和溃疡。死亡率高，对养鸡业危害严重。本病首先发现于印度尼西亚，不久又在英国新城发现，世界各国均有流行记载。有强毒株和弱毒株两类。病毒分为低毒力型（即缓发型）、中等毒力型（即中发型）和强毒力型（即速发型）三型。多数高强度毒力株常属嗜内脏型新城疫病毒。鸡科动物都可患本病。家鸡最易感，雏鸡比成年鸡易感性更高。珠鸡、火鸡、雉、孔雀也能感染。鸭、鹅对本病有抵抗力。哺乳动物对本病有强大抵抗力，但人偶有感染而患结膜炎。健康鸡与病鸡（包括隐形感染和潜伏期的鸡）接触是本病传播的主要途径。病毒可通过口腔、鼻、眼结膜和泄殖腔等部黏膜及皮肤创伤侵入机体而感染，发病率和死亡率均较高。
2013年8月，甘肃某养鸡场饲养的鸡发病，根据临床症状并结合病理学检查结果，初步确定为新城疫，经采样实验室PCR诊断，确定为新城疫，现将结果报告如下。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 病料
甘肃某养鸡场的病死鸡。
1.1.2 器械、菌株及载体
常用剖解器械，E.coli DH5α菌株、BL21（DE3）菌购自天根生化科技有限公司，pMD-18T载体购自宝生物工程大连有限公司。PGEX-4T-1原核表达载体由中国农业科学院兰州兽医研究所惠赠。
1.1.3 试剂
T4 DNA连接酶、RNAiso Plus提取试剂、一步法反转录试剂盒、rTaq聚合酶、dNTP Mix、DNA Marker均购自大连宝生物工程有限公司，小型质粒提取试剂盒、DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒购自北京博大泰克公司，其他常规试剂均为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 疫情调查
按照流行病学调查方法，调查发病情况，发病后的表现，鸡群饲养管理状况，发病后的处理办法以及周边环境鸡场有无相应的疫情等。
1.2.2 病理检查
按照家禽尸体剖检技术进行病理学检查。
1.2.3 RT-PCR诊断
1.2.3.1 引物设计
根据GeneBank NDV-F的基因序列，利用DNASTAR软件设计两对引物用于扩增鸽Ⅰ型副粘病毒F基因，其中P1、P2用于RT-PCR扩增F基因，预期扩增大小为1 662 bp。
P1：5’-ATGGGCTCCAAACCTTCTAC-3’
P2：5’-TCATGCTCTTGTAGTGG-3’
1.2.3.2 RT-PCR扩增F基因
无菌采集四只病死鸡的脑组织，参照RNAiso Plus提取试剂说明书提取新城疫的RNA，以P1和P2为引物，按照PrimeScript? One Step RT-PCR Kit Ver.2试剂盒说明书进行RT-PCR扩增，PCR程序为：50 ℃30 min；94 ℃2 min；94 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃2 min，共30个循环；反应结束后，取PCR产物5 μL～10 μL于10 g/L琼脂糖凝胶中进行电泳检测。
1.2.3.3 F基因的克隆
将F基因PCR产物电泳切胶回收，取PCR产物4 μL，pMD-18T载体0.5 μL，Solution I4.5 μL，混匀，16 ℃连接4 h。连接产物热激转化DH5α感受态细菌，并在含有氨苄青霉素的LB培养基中培养，挑取阳性菌落进行PCR鉴定并测序。
2 结果
2.1 临床症状
个别鸡没有表现出明显的临床症状就突然死亡。大多数病鸡表现明显的临床症状，病初，病鸡精神萎靡、羽毛粗乱，垂头、双翅下垂、双眼微闭、似昏睡状；鸡冠和肉髯呈紫红色；以后出现水样腹泻、粪便呈黄绿色、常带有血液；体温升高到44 ℃、口渴、食欲减退或废绝；随着病情的发展，出现咳嗽、呼吸困难、鼻孔周围可见粘液性分泌物、常有伸颈和张口呼吸症状、并有喘鸣和尖叫声；口角也可见粘性分泌物，病鸡表现出摇头、张口和吞咽动作；嗉囊内充满液体内容物，倒提时常有大了量酸臭液体从口内流出；多于发病后1 d～2 d内死亡；耐过者常表现出神经症状，如四肢麻痹、共济失调、肌肉震颤、痉挛和转圈等。
2.2 病理剖检变化
个别突然死亡的病例，剖检往往见不到任何眼观病变，有时仅见浆膜下、腹膜、胸骨部浆膜、肠系膜附着处及呼吸道黏膜有少数针尖大出血点。
症状明显的病例主要表现为全身浆膜、黏膜及组织内均有出血点，以呼吸道和消化道最为明显。其中心外膜尤其冠状沟部、腺胃浆膜、软骨浆膜多呈喷洒状出血点，消化道黏膜从口腔到泄殖腔普遍有较严重的出血，多呈点状或弥漫性出血，脑膜有时也见出血点。
大多数鸡嗉囊充满酸臭的稀薄液体。
腺胃的特征变化是出血和溃疡。胃腔空虚，黏膜表面覆有多量透明或脓性粘液，腺胃乳头间黏膜上有小型点状出血，有的形成溃疡，隆起于黏膜表面，表面覆以米粒大的黄白色病灶，小溃疡表面覆有金黄色或褐色撒康样痂。
小肠除了黏膜有严重出血外，还可见大小不等的局灶性坏死和溃疡。切开肠管的病变部位，有明显的溃疡，表面呈白、灰、褐色样的结节样病变。大肠的大溃疡发生于盲肠扁桃体，特征是盲肠扁桃体出血及溃疡。两侧的盲肠病变相对称。从浆膜面便可看到该部肠壁呈纺锤形隆起，大如黄豆，黏膜深部的出血坏死灶也隐约可见。切开肠腔检查，其病变与小肠基本一致。直肠病变也比较明显，轻者通常呈卡他性炎症，黏膜肿胀充血，表面附有粘液。重者则有出血点和坏死灶。这种坏死灶与盲肠中的小坏死灶相仿，但有时也可相互融合成为较大溃疡。 鼻腔、喉头、气管和支气管中常蓄积多量污黄色黏液，喉头或气管黏膜见有小出血点。
2.3 RT-PCR检测
2.3.1 F基因的RT-PCR扩增
以提取的病死鸡脑组织总RNA为模板，以P1和P2为引物，PCR扩增后电泳检测，可见约1 662 bp的片段，与预期目的片段大小相符（图1）。
2.3.2 F基因的克隆与测序
将RT-PCR扩增的F基因与pMD-18T载体连接，转化DH5α感受态细胞，菌落PCR筛选阳性菌落提取质粒，将含F基因的重组质粒送上海英俊生物科技有限公司测序鉴定。测序结果表明：扩增的F基因的大小为1 662 bp，该片段与预期结果完全相符，为完整的F基因序列。对F基因112～117F0蛋白裂解位点的氨基酸序列进行分析，结果F0蛋白裂解位点的氨基酸序列组成为：112R-R-R-K-R-F117，与强毒株序列相符，表明鸡场为新城疫强毒株感染。
3 讨论
鸡新城疫的病理变化依病程经过不同而表现各异，可分为最急性型、急性型、亚急性型和慢性型，唯典型病变只见于急性型，其他各型缺乏特征病性变化。最急性型病例往往未及时发现症状就突然死亡，剖检往往见不到任何病变。急性新城疫剖检特征为败血症变化，消化道黏膜出血和溃疡。亚急性经过时，败血症变化和消化道变化很轻微甚至缺乏，常见头、颈、胸等部位的皮下和咽喉头周围的结缔组织水肿，以及纤维素性胸膜炎和心包炎。慢性经过的新城疫缺乏败血症变化和消化道变化，而中枢神经系统发生明显的非化脓性脑脊髓炎，临床上常呈现腿或翅膀麻痹、头颈歪斜等神经症状，有时发生支气管炎或支气管肺炎。临床上应注意新城疫与禽流感、鸡霍乱等疫病的鉴别诊断。鸡新城疫、禽流感和鸡霍乱都是急性传染病，临床症状和剖检变化方面有某些相似，急性新城疫不同于禽流感和鸡霍乱的最突出的特点在于消化道从口腔到泄殖腔黏膜都有出血，腺胃锥状突起的坏死灶和环状出血，肠粘膜有规律的大溃疡灶和无规律的小溃疡坏死灶，并伴有非化脓性脑脊髓炎；禽流感时表现为鸡冠、眼睑、肉髯水肿，边缘出现紫黑色坏死斑点，腿部鳞片有紫黑色出血斑，十二指肠及小肠黏膜有片状或条状出血，卵泡充出血，紫黑色，卵泡变形，破裂，卵黄液流入腹腔，导致卵黄性腹膜炎。鸡霍乱时肺脏往往有明显变化，如肺充血、水肿、纤维素性肺炎、胸膜腔和心包腔有浆液纤维性渗出物，肝有坏死点等变化。新城疫一般通过临床症状和剖检病变可作出初步诊断，单要确诊，则需要进一步的方法，对于新城疫的诊断方法目前大体可分为两种：血清学方法和分子生物学方法。在本起鸡场的疑似新城疫病例中，我们采集病死鸡的脑组织提取总RNA，根据F基因序列设计一对引物，用RT-PCR方法进行确诊，并把F基因进行克隆，测序。
新城疫病毒为副粘病毒科腮腺炎病毒属禽副粘病毒Ⅰ型的唯一成员，为有囊膜的负链RNA病毒，为单股负链RNA病毒，病毒离子含有六个基因编码6个主要结构蛋白，其中融合蛋白（F）和血凝素-神经氨酸酶（HN）构成囊膜外表面的纤突、是新城疫的功能性糖蛋白，在致病和免疫应答过程中起重要作用。尤其是F基因的遗传变异与新城疫的变异和流行密切相关，F基因是病毒毒力强弱和免疫原性的主要决定因素，是新城疫分子流行病学研究的首选基因。F蛋白裂解位点（112-117位的氨基酸）的氨基酸顺序是决定新城疫病毒毒力的关键。强毒株的切割顺序一般为112RQRK/RRF117；而弱毒株的通常为112GRK/QGRL117。这起鸡场感染的新城疫F蛋白裂解位点的氨基酸序列为：112R-R-R-K-R-F117，与强毒株序列相符。
新城疫的预防工作是一项综合性工程，饲养管理，防疫，消毒，免疫及检测五个环节缺一不可。不能单纯依赖疫苗来控制疾病。家强饲养管理和兽医卫生，注意饲料营养，减少应激，提高鸡群的整体健康水平，特别要加强全进全出的封闭式饲养制，提倡育雏、育成和成年鸡分场饲养方式。严格防疫消毒制度，杜绝强毒污染和入侵。建立科学的适合于本场的免疫程序，充分考虑母源抗体水平，疫苗种类及毒力，最佳剂量和接种途径，鸡种和年龄。坚持定期免疫检测，随时调整免疫计划，使鸡群始终保持有效的抗体水平。一旦发生非典型性鸡新城疫，应立即隔离和淘汰早期病鸡，全群紧急接种LoSota（Ⅳ系）活毒疫苗，必要时也可考虑注射Ⅰ系活毒疫苗。如果把Ⅳ系活苗与ND油乳剂灭活苗同时应用，效果更好。对发病鸡群投服多维和适当抗生素，可增加抵抗力，控制细菌感染。